Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Herstellung von 3D-biogedruckten Kokulturen von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten vor. Dieses Kokulturmodell, das in einem Hydrogel-Gerüst im 96- oder 384-Well-Format erzeugt wurde, zeigt eine hohe Post-Print-Viabilität und ein Neuritenwachstum innerhalb von 7 Tagen und zeigt die Expression von Reifemarkern für beide Zelltypen.
Abstract
Damit ein Zellmodell für das Wirkstoff-Screening geeignet ist, muss das System die Anforderungen an Durchsatz und Homogenität erfüllen und gleichzeitig eine effiziente Entwicklungszeit haben. Viele veröffentlichte 3D-Modelle erfüllen diese Kriterien jedoch nicht. Dies schränkt daher ihren Nutzen in frühen Anwendungen in der Arzneimittelforschung ein. Dreidimensionaler (3D) Biodruck ist eine neuartige Technologie, die auf die Entwicklung von 3D-Modellen angewendet werden kann, um die Entwicklungszeit zu verkürzen, die Standardisierung zu erhöhen und den Durchsatz zu erhöhen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung von 3D-biogedruckten Kokulturmodellen von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten glutamatergen Neuronen und Astrozyten vor. Diese Kokulturen sind eingebettet in eine Hydrogel-Matrix aus bioaktiven Peptiden, extrazellulären Matrixproteinen (ECM) in voller Länge und mit einer physiologischen Steifigkeit von 1,1 kPa. Das Modell kann schnell in 96-Well- und 384-Well-Formaten etabliert werden und erzeugt eine durchschnittliche Post-Print-Viabilität von 72 %. Das Verhältnis von Astrozyten zu Neuronen in diesem Modell beträgt 1:1,5, was innerhalb des physiologischen Bereichs für das menschliche Gehirn liegt. Diese 3D-biogedruckten Zellpopulationen zeigen auch die Expression reifer neuronaler Zelltypmarker und das Wachstum von Neuriten- und Astrozytenprojektionen innerhalb von 7 Tagen nach der Kultur. Daher eignet sich dieses Modell für die Analyse mit Zellfarbstoffen und Immunfärbetechniken sowie für Neuritenauswuchs-Assays. Die Fähigkeit, diese physiologisch repräsentativen Modelle in großem Maßstab herzustellen, macht sie ideal für den Einsatz in Screening-Assays mit mittlerem bis hohem Durchsatz für neurowissenschaftliche Ziele.
Introduction
Die Erforschung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) in der Arzneimittelforschung wird ausgeweitet1. Für viele weit verbreitete ZNS-Erkrankungen wie Epilepsie, Schizophrenie und Alzheimer gibt es jedoch noch keine heilenden Behandlungen 2,3,4. Der Mangel an wirksamen Therapeutika bei ZNS-Erkrankungen kann zumindest teilweise auf einen Mangel an genauen In-vitro-Modellen des Gehirns zurückgeführt werden5. Dies hat zu einer translationalen Lücke zwischen aktuellen In-vitro-Modellen und In-vivo-Daten und einem daraus resultierenden Engpass in den Forschungsbemühungen geführt.
Angetrieben durch diese translationale Lücke hat die Entwicklung neuartiger 3D-Zellmodelle in den letzten Jahren deutlich zugenommen, darunter neuronale Organoide, Neurosphäroide und Gerüst-basierte Modelle6. Die 3D-Struktur dieser Modelle hilft bei der Rekapitulation der neuronalen Mikroumgebung, einschließlich biomechanischer Belastungen, Zell-Zell-Kontakte und der extrazellulären Matrix des Gehirns (EZM)7. Die Gehirn-EZM ist ein dynamisches Element der Neurophysiologie, das den Raum zwischen neuronalen Zelltypen einnimmt, einschließlich Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und der neurovaskulären Einheit7. Es hat sich gezeigt, dass die Rekapitulation der EZM des Gehirns die neuronale Morphologie und das neuronale Feuern beeinflusst, und viele komplexe 3D-Modelle des Gehirns haben die Ablagerung von EZM-Proteinen durch neuronale Zelltypengezeigt 8,9,10,11. Gerüstbasierte Modelle bestehen aus reifen neuronalen Kokulturen, die in einer porösen synthetischen oder biologischen Hydrogelmatrix suspendiert sind, die das Gehirn-ECMdarstellt 12. Im Gegensatz zu Organoid- und Sphäroidsystemen ermöglichen Gerüst-basierte 3D-Modelle die Anpassung der vorhandenen ECM-Proteine und haben den zusätzlichen Vorteil, dass die Hydrogelsteifigkeit so eingestellt werden kann, dass biomechanische Spannungen nachgeahmt werdenkönnen 13,14.
Obwohl eine überwältigende Mehrheit der neuronalen 3D-Modelle eine erhöhte Rekapitulation der Mikroumgebung des Gehirns zeigt, sind nicht alle Modelle für die Implementierung von Anwendungen in der Arzneimittelforschung gut geeignet15. Damit ein 3D-Modell in industrielle Prozesse implementiert werden kann, muss das System die Durchsatzanforderungen für Siebanwendungen erfüllen und eine relativ kurze Entwicklungszeit haben16. 3D-Bioprinting ist eine neuartige Technologie, die das Potenzial bietet, 3D-Gerüst-basierte neuronale Modelle mit schneller Entwicklungszeit, erhöhtem Durchsatz und höherer Präzision zu erstellen und gleichzeitig die durch menschliches Versagen verursachte Variabilität zu beseitigen17. Dieses Protokoll präsentiert ein 3D-Kokulturmodell von humanen iPSC-abgeleiteten glutamatergen Neuronen und Astrozyten in einem Hydrogel-Gerüst. Dieses Hydrogel-Gerüst enthält physiologisch repräsentative bioaktive Peptide (RGD, IKVAV, YIGSR) und ECM-Proteine in einer mimetischen biomechanischen Steifigkeit. Zu diesen EZM-Proteinen in voller Länge gehören Laminin-211 und Hyaluronsäure, die im menschlichen Kortex reichlich vorhanden sind, mit einer Steifigkeit von 1,1 kPa in Übereinstimmung mit In-vivo-Messungen 18. Dieses Modell wurde mit einem 3D-Biodrucker in einem 96-Well- oder 384-Well-Plattenformat erstellt, das für die Screening-Analyse mit bildgebenden Verfahren mit Zellfarbstoffen und Antikörpern sowie Neuriten-Auswuchsassays geeignet ist. Die Zellen zeigen innerhalb von 7 Tagen nach der Kultur eine Expression von Markern des neuronalen Zelltyps und das Wachstum von Neuriten- und astrozytären Projektionen. Daher wird dieses Protokoll die Methodik zur Entwicklung eines neuronalen 3D-Kokulturmodells mit hohem Durchsatz für den Einsatz in der Arzneimittelforschung vorstellen.
Abbildung 1: Illustrativer Überblick über die Methodik, die für den 3D-Biodruck von Kokulturen verwendet wird. Menschliche iPSC-abgeleitete Neuronen und Astrozyten werden mit Aktivator- und Biotintenlösungen kombiniert, die bioaktive Peptide enthalten, und werden mithilfe der Drop-on-Demand-Bioprinting-Technologie auf Hydrogel-Gerüste in 96-Well- oder 384-Well-Formaten biogedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
1. Bioprinting von 3D-Modellen
- Generieren von Plattenkarte und Druckdatei
- Generieren Sie vor der Modellgenerierung eine Plattenkarte, ein Protokoll und eine Druckdatei mit der Plattenkartensoftware. Öffnen Sie die Plattenmap-Software und wählen Sie die Option Zellen in 3D kultivieren .
