Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Scoring Centralnervesystemet betændelse, demyelinisering, og axon skade i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65738
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 3, 1, 1, 2, 2,4, 1,2,5
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Keenan Research Centre for Biomedical Science of St. Michael’s Hospital, 3Sickkids Research Institute, The Hospital for Sick Children, 4BARLO MS Centre, St. Michael’s Hospital, 5Women’s College Research Institute, Women’s College Hospital

Summary

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) fungerer som en dyremodel af multipel sklerose. Denne artikel beskriver en tilgang til scoring af rygmarvsbetændelse, demyelinering og aksonal skade i EAE. Derudover præsenteres en metode til kvantificering af opløselige neurofilamentlysniveauer i museserumet, hvilket letter vurderingen af aksonal skade hos levende mus.

Abstract

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en almindelig immunbaseret model af multipel sklerose (MS). Denne sygdom kan induceres hos gnavere ved aktiv immunisering med proteinkomponenter i myelinskeden og Complete Freunds adjuvans (CFA) eller ved overførsel af myelinspecifikke T-effektorceller fra gnavere primet med myelinprotein / CFA til naive gnavere. Sværhedsgraden af EAE scores typisk på en 5-punkts klinisk skala, der måler graden af stigende lammelse, men denne skala er ikke optimal til vurdering af omfanget af genopretning fra EAE. For eksempel forbliver kliniske scorer høje i nogle EAE-modeller (f.eks. Myelin oligodendrocytglycoprotein [MOG] peptidinduceret model af EAE) på trods af opløsningen af inflammation. Det er således vigtigt at supplere klinisk scoring med histologisk scoring af EAE, som også giver et middel til at studere de underliggende mekanismer for cellulær skade i centralnervesystemet (CNS).

Her præsenteres en simpel protokol til at forberede og plette rygmarvs- og hjernesektioner fra mus og til at score betændelse, demyelinering og aksonal skade i rygmarven. Metoden til scoring af leukocytinfiltration i rygmarven kan også anvendes til at score hjernebetændelse i EAE. Der beskrives også en protokol til måling af opløseligt neurofilamentlys (sNF-L) i serum hos mus ved hjælp af et SIMOA-assay (Small Molecule Assay), som giver feedback om omfanget af den samlede CNS-skade hos levende mus.

Introduction

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er den mest almindelige murinmodel for den humane demyeliniserende sygdom, multipel sklerose (MS)1. Klassisk MS-inflammatorisk patologi, herunder infiltration af IFN-γ (gamma) og IL-17-producerende T-hjælperceller2, infiltration af inflammatoriske monocytter3, dannelsen af perivaskulære og submeningeal inflammatoriske demyeliniserende læsioner4 og forekomsten af axonskade4 i centralnervesystemet (CNS), observeres også i EAE 5,6,7,8,9. Ligheden i immunmekanismer mellem EAE og MS har gjort EAE til en passende præklinisk model til test af effektiviteten og virkningsmekanismerne for en række godkendte immunbaserede terapier til MS, herunder natalizumab, fingolimod, dimethylfumarat og glatirameracetat (gennemgået i 1,5). Visse EAE-regimer modellerer andre aspekter af progressiv MS-patologi ud over aksonal skade, herunder udvikling af submeningeal inflammation i hjernen, kronisk demyelinisering, rygmarvsatrofi, synaps og neurontab 6,10,11,12. Således har EAE nytte til screening af effekten af neurobeskyttende terapier for MS.

EAE induceres hos gnavere på en række måder. Aktiv immunisering er den mest almindelige induktionsmetode og involverer immunisering af gnavere med myelinantigener (enten hele proteiner eller peptider) emulgeret i CFA suppleret med varmedræbt Mycobacterium tuberculosis13. Afhængigt af musens stamme administreres kighostetoksin (PTX) også på dag 0 og dag 2 af immunisering for at øge penetransen af sygdom13. EAE kan også induceres ved adoptivt at overføre myelinspecifikke T-celler opnået fra myelin/CFA-primede mus til raske mus14 eller kan udvikle sig spontant hos mus, der overudtrykker T-cellereceptorer, der er specifikke for de vigtigste myelinantigener5.

EAE sygdom sværhedsgrad og progression er almindeligt scoret ved hjælp af en diskret 5-punkts klinisk skala: 1 - hale halthed, 2 - bagben eller fodsvaghed, 3 - fuldstændig lammelse i en eller begge bagben, 4 - forben svaghed, 5 - døende eller død13. Dette kliniske scoringssystem er sundt til at dokumentere progressionen af stigende lammelse, der opstår ved sygdomsdebut, men er mindre følsomt til at fange omfanget af genopretning fra CNS-inflammatoriske angreb. For eksempel tildeles både mus, der ambulerer med vanskeligheder, og mus, der let ambulerer, men udviser fodgribende svaghed, en score på 2 på EAE-skalaen. Scores kan forblive høje i den post-akutte fase af EAE på grund af tilstedeværelsen af permanent axonskade eller tab, selv på trods af opløsningen af det inflammatoriske respons9. Der har været en række forsøg på at udvikle mere raffinerede scoringssystemer, adfærdstest, målinger af bagben og grebstyrke og infrarøde overvågningssystemer for bedre at fange forskelle i kliniske underskud i EAE 9,16,17,18; Disse mere indviklede scoringsforanstaltninger skelner imidlertid ikke bidraget fra inflammation versus vævsskade til de underliggende neurologiske underskud. Således er guldstandardmetoden til at score sværhedsgraden af EAE at udføre både klinisk og histologisk scoring.

Her beskrives en protokol for, hvordan man dissekerer og indlejrer musens rygmarv og hjerneprøver i paraffin på en måde, der fanger den stokastiske proces med læsionsdannelse, der forekommer i EAE. Der præsenteres også en protokol for, hvordan man pletter sektioner med Luxol fast blue (LFB), oprindeligt oprettet af Kluver og Barrera19, som registrerer myelin i CNS. Sektioner er enten farvet med LFB alene (til demyeliniseringsanalyse) eller er modfarvet med hæmatoxylin og eosin (H & E) for at hjælpe med at visualisere og score inflammatoriske læsioner. Der leveres også protokoller til kvantificering af tilstedeværelsen af samlede leukocytter (CD45), tabet af myelin og antallet af skadede axoner (SMI-32) i rygmarven ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer, immunohistokemiske (IHC) teknikker og offentligt tilgængelig software. Protokollen, der bruges til at kvantificere leukocytter i rygmarven, kan også anvendes til at kvantificere leukocytter i hjernen.

Histologisk evaluering af aksonalt tab og skade i hjernen er forholdsvis vanskeligere end i rygmarven, da hjernens hvide stofkanaler ikke løber parallelt med hinanden. Måling af serum neurofilament lys (sNF-L) har vist sig at være en lovende biomarkør for neuronal skade i MS20,21. Nylige undersøgelser har udvidet denne teknologi til EAE 22,23,24. Her præsenteres en metode til måling af serum neurofilament lys (sNF-L) i levende mus ved hjælp af et Small Molecule Assay (SIMOA) assay. Denne metode kræver kun en lille mængde serum og kan udføres i levende mus på bare en halv dag, hvilket giver hurtig feedback om, hvordan en testet terapi påvirker den samlede CNS-skade. Alle de metoder, der er beskrevet her, kan anvendes på mus af ethvert køn eller stamme.

Protocol

Alle eksperimenter udført med mus blev udført under dyrebrugsprotokoller godkendt af Unity Health Toronto Animal Care Committee efter retningslinjerne fra Canadian Council on Animal Care. Sørg for at bære en laboratoriefrakke, beskyttelseshandsker og briller under hele laboratorieprocedurerne.

1. Høst og fastgørelse af hjernen og rygmarven

  1. Aflive musen i henhold til institutionelle politikker. Læg musen udsat på et dissekeringsbord og halshug ved hjælp af kirurgisk saks (skære nedad).
  2. Brug Adson-tang (i ikke-dominerende hånd) til at tage fat i huden på toppen af musens hoved. Lav derefter et snit på 2,5 cm i huden på toppen af hovedet ved hjælp af kirurgisk saks.
  3. Brug fingrene til at skubbe huden på hovedet sideværts for at visualisere det underliggende kranium.
  4. Stabiliser musens hoved ved at gribe fat i øjenhulerne med standard Adson-tang.
  5. Brug en fin saks (dominerende hånd) til at lave små snips i kraniet langs midterlinjen fra livmoderhalsryggen til de olfaktoriske pærer.
    BEMÆRK: Indlejr kun et par millimeter saksespidser under kraniet ad gangen for at undgå at beskadige den underliggende hjerne.
  6. Brug Adson tang med tænder til at reflektere kraniet sideværts for at afsløre den underliggende hjerne.
  7. Hold hovedet ved hjælp af den ikke-dominerende hånd. Hold saks lukket (dominerende hånd), øse rygmarven ud fra livmoderhalsryggen og skubbe forsigtigt hjernen ud fra kraniet og klippe kraniale nerver.
  8. Placer hjernen i et konisk rør indeholdende 10 ml 10% neutralt bufret formalin, der er mærket med dyrets ID.
  9. Skær pelsen langs midterlinjen af musens torso fra nakke til hale.
  10. Brug fingrene til at skubbe huden sideværts for at visualisere rygsøjlen.
  11. Brug kirurgisk saks til at skære nedad gennem rygsøjlen på det niveau, hvor lårbenene fastgøres til hoften.
  12. Brug kirurgisk saks til at skære kropsvæggen på hver side af rygsøjlen fra hoften til nakken. Trim eventuelle vedhæftede organer væk.
  13. Placer rygsøjlen, der indeholder rygmarven i det samme rør af formalin, der indeholder hjernen. Lad hjernen og rygsøjlen fiksere i 5-7 dage.
    BEMÆRK: Tidspunktet for fiksering er vigtigt. Nogle antistoffer virker ikke, hvis vævet er overfikseret. Hvis væv er underfikseret, er det vanskeligt at ekstrudere rygmarven fra rygsøjlen i trin 2.

2. Brutto og behandling af rygmarven og hjernen

BEMÆRK: Følgende trin finder sted i en stinkhætte. Før du starter, skal du forberede 2 x 10 cm rene petriskåle, en Erlenmeyer-kolbe udstyret med en tragt foret med filterpapir, to skalpeller (en til skæring af ben og en til skæring af CNS-væv), linsepapir, en blyant, indlejringskassetter og prøveglas fyldt med 10% formalin.

  1. Brug en saks til at klippe et lille stykke linsepapir (samme bredde, men dobbelt så lang som kassetten) og læg det i en petriskål.
  2. Mærk en plastikkassette med prøve-id'et ved hjælp af en blyant.
  3. Hæld røret indeholdende den faste hjerne og rygsøjlen i tragten. Overfør rygsøjlen og hjernen til den tomme petriskål.
    BEMÆRK: Den brugte formalin filtreres igennem i Erlenmeyerkolben og kan genbruges i trin 2.13.
  4. Opdel hjernen groft i seks koronale stykker ved hjælp af en skalpel. Lav et snit kaudal til lillehjernen, en midt i lillehjernen, en bare rostral til lillehjernen og to snit i den resterende rostrale hjerne, hvilket skaber 3 yderligere koronale skiver af samme tykkelse.
  5. Brug pincet til at overføre hjerneprøver til den ene halvdel af linsepapiret i petriskålen.
  6. Skær rygmarven i tre stykker ved hjælp af skalpellen: Det første snit er lavet i bunden af ribbenburet, og det andet snit er lavet lige under krumningen i livmoderhalsryggen.
  7. Brug den samme skalpel til at trimme det sakrale rygsøjlestykke i den kaudale ende, indtil rygmarven kan visualiseres.
  8. Pick up thoracal rygsøjlen (ikke-dominerende hånd). Hold Adson tang med tænderne tæt lukket (dominerende hånd) og skub forsigtigt enden af tangen ind i den mindre åbning af rygsøjlen ved hjælp af en blid vridningsbevægelse. Ledningen skal komme ud fra den anden ende.
    BEMÆRK: Ethvert afrundet instrument, der er på størrelse med rygmarven, fungerer til dette formål. Hvis rygmarven ikke springer ud naturligt, må du ikke tvinge den. Brug i stedet en fin saks til at klippe knoglerne langs siden af rygsøjlen og reflektere den åben for at afsløre rygmarven. Alternativt kan du rette rygmarven og hjernen i et par ekstra dage i formalin; Den samme fikseringstid bør dog anvendes på alle prøver for at undgå at indføre variation i antistoffarvning.
  9. Hent standard Adson Tang (dominerende hånd). Stadig holder rygmarvsstykket med den mindre dominerende hånd, brug tang til forsigtigt at trække den fremkomne ledning ud af søjlen. Placer rygmarvsstykket i petriskålen, der indeholder linsepapiret.
  10. Gentag denne proces for lændehvirvelsøjlen / sakralsøjlestykkerne og livmoderhalssøjlestykkerne.
  11. Opdel de tre rygmarvsstykker (livmoderhals, thorax, lændehvirvel / sakral) i mindre tværsnitsstykker ved hjælp af en skalpel. Skær mindst 15 segmenter, som hver skal være mindre end 2 mm tykke.
    BEMÆRK: Sørg for, at segmenterne er kortere, end de er brede, hvilket får sektionerne til lettere at falde i tværsnit under indlejringsprocessen i trin 3.
  12. Anbring rygmarvsstykkerne på den samme halvdel af linsepapiret, der indeholder hjernestykker. Fold linsepapiret over for at sandwich vævsstykkerne og læg dette i den mærkede kassette.
    BEMÆRK: Linsepapiret forhindrer små stykker væv i at undslippe kassetten under behandlingen.
  13. Overfør kassetten til en prøveglas, der indeholder genanvendt eller frisk formalin.
  14. Gentag trin 2.1-2.13 for de resterende prøver.
  15. Efter 5-7 dages fiksering overføres kassetter fra prøvebeholderen til det første formalinbad i den automatiske vævsprocessor (se materialetabel). Vævsprocessoren køres natten over i henhold til programmet beskrevet i supplerende tabel 1. Prøver holdes i varm paraffinvoks indtil indlejring.

3. Indlejring og skæring af hjerne- og rygmarvssektioner

  1. Overfør kassetter fra processoren til det varme holdekammer på paraffinindlejringsstationen (se materialetabel).
  2. Rygmarv og hjernetværsnit fra hver mus indlejres i en enkelt paraffinblok på følgende måde (figur 1):
    1. Hæld først paraffinvoks bare for at dække bunden af formen. Brug fine pincet til at placere hjernens koronale og rygmarvstværsnitsstykker i paraffinen i bunden af formen.
    2. Overfør skimmelsvamp til køleoverfladen i flere sekunder for at fastgøre hjerne- og rygmarvsstykker på plads. Flyt formen tilbage til den opvarmede overflade og fyld den til toppen med varm paraffin.
    3. Placer kassettelåget (der er mærket med prøve-id) oven på formen. Hæld mere paraffin oven på kassettelåget. Overfør formen til kølestationen, så voksen kan hærde (afkøles i 30-60 min).
      BEMÆRK: Indlejring af rygmarvssektioner kræver øvelse. For at forbedre succesen skal du bruge kortere længder af rygmarven (<2 mm), da disse er mere tilbøjelige til at falde i tværsnit. Kirurgiske øjenloupes kan bæres for at hjælpe med at skelne, hvis rygmarvsstykker er i tværsnit.
    4. Monter paraffinblok på roterende mikrotom. Trim blok, indtil væv af interesse vises i paraffinsektion.
    5. Klip 5 μM bånd af sektioner af hver blok og overfør dem til et 42 °C vandbad.
    6. Saml sektioner på dias og placer dias i et glasstativ.
    7. Bages sektioner ved 37 °C i en tør ovn natten over. Cool dias, før du fortsætter med farvning.

4. De-paraffinisering og rehydrering af sektioner som forberedelse til farvning

BEMÆRK: Trin udføres i en stinkhætte. Før du starter, skal du forberede bade af opløsningsmidler. Forbered 5 L 1x PBS (1 L ddH2O, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 gNa2HPO4, 0,24 g KH2PO4; pH = 7,4) med 0,05% Tween-20 (PBS-T) til alle vasketrin.

  1. Afparaffiniser ved at placere dias i to på hinanden følgende bade af xylen eller et ikke-xylenbaseret opløsningsmiddel på en ryster i 5 minutter hver med let omrøring.
  2. Rehydrere væv ved at overføre dias gennem successive bade med faldende procentdele ethanol: 2 x 100% ethanol (5 min hver), 2 x 95% ethanol (3 min hver) og 1 x 70% ethanol (3 min). Hold 95% ethanol til LFB-farvning, og rehydrer til 70% ethanol, og hold PBS-T til immunhistokemi (IHC).