- Wählen Sie den Modelltyp, der biogedruckt werden soll, aus den verfügbaren Optionen im Dropdown-Menü aus. Dieses Modell wurde in den Formaten Imaging Model und HTP Model validiert. Wählen Sie Imaging-Modell für 96-Well-Platten und HTP für 384-Well-Platten.
- Wählen Sie im Fenster " Matrixauswahl " das Hydrogel Px02.53 aus, das Laminin-211 und Hyaluronsäureproteine mit IKVAV-, RGD- und YIGSR-Peptiden enthält.
- Geben Sie im Pop-up-Fenster die Zelltypen als Glutamaterge Neuronen und Astrozyten ein und geben Sie die Zelldichte als 20 Millionen Zellen/ml ein.
- Verwenden Sie die Software, um die gewünschte Plattenkarte zu entwerfen, indem Sie Vertiefungen auf der Bildschirmplatte hervorheben. Fügen Sie mindestens 1 Zeile 2D-Steuerung auf Kunststoff in das Design ein. Die 2D-Kontrolle auf Kunststoffvertiefungen besteht aus Zellen, die ohne Hydrogelgerüst direkt in die Vertiefung abgeschieden werden. Beschichten Sie diese Vertiefungen gemäß Schritt 1.2.
- Stellen Sie sicher, dass das oben im Fenster aufgeführte Plattenmodell in das vorgesehene Plattenmodell geändert wird (siehe Materialtabelle).
- Laden Sie das Protokoll und die Druckdatei für die Plattenkarte über die Download-Schaltflächen herunter und speichern Sie sie auf dem mit dem Bioprinter verbundenen Computer.
- Beschichtung von 2D-Kontrollen auf Kunststoff-Wells
- Beschichten Sie mindestens 24 Stunden vor dem Druck die Vertiefungen für die 2D-Kontrollmodelle für Zelladhärenz und -wachstum. 3D-Modell-Wells benötigen keine Vorbeschichtung. Alle Prozesse sind, sofern nicht anders angegeben, in einer Biosicherheitswerkbank durchzuführen. Die Platten können bis zu 7 Tage vor dem Druck beschichtet und vorbereitet werden.
- Stellen Sie 50 ml 1x Boratpuffer her, indem Sie 2,5 ml 20x Borat-Stammlösung mit 47,5 ml sterilemdH2Overdünnen.
- Geben Sie 100 μl 50 % (w/v) Polyethylenimin (PEI) zu 50 ml 1x Boratpuffer, um eine 0,1 % (w/v) PEI-Lösung und einen sterilen Filter durch einen 0,22-μm-Filter zu erhalten.
- Geben Sie 0,1 % (w/v) PEI-Lösung in jede 2D-Kontrollvertiefung, wie in der in Schritt 1.1 generierten Plattenkarte angegeben. Fügen Sie 100 μl/Well hinzu, wenn Sie eine 96-Well-Platte verwenden, oder 25 μl/Well, wenn Sie eine 384-Well-Platte verwenden.
- Inkubieren Sie die Platte 2 h lang bei 37 °C, bevor Sie die 0,1%ige (w/v) PEI-Lösung ansaugen und die Vertiefungen 5x mit PBS spülen. Lassen Sie die Vertiefungen in der Biosicherheitswerkbank vollständig trocknen.
- Verdünnen Sie 100 μl 1 mg/ml Lamininlösung in 5 ml neurobasalem Medium. Geben Sie 100 μl in jede 2D-Kontrollvertiefung, wenn Sie eine 96-Well-Platte verwenden, oder 25 μl, wenn Sie eine 384-Well-Platte verwenden. 4 h bei 37 °C inkubieren.
- Wenn Sie Platten lagern, lassen Sie die Lamininlösung nach der Inkubation an Ort und Stelle und lagern Sie sie bei 4 °C. Die Platten vor Gebrauch 1 h bei 37 °C vorwärmen.
- 3D-Bioprinting von Kokulturmodellen
- Achten Sie bei der Verwendung des Biodruckers immer auf eine sterile Technik und wischen Sie Handschuhe, Kartuschen und Kulturplatten mit 70 % EtOH ab, bevor Sie sie in den Drucker einsetzen. Sofern nicht anders angegeben, führen Sie alle Vorgänge außerhalb des Bioprinters in einer Biosicherheitswerkbank durch.
- Schalten Sie den Kompressor für den Bioprinter ein und initialisieren Sie den Drucker, indem Sie in der Bioprinter-Software auf die Schaltfläche Initialisieren klicken. Sobald der Luftstrom im Drucker begonnen hat, wischen Sie die Oberflächen im Inneren des Druckers mit einem 70%igen EtOH-Tuch ab.
- Führen Sie am Tag des Drucks den geführten Greenlight-Prozess für den Start des Tages durch, um den korrekten Düsenstatus für den Drucklauf sicherzustellen (minimaler Düsenstatus 2A2B).
- Nehmen Sie eine Biodrucker-Kartusche aus der sterilen Verpackung, geben Sie 20 ml steriles dH2O in Fach A und geben Sie 6 ml sterilfiltriertes 70% EtOH in die Fächer B1-4. Setzen Sie die Kartusche in den linken Kartuschenhalter im Bioprinter ein und setzen Sie den Plattendeckel in den dafür vorgesehenen Deckelhalter.
- Wählen Sie die Schaltfläche Greenlighting auf dem Startbildschirm der Software und bestätigen Sie in der Software, dass sich die Kartusche im Bioprinter befindet und dass der Deckel entfernt wurde. Initiieren Sie den Greenlight-Prozess.
- Wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden, vergewissern Sie sich, dass weder von der linken noch von der rechten Nadel konsistente Tropfen zu sehen sind. Vergewissern Sie sich anschließend, wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden, dass Wasser in den Fächern B7 und B8 vorhanden ist.
- Nachdem der Bioprinter den Schritt der selbstgesteuerten grünen Beleuchtung abgeschlossen hat, legen Sie eine unbeschichtete, sterile 96-Well-Bodenplatte (getrennt von der beschichteten Platte für Bioprinting-Kokulturen) ein und setzen Sie diese neue Platte in den rechten Plattenhalterbereich des Bioprinters ein, wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden. Stellen Sie sicher, dass der Plattenhalter auf High Profile Plate eingestellt ist und der Deckel entfernt und in den dafür vorgesehenen Deckelhalter eingesetzt wird, bevor Sie mit dem nächsten Schritt beginnen.
- Der Bioprinter deponiert Wassertröpfchen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Platte aus dem Biodrucker und vergewissern Sie sich, dass in jeder Vertiefung der Platte Wassertröpfchen vorhanden sind.
- Entsorgen Sie die 96-Well-Platte, die für das Greenlighting verwendet wurde, und lassen Sie den Bioprinter den Greenlighting-Prozess abschließen. Nach Abschluss des Vorgangs zeigt die Software den Düsenstatus des Bioprinters an und bestätigt, dass der Bioprinter zum Drucken von Modellen bereit ist. Setzen Sie den Deckel auf die Druckpatrone und nehmen Sie ihn für die nächsten Schritte in die Biosicherheitswerkbank.