5. LFB til myelin med H&E

  1. Forbered en opløsning af 0,1% LFB (0,2 g LFB, se materialetabel, 200 ml 95% ethanol, 0,5 ml iseddike). Bland og filtrer i en Erlenmeyer-kolbe.  Opbevares i en mørk flaske indtil brug.
  2. Overfør sektioner fra 95% ethanol til et glasglidestativ, der placeres i en farvningsskål indeholdende LFB. Dæk fadet og forsegl med paraffinfilm for at forhindre fordampning.
  3. Inkuber sektioner ved 56 °C ovn natten over (maks. 16 timer).
  4. Den følgende morgen glider overførslen ind i et ddH2O-bad og holdes.
  5. I mellemtiden fremstilles (1) frisk 0,05% lithiumcarbonatopløsning (0,05 g lithiumcarbonat, 100 ml ddH2O); (2) Eosin Y-opløsning (tilsæt 2 g eosinsalt til 40 ml ddH20 og bland, indtil det er opløst, og bland derefter med 160 ml 95% ethanol).
    1. Forbered følgende bade: 1 x lithiumcarbonat, 3 x 70% ethanol, 3 x 95% ethanol, 2 x 100% ethanol, 3 x ddH20. Anbring badene i brugsorden (se supplerende tabel 2).
  6. Følg trinnene som beskrevet i supplerende tabel 2.
  7. Når diasene er tørre, visualiseres de demyeliniserende læsioner under mikroskopet.

6. LFB til myelin uden H&E

  1. Udfør denne farvningsprocedure til analyse af myelin.
    BEMÆRK: Proceduren er identisk med trin 5 (se tillægstabel 2), men har en forkortet arbejdsgang. Efter trin 4 skal du fortsætte proceduren fra trin 10.

7. Udtagning af antigen og dæmpning af peroxidase for immunhistokemiske (IHC) pletter

BEMÆRK: Før start fremstilles 100 ml hydrogenperoxid i methanol (1 del 30% hydrogenperoxidopløsning i 9 dele 100% methanol i en stinkhætte). Der fremstilles 1 liter 10 mM citratbuffer med Tween-20 (2,94 g trinatriumcitrat, opløst i 1 liter ddH20 i et bægerglas på omrøringsplade, pH bringes op på 6,0, og der tilsættes 500 μl Tween-20). Forbered PBS-T (se trin 4). Alle vaske udføres i bade af PBS-T med blid omrøring (på en ryster), medmindre andet er angivet.

  1. Sluk endogen peroxidase ved at placere dias i 3% hydrogenperoxid i methanol i 15 min (i en stinkhætte). Vask rutsjebaner to gange i PBS-T (2 min hver).
  2. Overfør dias til en metalglideholder og læg i 1 liter citratbuffer i en trykkoger. Forsegl låget, og tilsæt en gummiprop på toppen af dampudluftningen.
  3. Kog højt i mikrobølgeovnen, indtil den gule fane på trykkogeren dukker op, hvilket indikerer, at det maksimale tryk er nået. Kog i yderligere 5 minutter ved maksimalt tryk, og fjern derefter trykkogeren fra mikrobølgeovnen ved hjælp af beskyttelseshandsker.
  4. Tryk ned ved at fjerne proppen.  Fjern låget, og lad diasene køle af i citratbufferen i 20 minutter, og fortsæt derefter til den ønskede farvningsmetode.
    FORSIGTIG: Stå tilbage, når du frigiver dampen, da det kan forårsage en skoldningsskade.

8. CD45 immunhistokemi

BEMÆRK: Denne IHC-metode bruges til at visualisere infiltrerende leukocytter. Avidin/biotin-blokeringstrinnene kombineres med de blokerende og primære antistofinkubationstrin.

  1. Forbered blokerende buffer (2% BSA, 2% kaninserum i 1x PBS).
  2. Overfør glideglas til glasglidebakke og vask to gange med PBS-T (2 min hver). Forbered avidin/blokerende opløsning (4 dråber/ml avidin i 2% BSA/2% kaninserum i 1 x PBS, se materialetabel).
  3. Overskydende PBS-T omkring væv tørres af ved hjælp af laboratoriepapir. Brug en hydrofob pen til at tegne en cirkel rundt om vævet og placere glide i det fugtige kammer.
  4. Påfør avidin/blokeringsopløsning på hver sektion (400 μL/dias).
  5. Dæk fugtigt kammer og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.  I løbet af dette trin fremstilles anti-CD45-antistof (supplerende tabel 3) i blokerende buffer indeholdende biotin (4 dråber/ml biotin, 2% BSA/2% kaninserum i 1x PBS).
  6. Tryk blokeringsopløsningen fra glideren over på en fnugfri laboratorieserviet. Dup rundt om væv ved hjælp af en laboratorieserviet for at fjerne overskydende væske.
  7. Placer glideren tilbage i et fugtigt kammer. Tilsæt 400 μL CD45-antistofopløsning (se materialetabel) på afsnittet. Der inkuberes natten over ved 4 °C i et overdækket, fugtigt kammer.
  8. Den næste dag drænes det primære antistof og vaskes dias 3 x i PBS-T (5 min hver).
  9. Tørt område omkring sektionen ved hjælp af et fnugfrit laboratorium, og tilsæt derefter 400 μL sekundært antistof (1:200 fortynding i blokerende buffer) på hver sektion. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
  10. I mellemtiden fremstilles ABC-reagens (se materialetabel) ved at tilsætte 2 dråber reagens A til 5 ml 1x PBS og blandes. Tilsæt 2 dråber reagens B til den samme opløsning og bland (tilbered ~30 min før brug).
  11. Vask lysbillederne i 3 skift af 1x PBS-T (5 min hver) og placer diasene i et fugtigt kammer.
  12. Der tilsættes 400 μL ABC-reagens til sektioner. Dæk fugtigt kammer og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
  13. Vask lysbillederne i 3 skift af 1x PBS-T (5 min hver). I mellemtiden fremstilles en passende mængde DAB-opløsning i et foliedækket 15 ml centrifugerør i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
  14. Tag et dias og fokuser på en rygmarvssektion under et mikroskop. Tilføj 400 μL DAB til diaset og start lab timer.
  15. Visualiser sektionen, mens den udvikler sig, og stop timeren, når leukocytterne er brune. Overfør glideren til et ddH20 bad for at stoppe reaktionen. Hold i vand i 5 min. Den samme udviklingstid bruges til de resterende dias.
    FORSIGTIG: DAB er kræftfremkaldende. Bortskaf DAB-affald og post-DAB ddH2O som farligt affald.
  16. Counterstain glider med Mayers hæmatoxylin i ~4-10 min (se supplerende tabel 2). Skyl rutsjebaner under rindende postevand i 10 min.
  17. Dehydreres i 95% ethanol (1 x 3 min), efterfulgt af absolut 100% ethanol (2 x 3 min hver).
  18. Flyt ind i en stinkhætte, overfør diasene til xylen eller et xylenerstatningsopløsningsmiddel i 5 minutter. Coverslip med monteringsmedium, og lad gliderne tørre i 1-2 dage i stinkhætten.
    FORSIGTIG: Hvis du bruger xylen, skal du bruge dobbelthandsker og tang til at håndtere glider, når du dækker dig, da det er giftigt og kan opløse handsker.
  19. Rengør diasene med xylen og scan ved hjælp af en diasscanner ved 20 x forstørrelse.

9. SMI-32 IHC til aksonal skade

BEMÆRK: Denne protokol bruger et mus SMI-32-antistof, som reagerer mod ikke-phosphoryleret neurofilamenttungt, som kan akkumulere i skadede axoner25. Da dette antistof er blevet hævet i mus og detekterer et museantigen, anbefales det, at der anvendes et MOM-sæt (Mouse on Mouse). I denne procedure udføres avidin/biotinblokeringstrinnet som et separat trin fra den primære antistofinkubation. Før du starter denne protokol, skal du afparaffinisere, rehydrere, slukke endogen peroxidaseaktivitet og udføre antigenhentning som beskrevet i trin 4 og trin 7.

  1. Vask sektionerne to gange med 2 x PBS-T (2 min hver). Fjern ekstra væske omkring sektioner ved hjælp af et laboratorievæv og tegn en cirkel omkring væv ved hjælp af en hydrofob pen.
  2. Der tilsættes 400 μL blokerende buffer (2% (w/v) gedeserum i 1x PBS-T) med avidin (4 dråber/ml) til sektionerne. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
  3. Dyp diasene to gange i 1x PBS-T. Der tilsættes 400 μL blokerende buffer med biotin (4 dråber/ml) til objektglasset og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  4. Vask rutsjebanerne i et 1 x PBS-T bad i 2 min. I mellemtiden fremstilles MOM-blokerende reagens ved at tilsætte 2 dråber stamopløsning (se materialetabel) til 2,5 ml 1x PBS.
  5. Der tilsættes 400 μL MOM-reagens på sektionen. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  6. Vask rutsjebanerne to gange i et 1x PBS-T-bad i 2 min. I mellemtiden fremstilles MOM-fortyndingsmiddel ved at tilsætte 300 μL proteinkoncentratstamopløsning til 3,75 ml 1x PBS.
  7. Der tilsættes 400 μL MOM-fortyndingsmiddel og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden fortyndes SMI-32-antistoffet (se materialetabel) i MOM-fortyndingsmidlet.
  8. Tryk fortyndingsvæsken af dias, og tilsæt 400 μL SMI-32-antistofopløsning på sektionen. Dæk det fugtige kammer til og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
  9. Vask dias to gange i et 1x PBS-T-bad i 2 min, hver med let omrøring. I mellemtiden fortyndes MOM anti-mus IgG arbejdsreagens i fortyndingsmidlet (10 μL lager i 2,5 ml fortyndingsmiddel).
  10. Tilsæt 400 μL anti-mus IgG arbejdsreagens pr. dias. Inkuber i 10 min.
  11. Vask dias to gange i et 1x PBS-T-bad i 2 minutter hver. Fortsæt farvningen ved at følge trinnene beskrevet i CD45-farvningsprotokollen (trin 8.11 - 8.19).

10. LFB og H&E scoring for tilstedeværelsen af demyeliniserende læsioner

BEMÆRK: Følgende er en analysemetode, der kan anvendes til at få hurtig indsigt i sværhedsgraden af inflammatorisk demyelinisering. Denne analyse udføres i sektioner af ledningen, der er udtaget prøver på forskellige niveauer (livmoderhals, thorax og lændehvirvelsøjle, mindst 3 sektioner pr. / niveau). Se Allen Brain Atlas for Mouse rygmarv26 for at hjælpe med at identificere rygmarvens anatomiske niveau. Denne analyse kræver TIFF-filer. Hvis scannede billeder er i .czi-format, skal du følge instruktionerne i supplerende tabel 4 for at konvertere czi-filer til TIFF-filer.

  1. Åbn TIFF-billedet af den sektion, der skal analyseres, ved at trække og slippe filen i ImageJ. Overhold rygmarvssektionen i 4 kvadranter: dorsal, venstre lateral, højre lateral og forreste (figur 2A, B).
  2. Score for tilstedeværelsen af demyeliniserende læsioner i hver kvadrant som vist i figur 2.
    BEMÆRK: Tilstedeværelsen af en læsion resulterer i en score på 1 i den kvadrant, for i alt 4 mulige point pr. Sektion. En score på 1 tildeles, selvom der er flere læsioner inden for en kvadrant.
  3. Tilføj alle punkter for hver mus, og divider med det samlede antal kvadranter, der er taget prøver for at opnå brøkdelen af kvadranter med submeningeale læsioner.

11. Beregning af arealfraktionen af LFB-farvning i rygmarvshvid substans

BEMÆRK: Denne analyse måler den procentvise arealfraktion af rygmarvshvidt stof, der er farvet med LFB.

  1. Åbn en LFB-plettet sektion, der er gemt som en TIFF-fil, ved at trække/slippe filen til ImageJ.
  2. Klik på Billede > Skriv > 8-bit for at producere et gråtonebillede. Klik på billede > justere > tærskel. Juster den nederste skyder, så den røde overlejring fanger alle de mørke områder (myelin), der ses med øjet (figur 2C-E). Klik på Anvend.
  3. Klik på Analyser > værktøjer > ROI Administrerr for at åbne ROI Manager.
  4. Vælg polygontegneværktøjet på værktøjslinjen ImageJ. Dette tegneværktøj gør det muligt at skitsere et område af rygmarv med computermusen.
  5. Skitser rygmarvens dorsale region og tilføj polygonen til ROI Manager ved at klikke på t på tastaturet.
  6. Skitser den forreste laterale region af rygmarvens hvide substans og tilføj polygonen til ROI-manageren.
    BEMÆRK: Ved sporing skal du udelukke store blodkar, tårer i vævet, artefakter og områder, der støder op til ryghornet (figur 2A, B pil), som normalt er mindre myelinerede. Vær så nøjagtig som muligt, når du sporer, da inkludering af for meget hvid baggrund vil skævvride resultaterne.
  7. Klik på Analysér > Indstil målinger , og vælg Arealfraktion.
  8. Klik på Mål i ROI Manager. Dette vil give den brøkdel af det skitserede område, der er farvet med LFB.
  9. Fra den nyproducerede resultatboks skal du kopiere værdierne til Excel og lukke billedvinduet. Beregn det gennemsnitlige % fraktionsareal farvet for dorsale og ventrolaterale regioner. Gennemsnit disse for at få en værdi for det pågældende afsnit.
  10. Gentag trin 11.1-11.9 for livmoderhals-, thorax- og lændesektioner (N = 3/niveau/mus).
  11. Beregn den gennemsnitlige myelinfraktion for alle sektioner for hver mus. Procent demyelinering estimeres ved at trække % arealfarvning fra 100.

12. Analyse af antallet af CD45+ celler og SMI-32+ axon ovoider

  1. Træk og slip et CD45- eller SMI-32-farvet TIFF-billede til ImageJ. Klik på Analysér > Indstil skala > Global > Ok for at indstille skalabjælken på tværs af alle billeder. Bemærk, at dette kun gøres for det første billede.
  2. Vælg polygontegneværktøjet , og spor rundt om det grå stof ved hjælp af computermusen. Klik på Analyser > måle og registrere resultaterne i Excel som "Grey Matter Area".
  3. Med den tegnede polygon stadig på billedet, fjern den grå substans fra billedet ved at klikke på Delete-tasten (tastaturet). Denne handling efterlader kun det hvide stof, der skal analyseres.
  4. Skitsér hele rygmarvssektionen ved hjælp af polygontegneværktøjet . Ekskluder alle områder af væv, der mangler eller er beskadiget.
  5. Klik på Analyser > mål og registrer resultaterne som "Samlet vævsareal" i Excel-filen.
  6. Klik på Billede > farve > farvedekonvolution. Fra rullemenuen vektorer skal du vælge H DAB. Tre nye vinduer vises - behold det brune farvevindue (DAB-kanal) og slet andre billedvinduer.
  7. Klik på billede > justere > tærskel. Juster den nederste skyder for at spærre billedet, så den røde overlejring fanger den samme mængde brune pletter, der registreres af øjet. Klik på Anvend.
  8. Klik på Process > binær > vandskel. På dette trin skal du sammenligne det originale billede og det binære billede for at sikre, at de er enige.
  9. Klik på Analysér > analyser partikler. Vælg Vis overlejring, og rediger indstillingerne: Størrelse = 5 - 150 μm2, Cirkularitet = 0,4 – 1. Klik på OK.
    BEMÆRK: Disse indstillinger gør det muligt at medtage individuelle celler og små grupper af celler, der ikke blev opdelt med funktionen Vandskel i stedet for at blive udelukket i analysen.
  10. I resultatvinduet skal du registrere det sidste tal i kolonnen længst til venstre i Excel, som repræsenterer det samlede partikelantal. Beregn derefter det hvide stofområde (samlet vævsareal - gråstofareal i mm2). Angiv totalpartikeltal pr. hvidt stofområde (antal/mm2).
  11. Gentag trinnene for hvert gemt RGB-billede. Når alle rygmarvssektioner er blevet analyseret for en mus, skal du beregne gennemsnittet af partikeltallet pr. mm2 væv for den mus.
    BEMÆRK: Den arbejdsgang, der bruges til at analysere rygmarvsleukocytter, kan også anvendes på hjerneområder.