- Laden Sie mit der Bioprinter-Software die (in Schritt 1.1 erzeugte) Druckdatei über die Schaltfläche Drucklaufsoftware in die Software und öffnen Sie das Druckprotokoll pdf.
- Biotinte und Aktivatorflüssigkeiten, wie im Druckprotokoll angegeben, bei -20 °C entnehmen und 40 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auftauen. Für die Hydrogel-Matrix Px02.53 umfasst dies: 1x Fläschchen F32, 1x Fläschchen F3, 1x Fläschchen F261, 1x Fläschchen F299. Biotinte und Aktivatorflüssigkeiten nicht in Händen oder Wasserbädern auftauen.
- 50 ml des vollständigen Mediums mit Doxycyclin und ROCK-Inhibitor (Komplettmedium +DOX/ROCKi) (siehe Schritt 2.2) in die RT bringen, während Biotinte und Aktivatorflüssigkeiten auftauen.
- Sobald Biotinten und Aktivatoren aufgetaut sind, bereiten Sie die Druckpatrone gemäß den Anweisungen auf den letzten beiden Seiten des generierten Druckprotokolls vor. Die grünes Licht für die Druckerpatrone wird für die Modelldruckphasen wiederverwendet.
- Es ist sicherzustellen, dass 40 ml dH2O in Fach A1 und 8 ml 70 % EtOH in den Fächern B1 undB2vorhanden sind. 1,2 ml Aktivator F32 zu C1, 1,2 ml F3 zu C2 und 200 μl F261 zu C4 hinzufügen.
- Entnehmen Sie die PEI- und lamininbeschichtete Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in den Drucker in das rechte Plattenhalterfach. Entfernen Sie die Laminin-Medien-Lösung zu diesem Zeitpunkt nicht aus den Vertiefungen. Stellen Sie sicher, dass das Plattenhalterfach auf Low Profile Plate eingestellt ist und der Deckel abgenommen und in den Deckelhalter eingesetzt ist.
- Setzen Sie die Druckpatrone in den Bioprinter ein, stellen Sie sicher, dass der Deckel entfernt und in die Halterung eingesetzt wird, und starten Sie den Drucklauf in der Software, indem Sie die Schaltfläche Print Inert Base in der Bioprinter-Software auswählen.
- Während die inerte Base gedruckt wird, entnehmen Sie die Fläschchen mit glutamatergen Neuronen und Astrozyten aus dem Flüssigstickstofflager, tauen Sie sie auf und resuspendieren Sie sie gemäß den Anweisungen in Abschnitt 2.
- Sobald die Zellen aufgetaut sind und 8 ml des vollständigen Mediums +DOX/ROCKi zu jedem Zelltyp separat hinzugefügt wurden (wie in Abschnitt 2), zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten bei RT.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie beide Zelltypen separat in 1 ml vollständigem Medium +DOX/ROCKi.
- Fügen Sie 20 μl Zellsuspension zu 20 μl Trypanblau hinzu und mischen Sie sie vor dem Zählen der Zellen, um die lebensfähige Zellkonzentration pro ml für jeden Zelltyp zu bestimmen.
- Kombinieren Sie insgesamt 3 Millionen glutamaterge Neuronen mit 1 Million Astrozyten in einem 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie Medien hinzu, um ein Gesamtvolumen von 8 ml zu erhalten.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei RT.
- Saugen Sie so viel wie möglich vom Überstand ab, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Aktivatorflüssigkeit F299.
- Beachten Sie, dass die Aktivatorflüssigkeit viskos ist. Pipettieren Sie das Pellet nach oben und unten, um es vollständig zu resuspendieren. Die Zelltypen sind empfindlich; Minimieren Sie Scherungen und Blasen durch die Verwendung einer Pipettenspitze mit breitem Durchmesser und der umgekehrten Pipettiertechnik. Pipettieren Sie nicht mehr als 3 Mal fest nach oben und unten, um Zellverlust zu verhindern.
- Sobald die inerte Basisstufe mit dem Drucken fertig ist, legen Sie die Deckel auf die Kartusche und die Kulturplatte, nehmen Sie beides aus dem Biodrucker und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
- Geben Sie die 200 μl Zellsuspension in F299 in die Vertiefung C3 der Druckpatrone, setzen Sie die Patrone wieder in den Bioprinter ein, entfernen Sie den Deckel und setzen Sie ihn in den Deckelhalter ein. Setzen Sie die Kulturplatte noch nicht wieder ein.
- Initiieren Sie die Druckmodell-Phase des Drucklaufs. Während der Bioprinter Flüssigkeiten ansaugt, entfernen Sie die Laminin-Medienlösung aus den 2D-Kontrollvertiefungen der Platte und ersetzen Sie sie durch 150 μl vollständige Medien + DOX/ROCKi in jeder 2D-Kontrollvertiefung bei Verwendung einer 96-Well-Platte und 50 μl vollständige Medien +DOX/ROCKi bei Verwendung einer 384-Well-Platte.
- Nachdem die Flüssigkeiten grundiert wurden, setzen Sie die Bioprinting-Zielplatte in den Bioprinter ein, entfernen Sie den Deckel und setzen Sie ihn in den Deckelhalter ein.
- Beginnen Sie mit dem Bioprinter-Targeting-Prozess.
- Wenn Sie von der Bioprinting-Software dazu aufgefordert werden, entfernen Sie die Zielplatte vom Bioprinter.
- Wählen Sie mit der Anleitung aus, wo Tröpfchen auf der Platte beobachtet werden können. Setzen Sie die Zielplatte wieder in den Bioprinter ein und wiederholen Sie den Tröpfchendruck- und Auswahlvorgang.
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, entfernen Sie erneut die Zielplatte und ersetzen Sie sie dann durch die Zellkulturplatte (mit Medien in den 2D-Kontrollvertiefungen gemäß Schritt 1.3.25). Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Kulturplatte abgenommen und in die Halterung eingesetzt wird. Der Biodrucker beendet den Modelldruck.
- Sobald der Modelldruck abgeschlossen ist, befolgen Sie die Zellkulturmethoden in Abschnitt 2 (Schritt 2.8), um Medien in die Vertiefungen zu geben.
- Beginnen Sie mit der Reinigung des Biodruckers und entsorgen Sie nach Abschluss des Vorgangs die Kartuschen und die verbleibenden Flüssigkeiten gemäß den Laborprotokollen.
2. Zellkultur
- Die Modelle werden mit 1x Fläschchen glutamatergen Neuronen (>5 Millionen Zellen pro Fläschchen) und 1x Fläschchen mit Astrozyten (>1 Million Zellen pro Fläschchen) erstellt.
- Das Wasserbad auf 37 °C vorheizen.
- Transportieren Sie beide Fläschchen mit Zellen auf Trockeneis ins Labor und tauchen Sie sie sofort nach der Entnahme aus dem Trockeneis in ein Wasserbad. Beide Durchstechflaschen gleichzeitig auftauen.
- Nehmen Sie die Durchstechflaschen aus dem Wasserbad, wenn nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist. Dies dauert ca. 3 Minuten nach dem Eintauchen. Verwirbeln oder mischen Sie die Zellen nicht im Wasserbad.