13. Måling af sNF-L ved hjælp af et SIMOA-assay

  1. Der opsamles 100-200 μL blod fra levende mus ved saphenøs blødning ved hjælp af kapillære mikrotainerrør eller via hjertepunktur ved hjælp af en sprøjte og 25 G kanyle (terminal procedure). For sidstnævnte overføres blod til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Lad blodet størkne ved stuetemperatur i 30-60 min.
  3. Centrifugeringsprøver ved 2660 x g i 5 minutter ved 4 °C og pipette den øvre fraktion (serum) ind i et nyt mikrocentrifugeglas. Serummet opbevares ved -80 °C, indtil det er klar til brug.
  4. Forberedelse: Lad kalibratorer og styringer (NF-lysanalysesæt, se materialetabel) varme op til stuetemperatur i 1 time før brug.  Tag enzymsubstratet (RGP) ud af køleskabet og anbring det i et 30 °C vandbad i mindst 30 minutter, hvirvel hvert 10. minut.
  5. Optø serumprøverne på is. Når de er optøet, hvirvelprøver forsigtigt og centrifugeres ved 10000 x g i 5 minutter for at pelletere snavs.
  6. Ilæg pladen: Vortex kalibratorerne og kontrollerne. Læg kalibratorerne i to eksemplarer, kontrollerne i to eksemplarer og serumprøverne i to eksemplarer på den 96-brøndsplade, der følger med sættet. Serumprøver fortyndes i forholdet 1:3 med fortyndingsmiddel i sættet.  Forsegl pladen.
  7. Tænd SIMOA-maskinen (se Materialetabel) i rækkefølgen af computer, program og derefter maskine. Lad maskinen initialisere og køre Start of Day-vedligeholdelse .
  8. Vortex de magnetiske perler i 30 s.
  9. Fanen Indlæs reagenser på skærmen, dobbeltklik på rackpositionen, hvor reagensflasken skal placeres, og scan derefter stregkoden på flasken.
  10. Placer magnetiske perler i rysteposition på stativet (position 1-3).
  11. Fortsæt, og læg detektoren, SBG-reagenset og RGP-reagenset i maskinen.
  12. Klik på indstilling på softwaren. Sørg for, at prøvetilstand er på pladen. Under fanen Installationskørsel skal du navngive eksperimentet.
  13. Tildel brønde på pladen til kalibratorerne på følgende måde: Klik på feltet, og vælg derefter analysen. Vælg kalibrer A, og klik derefter på stigende. Fremhæv hul A1-8, og klik derefter på replikater (2) for at tildele koordinaterne for kalibratorerne, der skal køres to gange. Kør ved hjælp af den pæne protokol.
    BEMÆRK: Se analysecertifikatet (producentens websted) for at få koncentrationerne af hver kalibrator for hvert enkelt lotnummer. Når brønde er tildelt, er det ikke muligt at navigere væk fra denne skærm uden at miste arbejdet, før pladen er låst på plads.
  14. Tildel eksemplerne ved at følge nedenstående trin:
    1. Fra nederste højre hjørne af skærmen skal du klikke på knappen for at tildele prøverne. Fremhæv de huller, hvor prøverne skal placeres.
    2. Afkryds det assay, der skal køres fra listen, vælg antallet af replikater, og angiv den indbyggede fortynding på 4x.
    3. Mens brøndene stadig er fremhævet, skal du angive et præfiks for eksempel-id'et og startnummeret og derefter klikke på generer for at oprette sekventielle id'er til prøverne. Gentag trinnene for kontrolprøver.
  15. Læg pladen i pladeholderen (A1 til A12).
  16. På skærmgrænsefladen skal du klikke på færdige programmeringsprøver og fortsætte til fanen Systemressourcer. Kontroller, at alle reagensbeholdere er fulde, og at affaldsbeholderne er tomme.
  17. Klik på Kør.
  18. Når kørslen er færdig, skal du kontrollere kalibreringskurven under fanen "Datareduktion" ved at vælge analysen og pladenavnet.
  19. Gå til "Kør historik", og brug filtrene til at finde den seneste kørsel. Vælg Kør og derefter alle resultater. Klik på eksport, og gem .csv filen. Klik på rapport, vælg derefter batchkalibreringsrapport , og vælg den seneste kørsel. Se et eksempel på rapporten, og eksportér den.
  20. Kør den vedligeholdelse sidst på dagen, der anbefales af producenten. Sluk for programmet, maskinen og derefter computeren.

Representative Results

Figur 3 viser repræsentativ IHC og histokemisk farvning med eksempler på både akutte (venstre) og ældre EAE-læsioner (højre). Repræsentativ CD45-farvning med hæmatopylinmodfarvning er vist i figur 3A,B.  Figur 3C-F viser eksempler på LFB-farvning med (figur 3C, D) eller uden (figur 3E, F) H&E-modpletten. Selvom hæmatoxylin ikke er specifikt for immunceller, pletter kernerne i immuncellerne mere mørkt og kan skelnes fra CNS-residente celler. Figur 3G, H viser repræsentativ farvning af SMI-32 + axoner, modfarvet med hæmatoxylin. Bemærk det øgede udseende af denne plet i ældre EAE-læsioner.

Skader på myelinerede spor er mest udbredt i rygmarven i aktiv murin EAE, og dette er den vigtigste drivkraft for lammelse i denne sygdom 7,9. Således prioriteres scoring for tilstedeværelse af inflammation og vævsskade i rygmarven i histologiske analyser. EAE-læsioner forekommer sporadisk i forskellige regioner (anterior, lateral eller dorsal) (figur 2A, B) og på forskellige niveauer (sakral, lændehvirvel, thorax, livmoderhals) i rygmarven. Den beskrevne indlejringsmetode sikrer god prøveudtagning af læsioner i hele ledningen. Flere sektioner er indlejret end analyseret, da nogle sektioner kan blive beskadiget i behandlings- eller sektionsprocessen. For at sikre repræsentativ prøveudtagning analyseres mindst 3 repræsentative sektioner på cervikal-, thorax- og lændehvirvelniveau i rygmarven for hver mus. Identiteten af hver prøve blindes, så den person, der udfører analysen, ikke er forudindtaget, når han vælger repræsentative sektioner til analyse.

For at få hurtig indsigt i forskelle i den histologiske sværhedsgrad af EAE kan man score for tilstedeværelsen af sub-meningeal demyeliniserende læsioner i rygmarvskvadranter i udvalgte sektioner (figur 2A, B). Dette er en hurtig metode, der kan udføres på scannede billeder eller ved hjælp af et lysmikroskop. Denne analyse er følsom nok til at detektere forskelle i histologisk EAE-sværhedsgrad mellem grupper, når EAE er alvorlig i en gruppe og mild i en anden. For eksempel blev EAE i eksperimentet i figur 4 induceret i kvindelig vildtype (WT) og mus med en deletion i OGR1 (OGR1 KO) ved hjælp af MOG p35-55 / CFA plus PTX. Mus i WT-gruppen udviklede svær EAE med fuldstændig lammelse, mens OGR1-knockoutgruppen udviklede mild sygdom. Denne forskel i klinisk score svarede til en forskel i den brøkdel af kvadranter, der havde submeningeale læsioner (figur 4C).

Det er vigtigt at supplere scoringen af demyeliniserende læsioner med procentvis arealfraktion af myelinfarvning for at fange omfanget af tab af myelin og / eller myelinerede axoner under det autoimmune angreb. I eksemplet i figur 4 varierede myelinfraktionen også markant mellem OGR1- og WT-musene (figur 4D). Den procentvise myelinfraktion korrelerer også signifikant med den kumulative EAE-score hos mus med EAE (figur 4E) og tjener derfor som et godt mål for den samlede vævsskade i denne sygdom. Bemærk, at denne protokol ikke skelner intensiteten af myelinplet. Hvis dette er det ønskede resultat, skal man udføre immunofluorescensfarvning for myelinproteiner, såsom proteolipidprotein eller myelinbasisk protein og måle intensiteten af denne farvning.

I tilfælde, hvor EAE er alvorlig i begge komparatorgrupper, vil en højere fraktion af rygmarvskvadranter indeholde inflammatoriske/demyeliniserende læsioner. I dette tilfælde er en mere følsom tilgang til score inflammation at tælle antallet af CD45+ leukocytter pr. mm2 hvidt stof (se repræsentativ farvning i figur 3A). CD45-antistofklonen beskrevet her registrerer alle infiltrerende leukocytter og pletter kun lejlighedsvis mikroglia, der opregulerer CD45-ekspression i EAE (se åben pil i figur 3B) og er derfor nyttig til at fange perifer immuncelleinfiltration.

I længerevarende EAE-undersøgelser (>20 dage) anbefales det, at man også foretager en analyse af axonskade. SMI-32-farvning i rygmarvssektioner er en følsom metode til at detektere beskadigede axoner. Selvom betændelse i rygmarven aftager med tiden, og skånede axoner kan myelinere igen, udviser overlevende axoner et differentieret omfang af resterende skade9 (figur 3G, H). For eksempel i MOG p35-55-induceret model af EAE i C57BL6 / J-mus er omfanget af aksonal skade og tab en drivkraft for kliniske scorer, efter at den inflammatoriske proces er aftaget9. Figur 5 viser et eksempel på dette i et EAE-eksperiment i han- og hunmus, WT-mus og mus, der mangler et gen kaldet peroxisomproliferatoraktiveret receptor-delta (PPAR-delta) i myeloidrummet (LysMCre: Ppardfl/fl). Hos hannerne genvandt WT-musene bagbensfunktionen, men de kliniske scorer forblev høje i den mandlige LysMCre: Ppardfl/fl-gruppe . I modsætning hertil havde begge eksperimentelle grupper i eksperimentet hos kvinderne høje score hele vejen igennem. Ved første øjekast antydede dette resultat, at PPAR-delta havde en kønsspecifik effekt i EAE; patologisk scoring af rygmarven afslørede imidlertid, at mus af begge køn i LysMCre: Ppardfl/fl-gruppen havde øget aksonal skade sammenlignet med WT-modstykker (figur 5B). En genotypeeffekt på kliniske scorer blev sandsynligvis ikke observeret hos hunner, fordi WT-hunmus havde tendens til at udvise øget aksonal skade, hvilket manifesterede sig i kroniske neurologiske underskud.