- Besprühen Sie die Fläschchen mit 70% EtOH und überführen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
- Geben Sie 500 μl des vollständigen Mediums +DOX/ROCKi tropfenweise in jedes Fläschchen, bevor Sie jede Suspension in separate 15-ml-Röhrchen umfüllen.
- Füllen Sie die Medien in jedem Röhrchen auf 8 ml auf und fahren Sie mit den Bioprinting-Schritten gemäß Schritt 1.3 fort.
- Befolgen Sie die Bioprinting-Modelle (Schritt 1.3), fügen Sie sofort die vollständigen Medien +DOX/ROCKi zu allen 3D-Cokultur-Vertiefungen hinzu und legen Sie die Modelle bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator. Wenn Sie eine 96-Well-Platte verwenden, fügen Sie 150 μl Medien pro Well hinzu. Wenn Sie eine 384-Well-Platte verwenden, verwenden Sie 50 μl Medien pro Well.
- Für die ersten 48 Stunden der Kultur sind keine Medienwechsel erforderlich.
- Bei der Durchführung von Medienwechseln an 2D-Steuerungen und -Modellen sollte darauf geachtet werden, dass keine mechanischen Spannungen induziert werden, die 2D-Kulturen ablösen oder eine Verformung des Hydrogels verursachen könnten. Führen Sie die Medienaspiration und -zugabe langsam mit einer Mikropipette durch, die an der Seite des Wells nach unten zeigt.
- Führen Sie nach 48 Stunden einen 90%igen Medienwechsel in allen Vertiefungen durch und entfernen Sie ROCKi aus der Medienzusammensetzung (siehe Schritt 2.14).
- Führen Sie nach 96 Stunden einen weiteren Medienwechsel von 90 % auf allen Wells durch, um DOX aus der Medienzusammensetzung zu entfernen (siehe Schritt 2.14).
- Nach den beiden 90%-Medienwechseln bei 48 h und 96 h 50%-Medienwechsel alle 48 h durchführen, wobei 50 % der Medien abgesaugt und durch frische, vollständige Medien ersetzt werden
- Zusammensetzung der Medien:
- Komplettes Medium: Neurobasales Medium mit 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF.
- Komplettes Medium plus Doxycyclin (DOX): Neurobasales Medium mit 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml Neurotrophin-3 (NT3), 5 ng/μl brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und 1 μg/ml Doxycyclin.
- Komplettes Medium plus DOX/ROCK-Inhibitor (ROCKi): Neurobasales Medium mit 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/ml Doxycyclin und 10 μM ROCK-Inhibitor.
3. Analyse des Neuritenwachstums
- Platzieren Sie die Zellen in einem Lebendzellmikroskop für die Hellfeld-Bildgebung unmittelbar nach der Zugabe von Medien nach dem Bioprinting.
- Verwenden Sie eine Mikroskopsoftware, um die Bildgebung von Zellen mit 4-facher Vergrößerung in jeder Vertiefung, einschließlich 2D-Kontrollen, alle 12 Stunden für mindestens 7 Tage zu planen.
- Führen Sie alle 48 Stunden einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und setzen Sie die Zellen nach jedem Medienwechsel wieder in das Mikroskop ein.
- Exportieren Sie nach 7 Tagen Daten die Bilder aus der Software im .jpg Format
- Importieren Sie alle .jpg Bilder in die ImageJ-Software und konvertieren Sie die Dateien in das 8-Bit-Format. Laden Sie das NeuronJ-Plugin und verfolgen Sie das Neuritenwachstum in Bildern, einschließlich Verzweigungspunkten, mit dem Tracing-Tool.
- Verwenden Sie die von NeuronJ generierten Neuritenverfolgungsdaten, um das Neuritenwachstum im Laufe der Zeit darzustellen.
4. Analyse der Zellviabilität
- Zu jedem 24-Stunden-Zeitpunkt in der Kultur werden 3 oder mehr Vertiefungen für die Analyse der Zelllebensfähigkeit mit einem Lebend-/Totviabilitätskit gefärbt. Wiederholen Sie diesen Schritt zu 24-Stunden- oder 48-Stunden-Zeitpunkten für die Dauer der Studie.
- Bereiten Sie lebende/tote Reagenzmedien vor, indem Sie das Lebendzell-Reagenz (1x Calcein-AM) und das Reagenz toter Zellen (1x Ethidium-Homodimer-1) und 1x Lebendzell-Kernfärbung (Hoechst 33342) 30 min vor der Bildgebung in 10 ml reduziertem Serummedium ohne Phenolrot (Opti-MEM) suspendieren. Lassen Sie lebende/tote Reagenzmedien in RT gelangen. Lagern Sie lebende/tote Reagenzmedien aufgrund der Fluoreszenzbleiche vor direktem Licht schützen.
- Entfernen Sie Medien aus 3 Vertiefungen mit Zellmodellen/2D-Kontrollen, um Gelstörungen sorgfältig zu vermeiden. Waschen Sie die Zellmodelle einmal mit sterilem RT PBS. Geben Sie 100 μl lebendes/totes Reagenzmedium in jede Vertiefung für eine 96-Well-Platte oder 25 μl für eine 384-Well-Platte.
- Inkubieren Sie die Modelle für 30 min bei 37 °C und 5 % CO2.
- Nach der Inkubation sind die Modelle bereit für die Bildgebung. Führen Sie die Bildgebung auf jedem Standardmikroskop mit roten (647 nm, tote Zellen), grünen (488 nm, lebende Zellen) und blauen (405 nm, Kernfärbung) Anregungskanälen durch. Die besten Ergebnisse in 3D-Modellen erzielen Sie, wenn Sie Modelle mit einem konfokalen High-Content-Mikroskop abbilden und die Bildgebung mit einer Z-Stapel-Funktion bei 4-facher oder 10-facher Vergrößerung durchführen.
HINWEIS: In dieser Studie wurden Zellmodelle mit dem INCell Analyzer 6500HS (High-Content-Imaging-System) abgebildet und die Analyse mit Signals Image Artist (Bildanalyseplattform, siehe Schritt 4.7) durchgeführt. - Nach Abschluss der Bildgebung werden die Zellmodelle bei 37 °C und 5 % CO 2 in den Zellkultur-Inkubator zurückgeführt. Lassen Sie jedoch Zellmodelle, die für die Viabilitätsanalyse verwendet werden, aus weiteren Studien aus, da die Lebend-/Totreagenzmedien die Langzeitlebensfähigkeit beeinflussen.
- Analyse von Bildern auf der Bildanalyseplattform
- Wählen Sie jede Ebene des Z-Stapel-Bildes in der Software aus. Kombinieren Sie Ebenenbilder als Projektionsbild mit maximaler Intensität.
- Erstellen Sie eine neue Analyse, indem Sie das biogedruckte Modell als Region of Interest (ROI) auswählen, indem Sie die Fluoreszenz aus dem lebenden Zellkanal bei 488 nm identifizieren (stellen Sie sicher, dass alle Zellen unter ROI ausgewählt werden).
- Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um innerhalb des interessierenden Bereichs die Anzahl der Zellen im ROI durch den Kernfärbekanal (405 nm), die Anzahl der lebenden Zellen im ROI unter Verwendung des 488-nm-Kanals und die Anzahl der toten Zellen im ROI unter Verwendung des 647-nm-Kanals zu identifizieren.
- Führen Sie die Analyse für alle behandelten Lebend-/Totzellen-Modellvertiefungen durch, und exportieren Sie die Datentabelle mit der ROI-Fläche, der Gesamtzahl der Zellen, der Anzahl der lebenden Zellen und der Anzahl der toten Zellen.
- Berechnen Sie die Anzahl der lebenden und toten Zellen als Prozentsatz der Gesamtzahl der Zellen pro Analysetag.
5. Immunfärbung und Zellpopulationsanalyse
- Entfernen Sie vor der Fixierung Medien von den Zellmodellen und waschen Sie die Modelle einmal in PBS.
- Fixieren Sie die Zellen mit 4% (v/v) Paraformaldehyd in PBS bei RT für 20 Minuten.
ACHTUNG: Alle Arbeiten mit Paraformaldehyd müssen nach Laborverfahren durchgeführt werden. - Saugen Sie 4% (v/v) Paraformaldehydlösung von den Modellen ab und waschen Sie die Modelle viermal in PBS, um Paraformaldehyd vollständig zu entfernen.
- Permeabilisieren Sie die Zellmodelle mit 0,2 % Triton-X für 30 min bei RT und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
- Blockieren Sie die Zellmodelle mit 10% (v/v) normalem Eselsserum (NDS) für 3 h bei RT.
- Entfernen Sie die blockierende Lösung und fügen Sie den Modellen Primärantikörper (verdünnt in 1 % v/v NDS in PBS) hinzu. Wenn Sie eine Analyse des Zellpopulationsverhältnisses durchführen (siehe Schritt 5.11), stellen Sie sicher, dass Sie Zellmodelle einschließen, die für B-III-Tubulin (mit roter AF647-Konjugation) und GFAP (mit grüner AF488-Konjugation) kogefärbt sind. Inkubieren Sie Modelle mit Primärantikörpern für 24 Stunden bei 4 °C.
- Nach der Primärinkubation werden die mit konjugierten Primärantikörpern gefärbten Modelle dreimal in PBS gewaschen und mit 20 μM Hoechst für 30 min gegengefärbt. Bild wie in Schritt 5.10 beschrieben.
- Waschen Sie die mit unkonjugierten Primärantikörpern gefärbten Modelle dreimal in PBS und fügen Sie Sekundärantikörper hinzu (verdünnt in 1% v/v NDS in PBS). 24 h bei 4 °C inkubieren.
- Sekundäre Antikörper durch dreimaliges Waschen in PBS entfernen und Modelle vor der Bildgebung 30 Minuten lang mit 20 μM Hoechst gegenfärben.
- Führen Sie die Bildgebung auf Standardmikroskopen mit roten (647 nm) und grünen (488 nm) Anregungskanälen durch. Die besten Ergebnisse in 3D-Modellen erzielen Sie jedoch, wenn Sie Modelle mit einem konfokalen High-Content-Mikroskop abbilden und die Bildgebung mit einer Z-Stapel-Funktion bei 4-facher oder 10-facher Vergrößerung durchführen.
- Analyse von Zellpopulationsverhältnissen auf der Bildanalyseplattform
- Analyse von Zellpopulationen unter Verwendung von Modellen, die für GFAP (mit AF488-Konjugation) und B-III-Tubulin (mit AF647-Konjugation) kogefärbt sind.
- Wählen Sie jede Ebene des Z-Stapelbildes in der Software aus und kombinieren Sie die Ebenenbilder zu einem Projektionsbild mit maximaler Intensität.
- Erstellen Sie eine neue Analyse, indem Sie das biogedruckte Modell als ROI auswählen, indem Sie die Fluoreszenz aus dem B-III-Tubulinkanal bei 647 nm identifizieren (stellen Sie sicher, dass der gesamte zellhaltige Bereich unter ROI ausgewählt ist).
- Verwenden Sie die Software, um innerhalb des ROI die Anzahl der Zellen im Hoechst-Kanal (405 nm), die Anzahl der GFAP+-Astrozyten im ROI unter Verwendung des 488-nm-Kanals und die Anzahl der Β-III-Tubulin+-Zellen im ROI unter Verwendung des 647-nm-Kanals zu identifizieren.
- Führen Sie die Analyse für alle kogefärbten Zellmodellvertiefungen durch und exportieren Sie die Datentabelle mit ROI-Fläche, Gesamtzellanzahl, Anzahl der GFAP+-Zellen und Anzahl der B-III-Tubulin+-Zellen.
- Berechnen Sie die Anzahl der GFAP+- und B-III-Tubulin+-Zellen als Prozentsatz der Gesamtzellzahl.
Representative Results
Analyse des Neuritenwachstums
In diesem Protokoll wurden iPSC-abgeleitete glutamaterge Neuronen und Astrozyten in Kokultur mit dem 3D-Biodrucker in eine Hydrogelmatrix biogedruckt. In den ersten 7 Tagen nach dem Druck wurden die Zellen alle 12 Stunden mit einem Lebendzellmikroskop abgebildet. Nach dem Bioprinting sollten die Zellen eine abgerundete Morphologie aufweisen und über die gesamte Hydrogelmatrix verteilt sein, wobei sie sich in den ersten Tagen der Kultur allmählich zu kleineren Zellclustern mit wenigen Ausstülpungen verändern (siehe Ergänzungsvideo 1 für repräsentatives gesundes Zellwachstum). Bis zum 4. Tag wandern gesunde Zellen durch das Gel und bilden größere Cluster, die durch Neuritenauswüchse miteinander verbunden sind. Bis zum 7. Tag sollten fast keine einzelnen Zellen mehr übrig sein, die miteinander verbundenen Bündel von Neuriten und astrozytären Projektionen sollten verstärkt erscheinen, und es sind viele kleinere Neuritenauswüchse zu sehen, die sich aus den Clustern bilden (Abbildung 2A). Unter Verwendung einer Reihe von Hellfeldbildern von lebenden Zellen, die während der 7-tägigen Wachstumsperiode aufgenommen wurden, wurde eine Analyse des Neuritenwachstums durchgeführt, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Diese Analyse zeigte, dass der Neuritenauswuchs zwischen 12 h und 156 h nahezu linear zunimmt (R2-Wert = 0,84) (Abbildung 2B). Während dieser Phase des Neuritenwachstums nehmen auch die Zellkörpercluster an Größe zu (siehe Zusatzvideo 1), was auf die Zellwanderung durch das Hydrogel hindurch hindurch hinweist.
Zelllebensfähigkeit und Populationsverhältnis
In diesem Protokoll wird eine Konzentration von 20 Millionen Zellen/ml, bestehend aus 15 Millionen Neuronen/ml und 5 Millionen Astrozyten/ml, für das Bioprinting der Zellmodelle verwendet. Mit Hilfe der Lebendzellfärbung mit Calcein-AM (lebende Zellen), Ethidium-Homodimer-1 (tote Zellen) und einer Kernfärbung kann die Anzahl der Zellen, die über einen Zeitraum von 7 Tagen überleben, gemäß Abschnitt 4 berechnet werden (Abbildung 3A). Die Ergebnisse der Zellviabilität für repräsentative Kulturen werden für Tag 4 gezeigt, an dem 72 % ± 1 % (mittlerer ± SEM) der Gesamtzellen lebend sind und eine Färbung für Calcein-AM zeigen, während 29 % ± 2 % (Mittelwert ± SEM) Gesamtzellen tot sind und eine Färbung mit Ethidium-Homodimer-1 aufweisen (Abbildung 3B). Repräsentative Bilder der Zellfärbung mit Calcein-AM und Ethidium-Homodimer-1 sind in der ergänzenden Abbildung 1 zu sehen. Es ist zu beachten, dass die Zellüberlebenswerte für 3D-Kulturen nicht direkt mit 2D-Kulturen verglichen werden können, da abgestorbene Zellen im Hydrogel zurückgehalten werden und während der Zellfütterungsprozesse nicht entfernt werden.
Mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung für B-III-Tubulin und GFAP, wie in Abschnitt 5 und in Abbildung 4 beschrieben, kann eine Bildanalyse durchgeführt werden, um das Zellpopulationsverhältnis zwischen Neuronen und Astrozyten zu bestimmen (Abbildung 3A). Von den Gesamtzellen pro Modell in repräsentativen Kulturen machen Β-III-Tubulin-positive Neuronen 49 % ± 3 % (mittlere ± SEM) aus, während GFAP-positive Astrozyten 30 % ± 4 % (mittlere ± SEM) ausmachen. Daraus ergibt sich ein Verhältnis von 1:1,5 von Astrozyten zu Neuronen. Übrig bleiben insgesamt 21 % Zellen pro Modell, die sich für keinen der beiden Zellmarker verfärben. Da die Zellviabilitätsanalyse zeigte, dass ein Mittelwert von 29% der Zellen an Tag 4 nicht lebensfähig ist, ist es wahrscheinlich, dass diese Zellen innerhalb des Hydrogels abgestorben sind.
Expression von Zellmarkern
Die Morphologie der biogedruckten Neuronen und Astrozyten wurde durch Immunfärbung auf neuronale Zelltypmarker (Β-III-Tubulin) und astrozytäre Marker (GFAP) untersucht. In den gezeigten repräsentativen Kulturen ist die Immunfärbung auf einzelne Zelltypen lokalisiert und zeigt eine gesunde Zellmorphologie, wobei beide Zelltypen Auswuchs von Zellausstülpungen aufweisen (Abbildung 4A,B). Da das Hydrogel und die Zellstrukturen dreidimensional sind, stellt jedes Bild nur einen Schnitt durch die Struktur in Abbildung 4A, B dar. Abbildung 4C zeigt einen zusammengefügten Stapel von Bildern im gesamten Hydrogel, der Ansichten der Zelllokalisierung in der X-, Y- und Z-Ebene zeigt. Abbildung 4D zeigt die Immunfärbung nur für B-III-Tubulin; Hervorhebung feinerer Neuritenauswüchse aus den Zellkörperclustern. Um den Phänotyp der glutamatergen Neuronen weiter zu untersuchen, kann eine Immunfärbung für den glutamatergen ionischen Rezeptormarker GluR2 durchgeführt werden. In Abbildung 4E wurde der Bereich 4E.1 (Einschub) hervorgehoben, um eine punktförmige Färbung mit höherer Auflösung entlang der Neuritenbündel zu zeigen. Dies bestätigt also, dass Neuronen in dieser Kokultur einen glutamatergen Phänotyp haben. Auf allen Immunfärbebildern können immunfluoreszenzgefärbte Nicht-Zellstrukturen beobachtet werden, die die Zellcluster und Neuriten umgeben. Es ist wahrscheinlich, dass diese Strukturen Trümmer darstellen, die in dem Hydrogel in Kombination mit geringen Mengen an unspezifischen Antikörpern zurückgehalten werden, die an das Hydrogel binden. Dies ist bei biogedruckten Kulturen zu erwarten, da in 3D-Gerüstmodellen abgestorbene Zellen und Trümmer während der Zellfütterung nicht entfernt werden. Ein repräsentatives Immunfärbebild der Negativkontrolle ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt, um die unspezifische Bindung von Sekundärantikörpern an Hydrogel zu demonstrieren.
Abbildung 2: Glutamaterge Neuronen und Astrozyten wurden mit dem Bioprinter in die Hydrogelmatrix biogedruckt und alle 12 h mit einem Hellfeldmikroskop abgebildet . (A) Beispiel für ein Hellfeldbild, das während der Analyse von Zellkulturen aufgenommen wurde. Das Bild stellt den Zeitpunkt 156 h dar, und der Maßstabsbalken stellt 400 μm dar. (B) Die durchschnittliche Länge der Neuritenauswüchse (μm) aus den Kulturen, die mit dem NeuronJ-Paket für ImageJ gemessen wurden. Jeder Datenpunkt besteht aus n = 3 Neuriten, und die Daten werden als Mittelwert ± REM angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Für das Bioprinting der Zellmodelle wurde eine Konzentration von 20 Millionen Zellen/ml Aktivatorlösung verwendet . (A) Die Zellviabilität wurde unter Verwendung von Lebend-/Totzellfarbstoffen (Calcein-AM bzw. Ethidium-Homodimer-1) berechnet. Die Werte zeigen, dass 72 % ± 1 % (Mittelwert ± SEM, n = 3) der gesamten Zellen pro Well lebend sind und 29 % ± 2 % (Mittelwert ± SEM, n = 3) der Zellen der gesamten Zellpopulation pro Well an Tag 4 tot sind. Die dargestellten Werte stellen den Mittelwert ± SEM dar. (B) Der prozentuale Anteil der Zellpopulationen an Neuronen und Astrozyten pro Vertiefung wurde durch Bildanalyse der in Abbildung 4 gezeigten Färbung berechnet. Neuronen repräsentieren den Prozentsatz der Zellen, die an Tag 7 positiv für Β-III-Tubulin gefärbt sind (49 % ± 3 %, Mittelwert ± SEM, n = 3), während Astrozyten den Prozentsatz der Zellen darstellen, die an Tag 7 positiv für GFAP gefärbt sind (30 % ± 4 %, Mittelwert ± SEM, n = 3). Die angezeigten Werte stellen den Mittelwert ± REM dar. Die gesamte Bildgebung für die in Abbildung 3 gezeigten Berechnungen wurde auf einem konfokalen Bildgebungssystem durchgeführt, und alle Analysen wurden auf der Bildanalyseplattform und dem GraphPad Prism gemäß den Methoden durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Expression von Markern des neuronalen Zelltyps in 3D-biogedruckten Kokulturen von glutamatergen Neuronen und Astrozyten an Tag 7 . (A,B) Immunfluoreszenzfärbung des neuronalen Markers Β-III-Tubulin und des Astrozytenmarkers GFAP, aufgenommen auf einer inversen Mikroskopplattform mit 10-facher Vergrößerung. Die Maßstabsbalken stellen 100 μm dar. (C) Immunfluoreszenzfärbung des neuronalen Markers β-III-Tubulin und des Astrozytenmarkers GFAP, kogefärbt mit Hoechst, dargestellt in der XYZ-Ebene, aufgenommen auf einem konfokalen Bildgebungssystem mit 10-facher Vergrößerung. Erstellt auf der Bildanalyse-Plattform. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. (D) Immunfluoreszenzfärbung des neuronalen Markers β-III-Tubulin, kogefärbt mit Hoechst, aufgenommen auf einem konfokalen Bildgebungssystem mit 20-facher Vergrößerung. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. (E) Immunfluoreszenzfärbung des glutamatergen Markers GluR2, kogefärbt mit Hoechst, aufgenommen auf einer inversen Mikroskopplattform mit 10-facher Vergrößerung. Kasten 3E.1 zeigt hervorgehobene Bereiche der GluR2-Färbung. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Video 1: Glutamaterge Neuronen und Astrozyten wurden mit dem Bioprinter in die Hydrogelmatrix biogedruckt und alle 12 h mit einem Hellfeldmikroskop abgebildet. Video von Hellfeldbildern, die während der Analyse von Zellkulturen aufgenommen wurden, Zeitpunkte sind in der unteren rechten Ecke angegeben, und Maßstabsbalken stellen 400 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Beispielbilder der Lebend/Tot-Analyse von biogedruckten Neuronen und Astrozyten an Tag 4. Die Calcein-AM-Färbung ist grün (488 nm) und die Ethidium-Homodimer-Färbung rot (647 nm) dargestellt. Das Bild wird in der XYZ-Ebenenansicht angezeigt, die auf der Bildanalyseplattform erstellt wurde. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. (A) Die Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Bildgebungssystem bei 4-facher Vergrößerung. (B) Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Bildgebungssystem bei 10-facher Vergrößerung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für ein Negativkontrollbild nach Immunfluoreszenzfärbung. Primärantikörper wurden weggelassen und grüne (488 nm) und rote (647 nm) Sekundärantikörper gemäß den Immunfärbeprotokollen verwendet. Das Bild wird in der XYZ-Ebenenansicht angezeigt, die auf der Bildanalyseplattform erstellt wurde. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. Die Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Bildgebungssystem bei 10-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Der Bedarf an genauen Modellen des ZNS war noch nie so hoch wie heute, und die Einschränkungen zweidimensionaler (2D) traditioneller Zellkulturmodelle haben in den letzten Jahren zu einer Generation komplexer ZNS-Modelle geführt19. Viele komplexe 3D-Modelle, die Interaktionen zwischen neuronalen Zelltypen und der EZM darstellen, weisen jedoch Einschränkungen auf, die die Anwendung dieser Modelle in industriellen Prozessen verhindern würden 6,20,21. In diesem Protokoll entwickeln wir ein 3D-Kokulturmodell von humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten, das darauf abzielt, einige dieser Einschränkungen mithilfe der 3D-Bioprinting-Technologie zu lösen, um ein bioaktives Hydrogel-Gerüst in 96-Well- und 384-Well-Formaten herzustellen.
Die Methodik für die Entwicklung dieser Modelle wurde durch die Plattenkarten-Designsoftware, automatisch generierte Druckprotokolle und den geführten Druckprozess des Biodruckers vereinfacht. Aufgrund der Empfindlichkeit der empfindlichen iPSC-abgeleiteten Zelltypen, die in diesem Protokoll verwendet werden, ist jedoch bei den folgenden kritischen Schritten beim Auftauen und bei der Kultur Vorsicht geboten. Erstens hat die Einbeziehung des ROCK-Inhibitors (ROCKi) mehrere Vorteile während des gesamten Bioprinting-Prozesses und während der frühen Kultur. Das Auftauen der Zellen ist ein kritischer Punkt, an dem die Neuronen eine Stressreaktion erfahren können, und unsachgemäße Auftauprotokolle können die Überlebenschancen verringern22. In der Regel wird empfohlen, Zellen aufzutauen, Medien hinzuzufügen und die Zellen so effizient wie möglich auf Inkubatortemperatur zu bringen23. Während des in diesem Protokoll beschriebenen Bioprinting-Prozesses ist es jedoch notwendig, dass Neuronen und Astrozyten in einer Aktivatorlösung anstelle von Medien resuspendiert werden und die Zellen bis zum Ende des Drucklaufs (bis zu 30 Minuten nach dem Auftauen) nicht über Raumtemperatur angehoben werden. Daher ist die Zugabe von ROCKi zu den Medien unmittelbar nach dem Auftauen und die Einbeziehung während der beiden Zentrifugationsschritte (Schritte 2.1-2.7 und 1.3.15-1.3.20) zwingend erforderlich, um die Zellstresswege zu hemmen, was zu niedrigeren Lebensfähigkeitsniveaus führenwürde 24. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ROCKi das Wachstum von Neuriten fördert und die neuronale Reifung verbessert25. Somit wird die ROCKi-Supplementierung für 48 Stunden nach dem Bioprinting fortgesetzt. Es ist jedoch zwingend erforderlich, die ROCKi-Supplementierung nach 48 h zu entfernen, um ein vollständiges Abwaschen während des nachfolgenden Medienwechsels zu gewährleisten, bevor die Zellen für den Assay verwendet werden.
Ein weiterer Schritt, der kritische Aufmerksamkeit erfordert, ist das Hinzufügen von Medien nach dem Druck und der Medienwechsel (Schritte 2.8-2.13). Das biogedruckte Hydrogel-Gerüst hat eine äquivalente biomechanische Steifigkeit von nur 1,1 kPa, was der grauen Substanz entspricht. Wie in Schritt 2.10 beschrieben, ist es wichtig, während der Medienzugabe und -aspiration vorsichtig in die Seite des Wells zu pipettieren, um Störungen zu vermeiden. Dies ist besonders relevant für 384-Well-Platten, bei denen der Gelspiegel einen höheren Anteil am Gesamtvolumen der Wells einnimmt. Diese Methode sollte auch in 2D-Kontrollwellen verwendet werden, um das Anheben von Kanten von Zellen und das Scheren von Neuritenauswüchsen zu verhindern. Die Autoren möchten auch die Bedeutung der sterilen Technik innerhalb des Bioprinters hervorheben, die mit der gleichen Vorsicht behandelt werden sollte wie eine Biosicherheitswerkbank, die für iPSC-abgeleitete Zellkulturen verwendet wird. Dazu gehören die sterile Filterung von 70 % EtOH und dH2O, die bei den Grünlicht- und Druckverfahren verwendet werden, das Halten der Deckel auf den Kartuschen und Platten, während die Hände in den Bioprinter hinein- und herausbewegt werden, und die Dekontamination von Oberflächen im Biodrucker mit 70%igen Ethanoltüchern vor und nach dem Druck.
Das biogedruckte Hydrogel-Gerüst, das aus Biotinten- und Aktivatorlösungen besteht und für die Entwicklung dieses Modells ausgewählt wurde, wurde aus einer Reihe von Biotinten und Aktivatorlösungen ausgewählt, die von Inventia Life Science für den Einsatz im RASTRUM-Biodrucker entwickelt wurden. Laminin und Hyaluronsäure wurden aufgrund ihrer Rolle bei der axonalen Führung, der Synapsenbildung und der Bildung des perineuronalen Netzes als Moleküle identifiziert, die für die iPSC-abgeleitete neuronale Reifung relevant sind26,27. Darüber hinaus wurde eine biomechanische Steifigkeit von 1,1 kPa gewählt, da Hydrogele mit geringerer Dichte nachweislich ein besseres Neuritenwachstum aus Neuronen ermöglichen12. Wenn Änderungen am Protokoll vorgenommen werden, indem Neuronen und Astrozyten verwendet werden, die intern oder von einem anderen kommerziellen Anbieter differenziert wurden, wird empfohlen, einen Matrixauswahltest durchzuführen, um das unterstützendste Hydrogel-Gerüstzu bestimmen 15. Darüber hinaus muss möglicherweise auch die Zelldichte optimiert werden, wenn Änderungen an den Zellquellen vorgenommen werden, um eine optimale Lebensfähigkeit zu gewährleisten und eine Überfüllung der Hydrogele zu verhindern. Für alle Modifikationen und Fehlerbehebungen im Zusammenhang mit der Bioprinter-Funktion empfehlen die Autoren, sich an die Hersteller zu wenden und auf Herstellerprotokolle zu verweisen.