I det samme eksperiment viste det sig, at kvindelige LysMCre: Ppardfl / fl hunmus havde mere omfattende T-celleinfiltration i lillehjernen, hvilket giver et eksempel på, hvordan scoring af hjernebetændelse kan være nyttig i EAE. I EAE findes betændelse i hjernen overvejende i lillehjernen og hjernestammen (figur 6A, D, G), men kan også findes i hjernehinderne (set under hippocampus i figur 6C), nær ventriklerne (figur 6F) og andre hvide substanskanaler, herunder synsnerven og corpus collosum (figur 6B, E). Scoring hjernebetændelse sker i en bestemt hjerneregion (fx cerebellær hvid substans) ved at tælle antallet af CD45-celler pr. mm2 vævsregion ved hjælp af den samme metode som beskrevet for rygmarvsprotokollen. I bruttometoden, der er skitseret her, er et snit midt i lillehjernen, hvilket giver perspektivet for lillehjernen og hjernestammen som vist i figur 6A.

Måling af sNF-L ved hjælp af et SIMOA-assay er blevet en nyttig biomarkør til vurdering af igangværende aksonal skade og respons på terapi i recidiverende-remitterende MS 20,21,27,28. Det samme SIMOA-analysesæt, der bruges til at måle sNF-L-mennesker, kan anvendes til at måle mus sNFL 22,23,24. For at undersøge, hvor godt dette assay udfører, detekterer aksonal skade i EAE, blev sNF-L målt i kvindelige C57BL6 / J-mus ved afslutningen af et EAE-eksperiment, og niveauerne blev sammenlignet med dem i kønsmatchede sunde kontrolmus, der ikke havde EAE. Det blev konstateret, at mus med EAE havde meget højere niveauer af sNF-L end hos raske mus (figur 7A), og disse niveauer korrelerede med tætheden af SMI-32+ axoner i rygmarven (figur 7B). Sammenlignet med histologisk scoring af aksonal skade er SIMOA-analysen hurtigere (fra blødende mus til resultater kan opnås på lidt over en halv dag) og giver derfor hurtig feedback om, hvordan en behandling virker i levende mus. Dette assay har også den fordel, at det afspejler aksonal skade i både rygmarven og hjernen.

Figure 1
Figur 1: Repræsentativ paraffinblok af hjerne- og rygmarvssektioner. De 5 koronale hjernesektioner og rygmarvstværsnit (1,5-2 mm tykke) er indlejret i samme blok, så de kan skæres i en sektion. Mindst 15 sektioner af rygmarven skal indlejres, hvilket giver mulighed for passende udvælgelse af sektioner til analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Scoring meningeal inflammation og procent myelin område på niveau med thorax rygmarv. (A,B) vise billeder af thoraxrygmarven fra en kvindelig C57BL6/J-mus med MOG p35-55-induceret EAE farvet med LFB/H&E. Vist er den tilgang, der bruges til at visualisere kvadranter og eksempler på demyeliniserende læsioner (spores i stiplet linje). Musen i A har 4 af 4 kvadranter med sammenflydende demyeliniserende læsioner, mens musen i B har 1 af 4 kvadranter påvirket. Musen i B har en vis betændelse i andre kvadranter, men dette har ikke manifesteret sig i en sammenflydende læsion og er derfor ikke scoret. (C–E) Eksempel på LFB-billede og gråtone- og tærskelbillede i billedeJ. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Rygmarvssektioner farvet med CD45, LFB H&E, LFB og SMI-32. Eksempler på en tidlig (A, C, E, G) og sen (B, D, F, H) SUB-MENINGEAL LÆSION I RYGMARVEN FARVET FOR CD45 antistof (A, B), LFB / H &E (C, D), LFB alene (E, F) og SMI-32 antistof (G, H). Sorte pile viser eksempler på celler farvet med hvert respektive antistof. Hvide pile viser formodede mikroglia, der er blevet farvet som CD45+. Skalabjælke = 50 μm. Denne figur viser repræsentativ farvning af læsioner i rygmarven hos en kvindelig C57BL6 / J-mus under EAE og fremhæver, hvordan patologi kan være forskellig på tværs af forskellige rygmarvssektioner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Anvendelse af scoring for læsioner og procent demyelinering i EAE. Vist er et eksempel på et EAE-eksperiment, hvor hunmus, der manglede kræft i æggestokkene, G-protein koblet receptor 1 (OGR1) genet på C57BL6 / J-baggrunden udviklede mindre alvorlig klinisk EAE end vildtype (WT) kvindelige C57BL6 / J-mus. EAE blev induceret ved immunisering med MOG p35-55 / CFA plus PTX, og mus blev scoret i henhold til følgende kliniske skala: 1 = halelammelse. 2 = bagben og fodsvaghed, 3 = lammelse af bagben, 4 = svaghed i forbenene, 5 = døende. (A) Gennemsnitlig + SEM klinisk score for mus over tid. (B) Vist er et eksempel på LFB / H &E farvning i den ventrale rygmarv. Skalabjælke = 50 μm. (C) Gennemsnit + SEM procent kvadranter, der indeholdt demyeliniserende læsioner. (D) Gennemsnitlig + SEM procent demyelinering i hver gruppe. (E) viser resultat fra et andet eksperiment i MOG p35-55-induceret EAE i C57BL6/J-mus, hvor EAE-score for individuelle mus blev summeret i løbet af de 30 dages observation og var korreleret med den procentvise demyelinering i rygmarven. Korrelationer blev udført ved hjælp af en Spearman-test. Paneler i (A-D) er tilpasset fra Souza C et al.29. Data i (E) er originale data. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Anvendelse af SMI-32-farvning for at forstå effekten af en genotype på klinisk EAE-fænotype. Denne figur viser et eksempel på et EAE-eksperiment, hvor han- og hunvildtype (bærer floxed allel af Ppard) og myeloide specifikke Ppard-mutantmus (LysMCre: Ppardfl/fl) på C57BL6/J-baggrunden blev immuniseret med MOG p35-55/CFA og PTX og blev fulgt i 45 dage. (A) viser den gennemsnitlige + SEM kliniske score for mus. (B) viser gennemsnitlige + SEM-resultater af histologisk scoring af antallet af SMI-32+ axoner i rygmarven, %kvadranter med submeningeale læsioner, procentkvadranter med perivaskulære manchetter og #CD3 læsioner i lillehjernen pr. mm2 væv. Dette eksperiment viste en genotypeeffekt på SMI-32-farvning. Denne figur er tilpasset fra Drohomyrecky. et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksempler på CD45+/hæmatopoxylinfarvning i hjernens koronale sektioner i MOG p35-55-induceret EAE hos kvindelige C57BL6/J-mus. CD45+ læsioner er vist i brun. (A) CD45+ læsioner i hjernestammen i koronale sektioner. Skalabjælke = 150 μm. (B–G) Eksempler på CD45+ læsioner i synsnerverne (B), meningeal forlængelser under hippocampus (C), hjernestammen (D), corpus collosum (E), medial habenula nær ventriklen (F) og lillehjernen (G).  Skalabjælke: (B–G) = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: sNF-L-niveauer i serum i MOG p35-55-induceret EAE. A) NFL-serumniveauer indsamlet fra hunkontrolmus og EAE-mus ved afslutningen af et forsøg. Data blev analyseret ved hjælp af en tohalet Mann Whitney-test. (****p-værdi < 0,0001). (B) Rygmarvssektioner blev høstet ved endepunktet og farvet med SMI-32. Antallet af positive celler pr. hvidt stofvævsområde blev bestemt og korreleret med serum NF-L ved endepunkt ved hjælp af en Spearman-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Beskrivelse af bade, der anvendes til vævsbehandling. Kassetter flyttes automatisk gennem disse serier af bade ved hjælp af en automatiseret processor. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: Trin i Luxol Fast Blue og Hematoxylin og Eosin farvning. Denne tabel skitserer rækkefølgen af trin i Luxol Fast Blue og Hematoxylin og Eosin farvningsprotokol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 3: Antistoffer anvendt til immunhistokemisk farvning. Beskrevet er de antistoffer, der anvendes i denne protokol, såvel som dem, der kan bruges til yderligere at udforske inflammation, mikrogliose og astrogliose. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 4: Sådan konverteres .czi til TIFF-filer. Bemærk, at det er optimalt at bruge et billede i høj opløsning, men billeder i mellemopløsning kan gemmes i stedet, hvis computerens arbejdshukommelse er begrænset. Det er bydende nødvendigt at bruge billeder med samme opløsning på tværs af analyser. Bemærk også, at det sidste billede i serien er diasetiketten. Undgå at læse etiketten for at sikre, at analysen er blindet. 30,31 Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Histologisk farvning af rygmarven er et vigtigt redskab til vurdering af sværhedsgraden af sygdommen i EAE, især i tilfælde, hvor der er forskelle mellem behandlingsgrupper i omfanget af sygdomsgenopretning i den postakutte fase af sygdommen. Farvning til immuncelleinfiltration (CD45), myelin (LFB) og aksonal skade (SMI-32) hjælper med at karakterisere den underliggende årsag til de ændrede kliniske score hos mus. Den histologiske farvningsprotokol, der er beskrevet her, giver et perspektiv på inflammation såvel som omfanget af myelin og aksonal skade. Desuden validerer de viste resultater sNF-L-måling som en metode til at vurdere omfanget af den samlede neuronale skade i EAE.