Das ZNS enthält ein breites Spektrum an neuronalen Subtypen und Gliazellen, die alle in verschiedenen Hirnnischen existieren und spezifische Rollen spielen, die zur neuronalen Funktion beitragen28. Im Rahmen dieses breiten Umfangs repräsentiert dieses Modell nur die beiden am häufigsten vorkommenden Zelltypen (Astrozyten und exzitatorische glutamaterge Neuronen). Wichtige Zelltypen wie Mikroglia, Oligodendrozyten und Blut-Hirn-Schranken-bildende Endothelzellen werden in diesem System ausgelassen. Der Einschluss von Mikroglia könnte für Neuroimmuninteraktionen von Bedeutung sein, und Oligodendrozyten könnten bei Krankheiten, die die zentrale Myelinisierung betreffen, von Interesse sein. Zusätzlich zu ihrer Rolle in der Pathologie scheiden Zellen wie Endothelzellen, die die Blut-Hirn-Schranke bilden, arzneimittelmetabolisierende Enzyme aus, was die Verwendung dieses Modells für pharmakokinetische Assays beeinflussen könnte29. Eine weitere Einschränkung des Modells könnte das Verhältnis von Astrozyten zu Neuronen sein; Das Verhältnis von Astrozyten zu Neuronen variiert stark zwischen den Hirnregionen, wobei die empfohlenen Werte zwischen 1:1 und 1:3 liegen30,31. Dieses Modell hat ein ungefähres Verhältnis von 1:1,5 Astrozyten zu Neuronen; Daher ist dieses Modell möglicherweise nicht von Relevanz für das Modell von Gehirnbereichen, in denen Astrozyten häufiger vorhanden sind, wie z. B. in Bereichen der weißen Substanz30.
In den letzten Jahren wurden weitere Protokolle zur Entwicklung von 3D-biogedruckten Kokulturmodellen veröffentlicht. In einer Veröffentlichung von Sullivan et al. aus dem Jahr 2021 wurde ein 3D-biogedrucktes neuronales Modell mit iPSC-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen vorgestellt, das im Vergleich zu 2D-Kulturen eine hohe Lebensfähigkeit und Verbesserung der neuronalen Funktion nach dem Druck aufweist32. In diesem Protokoll wurden jedoch neurale Vorläuferzellen als Zellquelle verwendet und 4 Wochen lang in Kultur gehalten. In diesem Protokoll wurden kommerziell erhältliche glutamaterge Neuronen und Astrozyten aus iPSC verwendet. Auf diese Weise kann in nur 7 Tagen ein 3D-Netzwerk aus kokultivierten Zellen aufgebaut werden. Wie die Analyse des Neuritenwachstums zeigt, beginnt das Neuritenwachstum innerhalb von 24 Stunden und setzt sich während des gesamten Zeitraums von 156 Stunden, für den das Zellwachstum überwacht wurde, linear fort. Die schnelle Etablierung dieser Netzwerke kann zum Teil auf die Verwendung von glutamatergen Neuronen zurückgeführt werden, die eine optimierte Doxycyclin-induzierbare Genexpression von NGN2 verwenden, die die Expression reifer neuronaler Subtypmarker innerhalb von 7 Tagen zeigt, selbst in 2D-Kultur33. Die Verkürzung dieser Wachstumsperiode mit dieser Technik ist wichtig für die Implementierung von Modellen in der biopharmazeutischen Industrie, da die Assay-Entwicklung eine schnelle Abwicklung und Entwicklung von Zellmodellen erfordert15.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell Potenzial für ein 3D-Modell von Neuronen und Astrozyten aufweist, das schnell und bequem für Screening-Zwecke erstellt werden kann. Zukünftige Anwendungen für diesen Modelltyp könnten für die Arzneimittelforschung bei verschiedenen ZNS-Erkrankungen eingesetzt werden, mit der Möglichkeit, sie mit Hilfe von patienten- oder geneditierten iPSC-Linien auf verschiedene Krankheiten auszuweiten. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Doxycyclin-induzierbaren NGN2-Expressions-iPSC-abgeleiteten glutamatergen Neuronen den Zellen, die Reife in kürzerer Zeit zu erreichen, was für die Entwicklung von Modellen des alternden Gehirns für die Neurodegenerationsforschung genutzt werden kann. Dieses System könnte auch durch den Einsatz weiterer Zelltypen in der Kokultur, einschließlich Mikroglia und Oligodendrozyten, erweitert werden.
Disclosures
CW, NC und JB sind Mitarbeiter von Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, London, UK. YH ist Mitarbeiter von Merck Sharp & Dohme LLC, einer Tochtergesellschaft von Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Abbildung eins wurde mit Biorender.com erstellt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Alex Volkerling, Martin Engel und Rachel Bleach für ihre Unterstützung bei der Entwicklung des Protokolls und das Feedback zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 384-well plate | PerkinElmer | 6057300 | |
| 96-well plate | PerkinElmer | 6055300 | |
| Activator fluid F299 | Inventia Life Science | N/A | |
| Activator fluid F3 | Inventia Life Science | N/A | |
| B27 (50x) minus Vit A | Thermofisher | 12587010 | |
| Bioink fluid F261 | Inventia Life Science | N/A | |
| Bioink fluid F32 | Inventia Life Science | N/A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D5207 | |
| GlutaMAX (100x) | Thermofisher | 35050061 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Hoechst | Abcam | ab228551 | |
| Human BDNF Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7074 | |
| Human NT3 Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7036 | |
| iCell Astrocytes | Fujifilm CDI | 1434 | |
| INCell Analyser 6500HS | Molecular Devices | N/A | high content imaging system |
| Incucyte S3 | Sartorius | N/A | |
| ioGlutamatergic Neurons (Large vial) | Bit.bio | e001 | |
| Laminin (1 mg/mL) | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Neurobasal media | Thermofisher | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Abcam | ab7475 | |
| NucBlue Live (Hoechst 33342) | Thermofisher | R37605 | |
| Opti-MEM | Thermofisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PEI 50% in H2O | Sigma Aldrich | 181978 | |
| Pierce Borate Buffer 20x | Thermofisher | 28341 | |
| Prism | GraphPad | Data analysis software | |
| Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) | Abcam | ab206293 | |
| RASTRUM(TM) Bioprinter | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter |
| RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter Cartridges |
| RASTRUM(TM) Targeting plate | Inventia Life Science | N/A | Targeting plate |
| Rho kinase (ROCK) inhibitor | Abcam | ab120129 | |
| Sheep anti-GFAP NL493 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Signals Image Artist | PerkinElmer | N/A | Image analysis platform |
| Triton X-100 | Thermofisher | HFH10 | |
| Zeiss Axio Observer | Zeiss | N/A | Inverted microscope platform |
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