De kritiske parametre for denne analyse er at sikre, at forskerne er blinde for sektionernes identitet, og at der er ækvivalent prøveudtagning på hvert niveau af rygmarven på tværs af de forskellige mus. Dette skyldes, at sværhedsgraden af betændelse kan være større ved lavere niveauer af ledningen. En anden kritisk parameter er størrelsen af de eksperimentelle grupper. Rygmarv og hjerner høstes typisk fra 6-8 mus pr. gruppe ved endepunktet for at se signifikante forskelle mellem grupper med behandlinger eller genotyper med beskedne effektstørrelser. Det er også vigtigt at sikre, at udvalgte mus, når gennemsnittet er gennemsnitligt, har repræsentative gennemsnitlige scorer for hele gruppen. Med hensyn til fejlfinding er et almindeligt problem, som dem, der er uerfarne med protokollen, støder på, at rygmarven er fastgjort i utilstrækkelig tid, og den ekstruderes ikke let fra rygsøjlen. Hvis dette er tilfældet, kan rygmarven manuelt dissekeres fra søjlen ved at klippe langs de spinøse processer ved hjælp af fin saks og åbne søjlen for at afsløre rygmarven. Alternativt kan væv fastgøres i et par ekstra dage uden at forstyrre succesen med antistoffarvning. De antistofkloner, der er beskrevet her, virker i væv fikseret op til 2 uger i formalin.

Indlejring af rygmarvsstykkerne kræver dygtighed og øvelse. Det anbefales, at øjenloupes bæres, og at en lampe rettes over indlejringsstationen for bedre at visualisere, om sektionerne falder i tværsnit eller i længdesnit. At holde længden af rygmarvsstykkerne på mindre end 2 mm under brutto hjælper dem med at falde i tværsnit. Et andet almindeligt problem, der opstår for mindre erfarne brugere, er, at LFB fordamper under inkubationen natten over, hvilket efterlader halvdelen af diaset farvet og halvt ufarvet. For at undgå fordampning skal glasfarvningsskålen forsegles med termoplastisk film og derefter plastfolie. Hvis der sker fordampning, og sektionerne er ujævnt farvede, anbefales det at fjerne diasene helt med lithiumcarbonat og plette dem igen i LFB natten over. Et andet almindeligt problem er, at brugerne ikke helt de-blå den grå substans efter LFB. Det er afgørende at undersøge de enkelte sektioner under mikroskopet for at sikre, at der er opnået en tilstrækkelig mængde de-bluing, før man fortsætter med andre trin i protokollen. Selvom CD45- og SMI-32 IHC-pletterne fungerer robust, er det stadig vigtigt at fejlfinde antistofkoncentrationer i foreløbige eksperimenter for hvert nyt antistofparti, der modtages. Dette kan gøres ved at teste en række koncentrationer af antistoffet på en positiv kontrolsektion (EAE rygmarv). Førstegangsfarvning bør også omfatte en negativ kontrol, der består af sekundært antistof alene uden tilsætning af primært antistof. Endelig er det afgørende i billedanalysen at tærskel individuelle billeder, da farvning kan være ujævn på tværs af dias eller sektioner.

Denne protokol bruger frit tilgængelig software. Hvis man ikke har adgang til en processor, en embedder eller mikrotom, kan disse trin hentes til en hospitalsbaseret patologikerne, der tilbyder disse tjenester. Hvis man ikke har adgang til en diasscanner, kan man også bruge et lysmikroskop, der er udstyret med et videokamera til at gemme TIFF-billeder af rygmarven eller hjerneområderne. For en mikroskopbaseret arbejdsgang skal du optage LFB- eller LFB/H&E-sektioner ved lav effekt (40x forstørrelse) og for CD45- og SMI-32-farvning skal du afbilde mindst fire vinduer, der er centreret i rygmarvens ventrale, dorsale og laterale dele (200x forstørrelse for CD45 og 400x forstørrelse for SMI-32). Billedanalyse kan udføres på disse billeder for at kvantificere farvning på en lignende måde som beskrevet.

Beslutningen om, hvilken histologisk tilgang der skal tages for at score EAE, afhænger af, hvor meget de kliniske score varierer mellem grupperne. For eksempel, hvis der er drastiske forskelle i EAE klinisk score (en gruppe fik EAE og en gjorde ikke), vedrører dette normalt forskelle i perifer medieret inflammation. I dette tilfælde er scoring for tilstedeværelsen af demyeliniserende læsioner på LFB / H & E-farvede sektioner tilstrækkelig og vil afsløre forskelle mellem grupper. Hvis grupperne er mere ens i klinisk score ved debut, og der i stedet er forskelle i omfanget af klinisk bedring (f.eks. eksperiment i figur 5A), er det bedst at anvende den fulde histologiske arbejdsgang, der er skitseret her, herunder scoring af hjernebetændelse i hjernestammen og lillehjernen, for at skelne mellem, om forskellene i sygdomskronicitet vedrører forskelle i inflammation eller vævsskade.  Hvis der findes forskelle i inflammation som vurderet ved CD45-tælling, kan der udføres yderligere IHC-undersøgelser for at plette for T-celler (anti-CD3), infiltrerende monocyt / makrofager (Mac3) og mikroglia (Iba-1 / TMEM119) (anbefalede antistofkloner er i supplerende tabel 3). Microglia-aktivering afspejles af en stigning i intensiteten af Iba-1-farvning på dobbeltmærket Iba-1 + TMEM-19+ mikroglia og en øget tilbagetrækning af mikrogliaprocesser, der kan vurderes ved Sholl-analyse på afsnit32. Desuden kan teknikker som flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering anvendes til at udføre en dybere karakterisering af frekvensen og fænotypen af immunpopulationer i hjernen og rygmarven.

Optællingen af SMI-32+ axoner er en følsom metode til påvisning af axonskade i EAE32,33 og i MS34. SMI-32, som detekterer den ikke-fosforylerede form af neurofilament tung eller medium akkumuleres i endepærer af transekterede neuroner. Et alternativ til at detektere skadede axoner er at plette med amyloidforløberprotein (APP), der kan akkumulere i axoner som følge af forstyrret axontransport33. Farvningsmønsteret for SMI-32 og APP, selvom begge afspejler axonskade, overlapper typisk ikke hinanden, hvilket indikerer, at de detekterer forskellige patologier33. Man kan også supplere histologiske målinger af axonskade ved at måle sNF-L, som er et hurtigt og følsomt mål for igangværende aksonal skade i både rygmarven og hjernen. Det giver den fordel, at det kan gøres på en halv dag i levende mus. En ulempe ved denne metode er, at sættene er dyre, og maskinen er højt specialiseret. Virksomheden, der sælger sNF-L-sættet, tilbyder et gebyr for service til dem, der ikke har adgang til en SIMOA-maskine. Et alternativ til vurdering af axonskade er at score for axontab ved enten at tælle axoner i toluidinblåfarvede sektioner af rygmarven12 eller tælle neurofilamentbundter detekteret af SMI-31 i områder af rygmarvens hvide substans32. Begge disse er mere besværlige tilgange end SMI-32 eller sNF-L-måling.

Hvis EAE kliniske score varierer mellem grupper, men scoring for inflammation, demyelinering og aksonal skade ikke afslører forskelle mellem grupper, kan det være nyttigt at plette for astrocytaktivering ved hjælp af GFAP (se supplerende tabel 3 for anbefalet antistofklon). Astrocytaktivering er forbundet med en stigning i GFAP-farvning, og dette har vist sig at korrelere med EAE-progression i nogle EAE-modeller, herunder kronisk EAE i DA-rotten35.

Afslutningsvis beskriver denne protokol metoder og giver en analysearbejdsgang til udførelse af histologisk scoring af EAE.

Disclosures

Shannon Dunn konsulterer for FSD Lucid Psycheceuticals.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Raymond Sobel (Stanford University) for at vise os hans metode til at brutto og rette hjerne- og rygmarvssektioner. Vi takker Kyle Roberton og Milan Ganguly fra Toronto Center for Phenogenomics for at lære indlejringsmetoden og for at skære så mange af vores hjerne- og rygmarvssektioner. Vi takker Dr. Matthew Cussick og Dr. Robert Fujinami (University of Utah) for at dele deres protokoller for scoring af submeningeal og perivaskulær betændelse i rygmarven. Vi takker Shalina Ousman for at dele klonen af CD45-antistoffet. Vi takker Xiofang Lu for træning på vævsprocessoren og vævsindlejringsstationen og vedligeholdelse af dette udstyr på Keenan Research Center of Biomedical Research på St. Michael's Hospital. Dette arbejde blev støttet af et biomedicinsk tilskud fra MS Canada (til SED). Carmen Ucciferri støttes af et studieophold fra Canadas regering. Nuria Alvarez-Sanchez støttes af et Keenan postdoktoralt stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Used to fix spinal cord and brain specimens
1000 mL Glass Beaker Pyrex 1000
15 mL Falcon Tube Starstedt 62.554.100 Fixing and storing spinal cord and brain
250 mL Erlenmeyer Flask Pyrex 4980
500 mL Glass Beaker Pyrex 1003
92 mm x 16 mm Petri Dishes Starstedt 82-1473-001 Used in the tissue grossing procedure
95% Ethyl Alcohol Commercial Alcohols P016EA95 Dehydration and rehydration steps
ABC Elite Kit Vector Labratories PK6100 Used for immunohistochemistry labeling
Aqua Hold 2 PAP Pen Cole Parmer UZ-75955-53 Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector Labratories SP-2001
Biosafety Cabinet Any
Biotinylated rabbit anti-rat IgG Vector Labratories BA-4000 Used for CD45 staining
C57BL6/J Mice Jackson Laboratory Stock # 664 These mice were used in experiments shown in paper.
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Sorvall ST Plus
CitriSolv Fisher Scientific 04-355-121 Used for de-waxing. Is an alternative to xylene
DAB Kit Vector Labratories SK-4100 Used for developing in immunohistochemistry
ddH2O - -
Disposable Scalpel Magna M92-10 Used for grossing spinal cord and brain
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish Cole Parmer UZ-48585-60 Used for histochemical staining and washes
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack Cole Parmer 10061392 Used for immunohistochemistry and histochemistry
Eosin Y Bioshop 173772-87-1 Stains cytoplasm
Feather Microtome Blades Fisher Scientific 12-634-1C Used for sectioning paraffin
Filter Paper Whatman 1001110 Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue
Fine Surgical Scissors Fine Science Tools 14160-10 Used to snip brain and the skull
Fumehood Any
Gibco DPBS Fisher Scientific 14190944
Glacial Acetic Acid BioShop ACE333.4 Used in the luxol fast blue staining procedure
Histoplex Histology Containers Starplex Scientific 565-060-26 Fixing spinal cord and brain
Hydrogen Peroxide Fisher Chemicals H325-500 Used to remove endogenous peroxidase in the tissue
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Kimtech Science Kimwipes Kimberly Clark Professional 34155 Used for immunohistochemistry
Lens paper VWR 52846-001 Used for trapping spinal cord species in cassette during processing
Light microscope Any
Lithium carbonate Sigma Aldrich 554-13-3 De-blueing after luxol fast blue staining
Luxol blue Sigma Aldrich 1328-51-4 Stains CNS myelin
M.O.M Immunodetection Kit Vector Labratories BMK-2202 Used to stain SMI-32
Methanol Fisher Chemicals A454.2 Used for fixation
Mayer's Hematoxylin Electron Microscopy Sciences 26381-02 Stains nuclei
Micro-Adson Forceps with Teeth Fine Science Tools 11027-12 Used for reflecting the skull during dissections
Microcentrifuge  Eppendorf Model 5417R
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z Starstedt 16.440.100 Used for blood collection
Micrscope Cover Glass Fisher Scientific 12545A Used for coverslipping
Mini Shaker VWR 12620-938 Used for making buffers
NF light kit Quanterix 103186 This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum
Nitrile Gloves VWR 76307-462 Safety
Normal Goat Serum Vector Labratories S-1000 Blocking reagent
Normal Rabbit Serum Vector Labratories S-5000 Blocking reagent
OmniSette Tissue Cassettes Fisher Scientific M4935FS Used for embedding spinal cord and brain
p1000 Pipette and Tips various
p200 Pipette and Tips various
Paraffin Embedding station Leica Biosystems Model EG1160
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium Leica Biosystems 39601006 Used for embedding spinal cord and brain
Permount Mounting Medium Fisher Chemicals SP15-100 Used for mounting coverslips on slides
pH meter Fisher Scientific 13636AB315B Used for pHing buffers
Plastic Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-20 Used for pHing buffers
Potassium Chloride BioShop 7447-40-7 Used for making PBS
Potassium Phosphate Monobasic BioShop 7778-77-0 Used for making PBS
Pressure Cooker Nordic Ware Tender Cooker
Purified rat anti-mouse CD45 Vector Labratories 553076 Detects leukocytes
Reagent grade alcohol 100% VWR 89370-084 Dehydration and rehydration steps
Reagent grade alcohol 70% VWR 64-17-5 Dehydration and rehydration steps
Rotary Microtome Leica Biosystems Model RM2235
Simoa Machine Quanterix HD-X
Slide Scanner Zeiss AxioScan.Z1
SMI-32 mouse IgG1 antibody Biolegend 801701 Detects damaged axons
Sodium Chloride BioShop 7647-14-5 Used for making PBS
Sodium Phosphate Dibasic  Bioshop 7558-79-4 Used for making PBS
Standard Adson Forceps Fine Science Tools 11150-10 Used for dissection steps
Superfrost Plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Used to collect sections
Surgical Tough Cuts Fine Science Tools 14110-15 Used to cut through the spine, body wall, and skin
Tissue Processor Leica Biosystems Model TP1020
Tri-soldium citrate Thermo Fisher Scientific 03-04-6132 Used for antigen retrieval
Tween-20 BioBasic 9005-64-5 Used for washing sections
X-P Pierce XP-100 plate seal Excel Scientific 12-140 Used for the sNF-L Assay
Xylene Fisher Chemicals 1330-20-7 Used for de-waxing and clearing sections
Funnel Cole Parmer RK-63100-64 Used to filter formalin before grossing tissue
Stir Plate Any Used to make solutions
Oven Any Used to bake tissue sections after cutting
Parafilm Bemis 13-374-10 Used to seal LFB staining dish
Microwave Any Timing may vary depending on the microwave model
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich 9048-46-8 Used to make blocking buffer
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408--129 Used to store mouse serum samples
Vortex Any Used to prepare samples for sNF-L assay
Waterbath Any Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  2. Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
  3. Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
  4. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
  5. Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
  7. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  8. Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
  9. Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
  10. Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144 (2022).
  11. Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
  12. Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
  13. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  14. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
  15. Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
  16. Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836 (2022).
  17. Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866 (2022).
  18. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194 (2019).
  19. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
  20. Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
  21. Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
  22. Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431 (2021).
  23. Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864 (2020).
  24. Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419 (2021).
  25. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  26. Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
  27. Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
  28. Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
  29. D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439 (2016).
  30. Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
  31. Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
  32. Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425 (2021).
  33. Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
  34. Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
  35. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).

Tags

Immunologi og infektion udgave 204 Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis rygmarvspatologi demyelinisering axonskade immunhistokemi inflammation centralnervesystemet
Scoring Centralnervesystemet betændelse, demyelinisering, og axon skade i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ucciferri, C. C., Gower, A.,… More

Ucciferri, C. C., Gower, A., Alvarez-Sanchez, N., Whetstone, H., Ramaglia, V., Gommerman, J. L., Brand-Arzamendi, K., Schneider, R., Dunn, S. E. Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (204), e65738, doi:10.3791/65738 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter