Summary
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) fungerar som en djurmodell av multipel skleros. Den här artikeln beskriver en metod för att bedöma ryggmärgsinflammation, demyelinisering och axonal skada i EAE. Dessutom presenteras en metod för att kvantifiera lösliga neurofilamentljusnivåer i musserumet, vilket underlättar bedömningen av axonal skada hos levande möss.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en vanlig immunbaserad modell av multipel skleros (MS). Denna sjukdom kan induceras hos gnagare genom aktiv immunisering med proteinkomponenter i myelinskidan och Complete Freunds adjuvans (CFA) eller genom överföring av myelinspecifika T-effektorceller från gnagare som är primade med myelinprotein/CFA till naiva gnagare. Svårighetsgraden av EAE poängsätts vanligtvis på en 5-gradig klinisk skala som mäter graden av stigande förlamning, men denna skala är inte optimal för att bedöma omfattningen av återhämtning från EAE. Till exempel är kliniska poäng fortfarande höga i vissa EAE-modeller (t.ex. myelinoligodendrocytglykoprotein [MOG] peptidinducerad modell av EAE) trots att inflammationen har försvunnit. Det är därför viktigt att komplettera klinisk poängsättning med histologisk poängsättning av EAE, vilket också ger ett sätt att studera de bakomliggande mekanismerna för cellulär skada i centrala nervsystemet (CNS).
Här presenteras ett enkelt protokoll för att förbereda och färga ryggmärgs- och hjärnsnitt från möss och för att poängsätta inflammation, demyelinisering och axonal skada i ryggmärgen. Metoden för att skatta leukocytinfiltration i ryggmärgen kan också användas för att poängsätta hjärninflammation vid EAE. Ett protokoll för att mäta lösligt neurofilamentljus (sNF-L) i serum hos möss med hjälp av en Small Molecule Assay (SIMOA) analys beskrivs också, vilket ger återkoppling om omfattningen av den totala CNS-skadan hos levande möss.
Introduction
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är den vanligaste murina modellen för den mänskliga demyeliniserande sjukdomen, multipel skleros (MS)1. Klassisk MS-inflammatorisk patologi, inklusive infiltration av IFN-γ (gamma) och IL-17-producerande T-hjälparceller2, infiltration av inflammatoriska monocyter3, bildandet av perivaskulära och submeningeala inflammatoriska demyeliniserande lesioner4 och förekomsten av axonskada4 i centrala nervsystemet (CNS), observeras också i EAE 5,6,7,8,9. Likheten i immunmekanismer mellan EAE och MS har gjort EAE till en lämplig preklinisk modell för att testa effekt och verkningsmekanismer för ett antal godkända immunbaserade terapier för MS, inklusive natalizumab, fingolimod, dimetylfumarat och glatirameracetat (granskad i 1,5). Vissa EAE-regimer modellerar andra aspekter av progressiv MS-patologi utöver axonal skada, inklusive utveckling av submeningeal inflammation i hjärnan, kronisk demyelinisering, ryggmärgsatrofi, synaps och neuronförlust 6,10,11,12. Således har EAE nytta för att screena effekten av neuroprotektiva terapier för MS.
EAE induceras hos gnagare på ett antal sätt. Aktiv immunisering är den vanligaste induktionsmetoden och innebär immunisering av gnagare med myelinantigener (antingen hela proteiner eller peptider) emulgerade i CFA kompletterat med värmeavdödad Mycobacterium tuberculosis13. Beroende på musstammen administreras pertussistoxin (PTX) också på dag 0 och dag 2 av immuniseringen för att öka penetransen av sjukdom13. EAE kan också induceras genom adoptivöverföring av myelinspecifika T-celler erhållna från myelin/CFA-primade möss till friska möss14 eller kan utvecklas spontant i möss som överuttrycker T-cellsreceptorer som är specifika för de viktigaste myelinantigenerna5.
EAE-sjukdomens svårighetsgrad och progression poängsätts vanligtvis med hjälp av en diskret 5-gradig klinisk skala: 1 – slapp svans, 2 – svaghet i bakben eller fot, 3 – fullständig förlamning i en eller båda bakbenen, 4 – svaghet i frambenen, 5 – döende eller död13. Detta kliniska poängsystem är sunt när det gäller att dokumentera progressionen av stigande förlamning som inträffar vid sjukdomsdebut, men är mindre känsligt när det gäller att fånga omfattningen av återhämtning från CNS-inflammatoriska attacker. Till exempel tilldelas både möss som rör sig med svårighet och möss som lätt rör sig men uppvisar svaghet i fotgreppet en poäng på 2 på EAE-skalan. Poängen kan förbli höga i den postakuta fasen av EAE på grund av förekomsten av permanent axonskada eller förlust, även trots upplösningen av det inflammatoriska svaret9. Det har gjorts en mängd olika försök att utveckla mer förfinade poängsystem, beteendetester, mått på bakbens- och greppstyrka och infraröda övervakningssystem för att bättre fånga skillnader i kliniska brister i EAE 9,16,17,18; Dessa mer intrikata poängmått särskiljer dock inte bidraget från inflammation kontra vävnadsskada till de underliggande neurologiska bristerna. Således är guldstandardmetoden för att poängsätta svårighetsgraden av EAE att genomföra både klinisk och histologisk poängsättning.
Här beskrivs ett protokoll för hur man dissekerar och bäddar in ryggmärgs- och hjärnprover från mus i paraffin på ett sätt som fångar den stokastiska processen för lesionsbildning som sker vid EAE. Ett protokoll presenteras också för hur man färgar sektioner med Luxol fast blue (LFB), ursprungligen skapad av Klüver och Barrera19, som detekterar myelin i CNS. Sektionerna är antingen färgade med enbart LFB (för demyeliniseringsanalys) eller motfärgade med hematoxylin och eosin (H&E) för att hjälpa till att visualisera och poängsätta inflammatoriska lesioner. Protokoll tillhandahålls också för att kvantifiera förekomsten av totalt antal leukocyter (CD45), förlusten av myelin och antalet skadade axoner (SMI-32) i ryggmärgen med hjälp av kommersiellt tillgängliga antikroppar, immunhistokemiska (IHC) tekniker och allmänt tillgänglig programvara. Protokollet som används för att kvantifiera leukocyter i ryggmärgen kan också användas för att kvantifiera leukocyter i hjärnan.
Histologisk utvärdering av axonal förlust och skada i hjärnan är jämförelsevis svårare än i ryggmärgen eftersom hjärnans vita substans inte löper parallellt med varandra. Mätning av serumneurofilamentljus (sNF-L) har visat sig vara en lovande biomarkör för neuronal skada vid MS20,21. Nyligen genomförda studier har utökat denna teknik till EAE 22,23,24. Här presenteras en metod för att mäta serumneurofilamentljus (sNF-L) i levande möss med hjälp av en Small Molecule Assay (SIMOA) assay. Denna metod kräver endast en liten mängd serum och kan göras på levande möss på bara en halv dag, vilket ger snabb återkoppling om hur en testad behandling påverkar den totala CNS-skadan. Alla metoder som beskrivs här kan tillämpas på möss av vilket kön eller stam som helst.
Protocol
Alla experiment som utfördes med möss utfördes enligt djuranvändningsprotokoll som godkänts av Unity Health Toronto Animal Care Committee, enligt de riktlinjer som fastställts av Canadian Council on Animal Care. Se till att bära labbrock, skyddshandskar och glasögon under hela laboratorieproceduren.
1. Skörda och fixera hjärnan och ryggmärgen
- Avliva musen i enlighet med institutionella riktlinjer. Lägg musen liggande på ett dissekeringsbord och halshugg med en kirurgisk sax (klipp nedåt).
- Använd Adson-pincett (i icke-dominant hand) och ta tag i huden på toppen av mushuvudet. Gör sedan ett 2,5 cm snitt i huden på toppen av huvudet med hjälp av en kirurgisk sax.
- Använd fingrarna för att trycka huden på huvudet i sidled för att visualisera den underliggande skallen.
- Stabilisera mushuvudet genom att ta tag i ögonhålorna med en vanlig Adson-pincett.
- Använd en fin sax (dominant hand) och gör små klipp i skallen längs mittlinjen från halsryggraden till luktbulberna.
OBS: Bädda bara in några millimeter saxspetsar under skallen åt gången för att undvika att skada den underliggande hjärnan. - Använd Adson-pincett med tänder för att reflektera skallen i sidled för att avslöja den underliggande hjärnan.
- Håll huvudet med den icke-dominanta handen. Håll saxen stängd (dominant hand), skopa ut ryggmärgen från halsryggraden och knuffa försiktigt ut hjärnan från skallen och klipp av kranialnerverna.
- Placera hjärnan i ett koniskt rör som innehåller 10 ml 10 % neutralt buffrat formalin som är märkt med djurets ID.
- Snitta pälsen längs mittlinjen av musens bål från halsen till svansen.
- Använd fingrarna för att trycka huden i sidled för att visualisera ryggraden.
- Använd en kirurgisk sax och klipp nedåt genom ryggraden på den nivå där lårbenen fäster vid höften.
- Använd en kirurgisk sax för att klippa kroppsväggen på varje sida av ryggraden från höften till nacken. Klipp bort eventuella fastsittande organ.
- Placera ryggraden som innehåller ryggmärgen i samma formalinrör som innehåller hjärnan. Låt hjärnan och ryggraden fixeras i 5–7 dagar.
OBS: Tidpunkten för fixeringen är viktig. Vissa antikroppar fungerar inte om vävnaden är överfixerad. Om vävnaden är underfixerad är det svårt att pressa ut ryggmärgen från ryggraden i steg 2.
2. Grossing och bearbetning av ryggmärgen och hjärnan
OBS: Följande steg sker i ett dragskåp. Innan du börjar, förbered 2 x 10 cm rena petriskålar, en Erlenmeyerkolv utrustad med en tratt fodrad med filterpapper, två skalpeller (en för att skära ben och en för att skära CNS-vävnader), linspapper, en penna, inbäddningskassetter och provburkar förfyllda med 10 % formalin.
- Använd en sax för att klippa en liten bit linspapper (samma bredd men dubbelt så lång som kassetten) och lägg den i en petriskål.
- Märk en plastkassett med prov-ID med en penna.
- Häll röret som innehåller den fasta hjärnan och ryggraden i tratten. Överför ryggraden och hjärnan till den tomma petriskålen.
OBS: Det använda formalinet filtreras in i Erlenmeyerkolven och kan återanvändas i steg 2.13. - Dela upp hjärnan i sex koronala delar med hjälp av en skalpell. Gör ett snitt i svansen till lillhjärnan, ett i mitten av lillhjärnan, ett precis rostralt till lillhjärnan och två snitt i den återstående rostrala hjärnan, vilket skapar ytterligare 3 koronala skivor av samma tjocklek.
- Använd en pincett för att överföra hjärnprover till ena halvan av linspappret i petriskålen.
- Skär ryggmärgen i tre delar med skalpellen: det första snittet görs längst ner på bröstkorgen och det andra snittet görs strax under krökningen i halsryggraden.
- Använd samma skalpell och trimma den sakrala ryggraden vid stjärtänden tills ryggmärgen kan visualiseras.
- Plocka upp bröstryggen (icke-dominant hand). Håll Adson-pincetten med tänderna tätt stängda (dominant hand) och tryck försiktigt in änden av pincetten i den mindre öppningen av ryggraden med en försiktig vridande rörelse. Sladden ska komma ut från andra änden.
ANMÄRKNINGAR: Alla instrument med runda ändar som är lika stora som ryggmärgen kommer att fungera för detta ändamål. Om ryggmärgen inte hoppar ut naturligt, tvinga den inte. Använd istället en fin sax för att klippa benen längs sidan av ryggraden och reflektera den öppen för att avslöja ryggmärgen. Alternativt kan du fixera ryggmärgen och hjärnan i ytterligare några dagar med formalin; Samma fixeringstid bör dock tillämpas på alla prover för att undvika att antikroppsfärgning sker variabilitet. - Plocka upp den vanliga Adson-pincetten (dominant hand). Håll fortfarande ryggmärgsbiten med den mindre dominanta handen, använd en pincett för att försiktigt dra ut den utslagna strängen ur kolonnen. Placera ryggmärgsbiten i petriskålen som innehåller linspappret.
- Upprepa denna process för ländryggen/sakrala och cervikala kolonnbitarna.
- Dela upp de tre ryggmärgsbitarna (cervikal, bröstkorg, ländrygg/korsband) i mindre tvärsnittsbitar med hjälp av en skalpell. Skär minst 15 klyftor, som vart och ett ska vara mindre än 2 mm tjockt.
OBS: Se till att segmenten är kortare än de är breda, vilket gör att sektionerna lättare faller i tvärsnitt under inbäddningsprocessen i steg 3. - Ordna ryggmärgsbitarna på samma halva av linspappret som innehåller hjärnbitar. Vik linspappret över för att lägga ihop silkesbitarna och placera detta i den märkta kassetten.
OBS: Linspapperet förhindrar att små bitar av vävnad kommer ut ur kassetten under bearbetningen. - Överför kassetten till en provburk som innehåller återvunnet eller färskt formalin.
- Upprepa steg 2.1–2.13 för återstående prover.
- Efter 5-7 dagars fixering, överför kassetterna från provbehållaren till det första formalinbadet i den automatiska vävnadsprocessorn (se materialtabell). Kör vävnadsprocessorn över natten enligt det program som beskrivs i tilläggstabell 1. Proverna hålls i varmt paraffinvax tills de bäddas in.
3. Inbäddning och skärning av hjärn- och ryggmärgssektioner
- Överför kassetter från processorn till den varma hållkammaren på paraffininbäddningsstationen (se materialtabell).
- Bädda in tvärsnitt av ryggmärg och hjärna från varje mus i ett enda paraffinblock enligt följande (figur 1):
- Häll först paraffinvax bara för att täcka botten av formen. Använd en fin pincett och placera hjärnkoronal- och ryggmärgstvärsnittsbitar i paraffinet i botten av formen.
- Överför formen till kylytan i flera sekunder för att fixera hjärn- och ryggmärgsbitarna på plats. Flytta tillbaka formen till den uppvärmda ytan och fyll den till toppen med varmt paraffin.
- Placera kassettlocket (som är märkt med prov-ID) ovanpå formen. Häll mer paraffin ovanpå kassettlocket. Överför formen till kylstationen så att vaxet stelnar (svalt i 30–60 min).
OBS: Att bädda in ryggmärgssektioner kräver övning. För att förbättra framgången, använd kortare ryggmärgslängder (<2 mm) eftersom dessa är mer benägna att falla i tvärsnitt. Kirurgiska ögonluppar kan bäras för att hjälpa till att urskilja om ryggmärgsbitarna är i tvärsnitt. - Montera paraffinblocket på den roterande mikrotomen. Trimma blocket tills vävnader av intresse visas i paraffinsektionen.
- Klipp av 5 μM band av sektioner av varje block och överför dem till ett 42 °C vattenbad.
- Samla sektioner på diabilder och placera objektglas i ett glasrutschkaneställ.
- Grädda delarna i 37 °C i torr ugn över natten. Låt glasen svalna innan du fortsätter med färgningen.
4. Avparaffinisering och rehydrering av sektioner som förberedelse för färgning
OBS: Stegen utförs i ett dragskåp. Innan du börjar, förbered bad med lösningsmedel. Förbered 5 l 1x PBS (1 L ddH2O, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4; pH = 7,4) med 0,05 % Tween-20 (PBS-T) för alla tvättsteg.
- Avparaffinisera genom att placera objektglasen i två på varandra följande bad av xylen eller ett icke-xylenbaserat lösningsmedel på en shaker i 5 minuter vardera med försiktig omrörning.
- Rehydrera vävnader genom att överföra objektglas genom på varandra följande bad med fallande procentandelar etanol: 2 x 100 % etanol (5 min vardera), 2 x 95 % etanol (3 min vardera) och 1 x 70 % etanol (3 min). Håll i 95 % etanol för LFB-färgning och rehydrera till 70 % etanol och håll i PBS-T för immunhistokemi (IHC).
5. LFB för myelin med H&E
- Bered en lösning av 0,1 % LFB (0,2 g LFB, se materialtabell, 200 ml 95 % etanol, 0,5 ml isättika). Blanda och filtrera i en Erlenmeyerkolv. Förvara i en mörk flaska fram till användning.
- Överför sektioner från 95 % etanol till ett glasställ som placeras i en färgskål som innehåller LFB. Täck skålen och förslut med paraffinfilm för att förhindra avdunstning.
- Inkubera sektionerna i 56 °C ugn över natten (max 16 timmar).
- Följande morgon, överför slides till ett ddH2O bad och håll.
- Under tiden, förbered (1) färsk 0,05 % litiumkarbonatlösning (0,05 g litiumkarbonat, 100 ml ddH2O); (2) Eosin Y-lösning (tillsätt 2 g eosinssalt till 40 ml ddH20 och blanda tills det är upplöst och blanda sedan med 160 ml 95 % etanol).
- Förbered följande bad: 1 x litiumkarbonat, 3 x 70 % etanol, 3 x 95 % etanol, 2 x 100 % etanol, 3 x ddH20. Placera baden i den ordning de ska användas (se tilläggstabell 2).
- Följ stegen som beskrivs i tilläggstabell 2.
- När objektglasen är torra, visualisera de demyeliniserande lesionerna under mikroskopet.
6. LFB för myelin utan H&E
- Utför denna färgningsprocedur för analys av myelin.
Proceduren är identisk med steg 5 (se tilläggstabell 2), men har ett förkortat arbetsflöde. Efter steg 4 fortsätter du proceduren med början i steg 10.
7. Antigenhämtning och peroxidaskylning för immunhistokemiska (IHC) färgningar
OBS: Innan du startar, förbered 100 ml väteperoxid i metanol (1 del 30 % väteperoxidlösning i 9 delar 100 % metanol, i ett dragskåp). Bered 1 l 10 mM citratbuffert med Tween-20 (2,94 g trinatriumcitrat, löst i 1 l ddH20 i en bägare på omrörningsplattan, höj pH till 6,0 och tillsätt 500 μl Tween-20). Förbered PBS-T (se steg 4). Alla tvättar görs i bad av PBS-T med försiktig omrörning (på en shaker) om inget annat anges.
- Släck endogent peroxidas genom att placera objektglas i 3 % väteperoxid i metanol i 15 minuter (i ett dragskåp). Tvätta objektglasen två gånger i PBS-T (2 min vardera).
- Överför objektglasen till en metallglashållare och placera i 1 L citratbuffert i en tryckkokare. Försegla locket och lägg till en gummipropp på toppen av ångutloppsventilen.
- Koka på hög höjd i mikrovågsugnen tills den gula fliken på tryckkokaren dyker upp, vilket indikerar att maximalt tryck har uppnåtts. Koka i ytterligare 5 minuter vid maximalt tryck och ta sedan bort tryckkokaren från mikrovågsugnen med skyddshandskar.
- Sänk trycket genom att ta bort proppen. Ta av locket och låt objektglasen svalna i citratbufferten i 20 minuter och fortsätt sedan till önskad färgningsmetod.
VARNING: Ta ett steg tillbaka när du släpper ut ångan eftersom det kan orsaka skållningsskador.
8. CD45 immunhistokemi
OBS: Denna IHC-metod används för att visualisera infiltrerande leukocyter. Stegen för blockering av avidin/biotin kombineras med inkubationsstegen för blockering och inkubation av primära antikroppar.
- Förbered blockeringsbuffert (2 % BSA, 2 % kaninserum i 1x PBS).
- Överför objektglasen till glasbrickan och tvätta två gånger med PBS-T (2 min vardera). Bered avidin/blockerande lösning (4 droppar/ml avidin i 2 % BSA/2 % kaninserum i 1 x PBS, se Materialförteckning).
- Torka bort överflödigt PBS-T runt vävnaden med ett laboratoriepapper. Använd en hydrofob penna, rita en cirkel runt vävnaden och placera objektglaset i den fuktiga kammaren.
- Applicera avidin/blockerande lösning på varje sektion (400 μL/objektglas).
- Täck över den fuktiga kammaren och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur. Under detta steg bereds anti-CD45-antikroppar (tilläggstabell 3) i blockerande buffert som innehåller biotin (4 droppar/ml biotin, 2 % BSA/2 % kaninserum i 1x PBS).
- Knacka bort blockerande lösning från glid på en luddfri laboratorieservett. Dutta runt vävnaden med en laboratorieservett för att avlägsna överflödig vätska.
- Placera tillbaka sliden i en fuktig kammare. Tillsätt 400 μl CD45-antikroppslösning (se Materialförteckning) till avsnittet. Inkubera över natten vid 4 °C i en täckt fuktig kammare.
- Nästa dag, töm av primär antikropp och tvätta objektglas 3 x i PBS-T (5 min vardera).
- Torka området runt snittet med hjälp av ett luddfritt laboratorium och tillsätt sedan 400 μl sekundär antikropp (1:200 spädning i blockerande buffert) till varje sektion. Inkubera i rumstemperatur i 1 timme.
- Under tiden förbereder du ABC-reagens (se materialförteckning) genom att tillsätta 2 droppar reagens A till 5 ml 1x PBS och blanda. Tillsätt 2 droppar reagens B till samma lösning och blanda (förbered ~30 minuter före användning).
- Tvätta objektglasen i 3 byten av 1x PBS-T (5 min vardera) och placera objektglasen i en fuktig kammare.
- Tillsätt 400 μL ABC-reagens till sektionerna. Täck över den fuktiga kammaren och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta objektglasen i 3 byten av 1x PBS-T (5 min vardera). Under tiden, förbered en lämplig mängd DAB-lösning i ett folietäckt 15 ml centrifugrör enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Ta ett objektglas och fokusera på ett ryggmärgssnitt under ett mikroskop. Tillsätt 400 μL DAB till objektglaset och starta labbtimern.
- Visualisera sektionen medan den utvecklas och stoppa timern när leukocyterna är bruna. Överför objektglaset till ett ddH20 bad för att stoppa reaktionen. Låt stå i vatten i 5 min. Samma framkallningstid används för de återstående bilderna.
VARNING: DAB är cancerframkallande. Kassera DAB-avfall och post-DAB ddH2O som farligt avfall. - Motfärgning med Mayers Hematoxylin i ~4-10 min (se tilläggstabell 2). Skölj objektglasen under rinnande kranvatten i 10 min.
- Torka i 95 % etanol (1 x 3 min), följt av absolut 100 % etanol (2 x 3 min vardera).
- Lägg dem i ett dragskåp och överför objektglasen till xylen eller ett xylenersättningsmedel i 5 minuter. Täck med monteringsmedium och låt objektglasen torka i 1-2 dagar i dragskåpet.
VARNING: Om du använder xylen, använd dubbla handskar och pincett för att hantera objektglas när du glider, eftersom det är giftigt och kan lösa upp handskar. - Rengör objektglasen med xylen och skanna med en diabildsskanner med 20 x förstoring.
9. SMI-32 IHC för axonal skada
OBS: Detta protokoll använder en SMI-32-antikropp från musen, som reagerar mot icke-fosforylerat neurofilament tungt, som kan ackumuleras i skadade axoner25. Eftersom denna antikropp har höjts i mus och detekterar ett musantigen, rekommenderas att ett Mouse on Mouse (MOM) kit används. I denna procedur görs det avedin/biotinblockerande steget som ett separat steg från den primära antikroppsinkubationen. Innan du påbörjar detta protokoll, avparaffinisera, rehydrera, släcka endogen peroxidasaktivitet och utför antigenhämtning enligt beskrivningen i steg 4 och steg 7.
- Tvätta sektionerna två gånger med 2 x PBS-T (2 min vardera). Ta bort överflödig vätska runt sektionerna med hjälp av en laboratorieservett och rita en cirkel runt vävnaderna med en hydrofob penna.
- Tillsätt 400 μL blockerande buffert (2 % (vikt/volym) getserum i 1x PBS-T) med avidin (4 droppar/ml) till sektionerna. Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Doppa objektglasen två gånger i 1x PBS-T. Tillsätt 400 μl blockerande buffert med biotin (4 droppar/ml) till objektglaset och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta objektglasen i ett 1 x PBS-T-bad i 2 min. Förbered under tiden MOM-blockerande reagens genom att tillsätta 2 droppar stamlösning (se materialförteckning) till 2.5 ml 1x PBS.
- Tillsätt 400 μl MOM-reagens till sektionen. Inkubera i 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta objektglasen två gånger i ett 1x PBS-T-bad i 2 min. Under tiden bereds MOM-spädningsvätska genom att tillsätta 300 μL stamlösning av proteinkoncentrat till 3,75 ml 1x PBS.
- Tillsätt 400 μl MOM-spädningsvätska och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Späd under tiden SMI-32-antikroppen (se materialtabell) i MOM-spädningsvätskan.
- Knacka bort spädningsvätskan från objektglasen och tillsätt 400 μl SMI-32-antikroppslösning på sektionen. Täck över den fuktiga kammaren och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta objektglasen två gånger i ett 1x PBS-T-bad i 2 minuter, var och en med försiktig omrörning. Under tiden späds MOM anti-mouse IgG-arbetsreagens ut i spädningsvätskan (10 μL stam i 2,5 ml spädningsvätska).
- Tillsätt 400 μl IgG-arbetsreagens mot möss per objektglas. Inkubera i 10 min.
- Tvätta objektglasen två gånger i ett 1x PBS-T-bad i 2 minuter vardera. Fortsätt färga genom att följa stegen som beskrivs i CD45-färgningsprotokollet (steg 8.11 – 8.19).
10. LFB- och H&E-poäng för förekomst av demyeliniserande lesioner
OBS: Följande är en analysmetod som kan tillämpas för att få snabba insikter om svårighetsgraden av inflammatorisk demyelinisering. Denna analys utförs i sektioner av navelsträngen som provtas på olika nivåer (cervikal, bröstkorg och ländrygg, minst 3 snitt per nivå). Se Allen Brain Atlas for Mouse ryggmärg26 för att identifiera ryggmärgens anatomiska nivå. Den här analysen kräver TIFF-filer. Om skannade bilder är i .czi-format, följ instruktionerna i tilläggstabell 4 för att konvertera czi-filer till TIFF-filer.
- Öppna TIFF-bilden av avsnittet som ska analyseras genom att dra och släppa filen i ImageJ. Observera ryggmärgssektionen i 4 kvadranter: dorsal, vänster lateral, höger lateral och främre (Figur 2A,B).
- Poäng för förekomsten av demyeliniserande lesioner i varje kvadrant som visas i figur 2.
OBS: Förekomsten av en lesion resulterar i en poäng på 1 i den kvadranten, för totalt 4 möjliga poäng per sektion. Poängen 1 tilldelas även om det finns flera lesioner inom en kvadrant. - Addera alla poäng för varje mus och dividera med det totala antalet kvadranter som provtagits för att erhålla andelen kvadranter med submeningeala lesioner.
11. Beräkning av areafraktionen av LFB-färgning i ryggmärgens vita substans
OBS: Denna analys mäter procentandelen av ryggmärgens vita substans som är färgad med LFB.
- Öppna en LFB-färgad sektion som sparats som en TIFF-fil genom att dra/släppa filen i ImageJ.
- Klicka på Bild > Skriv > 8-bitars för att skapa en gråskalebild. Klicka på bilden > justera > tröskeln. Justera det nedre reglaget så att det röda överlägget fångar alla mörka områden (myelin) som ses med ögat (Figur 2C–E). Klicka på Använd.
- Klicka på Analysera > verktyg > ROI Manager för att öppna ROI Manager.
- Välj polygonritverktyget i verktygsfältet ImageJ. Detta ritverktyg gör det möjligt att skissera ett område av ryggmärgen med datormusen.
- Skissera ryggmärgens dorsala region och lägg till polygonen i ROI Manager genom att klicka på t på tangentbordet.
- Skissera den främre-laterala regionen av ryggmärgens vita substans och lägg till polygonen i ROI-hanteraren.
OBS: Vid spårning, uteslut stora blodkärl, revor i vävnaden, artefakter och områden intill rygghornet (Figur 2A, B-pil ), som normalt är mindre myeliniserade. Var så exakt som möjligt när du spårar eftersom för mycket vit bakgrund kommer att förvränga resultaten. - Klicka på Analysera > Ställ in mått och välj Area Fraction.
- Klicka på Mät i ROI-hanteraren. Detta kommer att ge den del av det konturerade området som är färgat med LFB.
- Från den nyproducerade resultatrutan kopierar du värdena till Excel och stänger bildfönstret. Beräkna den genomsnittliga procentuella fraktionsarean som färgats för de dorsala och ventrolaterala regionerna. Beräkna medelvärdet av dessa för att få ett värde för det avsnittet.
- Upprepa steg 11.1–11.9 för cervikal, thorax och ländrygg (N = 3/nivå/mus).
- Beräkna den genomsnittliga procentuella myelinfraktionen för alla sektioner för varje mus. Procentuell demyelinisering uppskattas genom att subtrahera den procentuella areafärgningen från 100.
12. Analys av antalet CD45+ -celler och SMI-32+ -axonäggen
- Dra och släpp en CD45- eller SMI-32-färgad TIFF-bild i ImageJ. Klicka på Analysera > Ställ in skala > Global > Ok för att ställa in skalningsfältet för alla bilder. Observera att detta endast görs för den första bilden.
- Välj polygonritverktyget och rita runt den grå substansen med hjälp av datormusen. Klicka på Analysera > Mät och registrera resultaten i Excel som "Grey Matter Area".
- Med den ritade polygonen fortfarande på bilden, ta bort den grå substansen från bilden genom att klicka på Delete-tangenten (tangentbord). Denna åtgärd lämnar endast den vita substansen att analysera.
- Skissera hela ryggmärgssektionen med hjälp av polygonritverktyget . Uteslut alla vävnadsområden som saknas eller är skadade.
- Klicka på Analysera > Mät och registrera resultaten som "Total vävnadsarea" i Excel-filen.
- Klicka på Bild > färg > färgfaltning. I listrutan vektorer väljer du H DAB. Tre nya fönster kommer att dyka upp – behåll det bruna fönstret (DAB-kanalen) och ta bort andra bildfönster.
- Klicka på bilden > justera > tröskel. Justera det nedre reglaget för att tröskelra bilden så att det röda överlägget fångar samma mängd bruna fläckar som upptäcks av ögat. Klicka på Använd.
- Klicka på Process > binär > vattendelare. I det här steget jämför du originalbilden och den binära bilden för att säkerställa att de är överens.
- Klicka på Analysera > Analysera partiklar. Välj Visa överlagring och ändra inställningarna: Storlek = 5 - 150 μm2, Cirkularitet = 0,4 - 1. Klicka på OK.
OBS: Dessa inställningar gör det möjligt att inkludera enskilda celler och små grupper av celler som inte delades med vattendelarfunktionen i stället för att uteslutas i analysen. - I resultatfönstret registrerar du det sista talet i kolumnen längst till vänster i Excel, som representerar det totala antalet partiklar. Beräkna sedan den vita substansarean (total vävnadsarea – grå substansarea i mm2). Uttryck för totalt antal partiklar per yta av vit substans (antal/mm2).
- Upprepa stegen för varje sparad RGB-bild. När alla ryggmärgssnitt har analyserats för en mus, beräkna medelvärdet av partikelantalet per mm2 vävnad för den musen.
OBS: Arbetsflödet som används för att analysera ryggmärgsleukocyter kan också tillämpas på hjärnregioner.
13. Mätning av sNF-L med hjälp av en SIMOA-analys
- Samla in 100–200 μl blod från levande möss genom saphenusblödning med hjälp av kapillärmikrotainerrör eller via hjärtpunktion med hjälp av en spruta och 25 G nål (terminalt förfarande). För det senare, överför blod till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Låt blodet koagulera i rumstemperatur i 30–60 minuter.
- Centrifugera proverna vid 2660 x g i 5 minuter vid 4 °C och pipettera den övre fraktionen (serumet) i ett nytt mikrocentrifugrör. Förvara serumet vid -80 °C tills det ska användas.
- Förberedelse: Låt kalibratorer och kontroller (NF-light assay kit, se Materialtabell) värmas upp till rumstemperatur i 1 timme före användning. Ta ut enzymsubstratet (RGP) ur kylskåpet och ställ i ett vattenbad vid 30 °C i minst 30 minuter, virvla var 10:e minut.
- Tina serumproverna på is. När den har tinats, virvla försiktigt prover och centrifugera vid 10000 x g i 5 minuter för att pelletera eventuellt skräp.
- Ladda plattan: Virvla kalibratorerna och kontrollerna. Ladda kalibratorerna i duplikat, kontroller i duplikat och serumprover i duplikat på 96-hålsplattan som medföljer satsen. Serumprover späds i förhållandet 1:3 med spädningsmedel som finns i satsen. Försegla plattan.
- Slå på SIMOA-maskinen (se Materialtabell) i ordning efter dator, program och sedan maskin. Tillåt att datorn initieras och körs Start of Day-underhåll .
- Virvla de magnetiska pärlorna i 30 s.
- Ladda reagenser fliken på skärmen, dubbelklicka på ställpositionen där reagensflaskan ska placeras och skanna sedan flaskans streckkod.
- Placera magnetiska pärlor i skakningsläge på stativet (position 1–3).
- Fortsätt och ladda detektorn, SBG-reagenset och RGP-reagenset i maskinen.
- Klicka på inställningen på programvaran. Se till sample läget är på plattan. På fliken installationskörning namnger du experimentet.
- Tilldela brunnar på plattan för kalibratorerna enligt följande: Klicka på brunnen och välj sedan analysen. Välj kalibrera A och klicka sedan på stigande. Markera brunnarna A1-8 och klicka sedan på replikat (2) för att tilldela koordinaterna för kalibratorerna som ska köras i två exemplar. Kör med det snygga protokollet.
OBS: Se analyscertifikatet (tillverkarens webbplats) för att få koncentrationerna för varje kalibrator för varje enskilt partinummer. När brunnar väl har tilldelats är det inte möjligt att navigera bort från den här skärmen utan att förlora arbetet, förrän plattan är låst på plats. - Tilldela exemplen genom att följa stegen nedan:
- Längst ned till höger på skärmen klickar du på knappen för att tilldela proverna. Markera brunnar där proverna ska placeras.
- Bocka av den analys som ska köras i listan, välj antalet replikat och ange den inbyggda utspädningen på 4x.
- Med brunnarna fortfarande markerade, ange ett prefix för prov-ID och startnummer och klicka sedan på generera för att skapa sekventiella ID:n för proverna. Upprepa stegen för kontrollprover.
- Ladda plattan i platthållaren (A1 till A12).
- På skärmgränssnittet klickar du på klar programmering samples och fortsätt till fliken systemresurser. Kontrollera att alla reagensbehållare är fulla och att avfallsbehållarna är tomma.
- Klicka på Kör.
- När körningen är klar, kontrollera kalibreringskurvan under fliken "Datareduktion" genom att välja analys- och plattnamn.
- Gå till "Körningshistorik" och använd filtren för att hitta den senaste körningen. Välj kör och sedan alla resultat. Klicka på exportera och spara den .csv filen. Klicka på rapport och välj sedan batchkalibreringsrapport och välj den senaste körningen. Förhandsgranska rapporten och exportera den.
- Kör det underhåll i slutet av dagen som rekommenderas av tillverkaren. Stäng av programmet, maskinen och sedan datorn.
Representative Results
Figur 3 visar representativ IHC och histokemisk färgning, med exempel på både akuta (vänster) och äldre EAE-lesioner (höger). Representativ CD45-färgning med hematoxylinmotfärgning visas i figur 3A,B. Figur 3C–F visar exempel på LFB-färgning med (Figur 3C,D) eller utan (Figur 3E,F) H&E-motfärgen. Även om hematoxylin inte är specifikt för immunceller, färgas immuncellernas kärnor mörkare och kan särskiljas från CNS-residenta celler. Figur 3G,H visar representativ färgning av SMI-32+ axoner, motfärgade med hematoxylin. Lägg märke till det ökade utseendet på denna fläck i äldre EAE-lesioner.
Skador på myeliniserade spår är vanligast i ryggmärgen vid aktiv murin EAE och detta är den främsta drivkraften för förlamning vid denna sjukdom 7,9. Således prioriteras poängsättning för förekomst av inflammation och vävnadsskada i ryggmärgen i histologiska analyser. EAE-lesioner uppträder sporadiskt i olika regioner (främre, laterala eller dorsala) (Figur 2A,B) och på olika nivåer (korsben, ländrygg, bröstkorg, cervikal) i ryggmärgen. Den beskrivna inbäddningsmetoden säkerställer god provtagning av lesioner i hela strängen. Fler sektioner bäddas in än analyseras, eftersom vissa sektioner kan skadas i bearbetnings- eller sektioneringsprocessen. För att säkerställa representativ provtagning analyseras minst 3 representativa sektioner på cervikal-, bröstkorgs- och ländryggsnivå för varje mus. Identiteten för varje prov är blindad för att den person som utför analysen inte ska vara partisk när han eller hon väljer representativa sektioner för analys.
För att få snabba insikter om skillnader i den histologiska svårighetsgraden av EAE kan man poängsätta förekomsten av submeningeala demyeliniserande lesioner i ryggmärgskvadranter i utvalda sektioner (Figur 2A,B). Detta är en snabb metod som kan utföras på skannade bilder eller med hjälp av ett ljusmikroskop. Denna analys är tillräckligt känslig för att upptäcka skillnader i histologisk EAE-svårighetsgrad mellan grupper när EAE är allvarlig i en grupp och mild i en annan. Till exempel, i experimentet i figur 4, inducerades EAE i honor av vildtyp (WT) och möss med en deletion i OGR1 (OGR1 KO) med MOG p35-55/CFA plus PTX. Möss i WT-gruppen utvecklade svår EAE med fullständig förlamning, medan OGR1 knockout-gruppen utvecklade mild sjukdom. Denna skillnad i klinisk poäng motsvarade en skillnad i andelen kvadranter som hade submeningeala lesioner (Figur 4C).
Det är viktigt att komplettera bedömningen av demyeliniserande lesioner med procentuell areafraktion av myelinfärgning för att fånga omfattningen av förlust av myelin och/eller myeliniserade axoner under den autoimmuna attacken. I exemplet i figur 4 skilde sig den procentuella myelinfraktionen också signifikant mellan OGR1- och WT-mössen (figur 4D). Den procentuella myelinfraktionen korrelerar också signifikant med den kumulativa EAE-poängen hos möss med EAE (Figur 4E) och fungerar därför som ett bra mått på den totala vävnadsskadan vid denna sjukdom. Observera att detta protokoll inte skiljer intensiteten av myelinfärgning. Om detta är det önskade resultatet bör man utföra immunofluorescensfärgning för myelinproteiner såsom proteolipidprotein eller myelinbasprotein och mäta intensiteten av denna färgning.
I de fall där EAE är allvarlig i båda jämförelsegrupperna, kommer en högre andel av ryggmärgskvadranterna att innehålla inflammatoriska/demyeliniserande lesioner. I det här fallet är ett känsligare tillvägagångssätt för att poängsätta inflammation att räkna antalet CD45+ leukocyter per mm2 vit substans (se representativ färgning i figur 3A). CD45-antikroppsklonen som beskrivs här detekterar alla infiltrerande leukocyter, och färgar bara enstaka mikroglia som uppreglerar CD45-uttrycket i EAE (se öppen pil i figur 3B) och är därför användbar för att fånga perifer immuncellsinfiltration.
Vid längre EAE-studier (>20 dagar) rekommenderas att man även gör en analys av axonskada. SMI-32-färgning i ryggmärgssnitt är en känslig metod för att upptäcka skadade axoner. Även om inflammation i ryggmärgen avtar med tiden och sparade axoner kan myeliniseras igen, uppvisar överlevande axoner en differentiell omfattning av kvarvarande skada9 (Figur 3G,H). Till exempel, i den MOG p35-55-inducerade modellen av EAE i C57BL6/J-möss, är omfattningen av axonal skada och förlust en drivkraft för kliniska poäng efter att den inflammatoriska processen har avtagit9. Figur 5 visar ett exempel på detta i ett EAE-experiment på han- och honmöss WT-möss och möss som har brist på en gen som kallas peroxisomproliferatoraktiverad receptor-delta (PPAR-delta) i myeloida kompartmentet (LysMCre: Ppardfl/fl). Hos hanarna återfick WT-mössen funktionen i bakbenen, men de kliniska poängen förblev höga i hangruppen LysMCre: Ppardfl/fl. I experimentet på honorna hade däremot båda experimentgrupperna genomgående höga poäng. Vid en första anblick tydde detta resultat på att PPAR-delta hade en könsspecifik effekt i EAE; Patologisk bedömning av ryggmärgen visade dock att möss av båda könen i LysMCre: Ppardfl/fl-gruppen hade ökad axonal skada jämfört med WT-motsvarigheter (Figur 5B). En genotypeffekt på kliniska poäng observerades sannolikt inte hos honor eftersom WT-honmöss tenderade att uppvisa ökad axonal skada, vilket manifesterade sig i kroniska neurologiska brister.
I samma experiment visade sig honmöss av typen LysMCre: Ppardfl/fl ha mer omfattande T-cellsinfiltration i lillhjärnan, vilket ger ett exempel på hur poängsättning av hjärninflammation kan vara användbart vid EAE. Inflammation i hjärnan finns främst i lillhjärnan och hjärnstammen (Figur 6A,D,G), men kan också hittas i hjärnhinnorna (ses under hippocampus i Figur 6C), nära ventriklarna (Figur 6F) och andra områden med vit substans inklusive synnerven och corpus collosum (Figur 6B,E). Poängsättning av hjärninflammation görs i en specifik hjärnregion (t.ex. lillhjärnans vita substans) genom att räkna antalet CD45-celler per mm 2-vävnadsregion med samma metod som beskrivs för ryggmärgsprotokollet. I den grova metoden som beskrivs här är ett snitt i mitten av lillhjärnan, vilket ger perspektivet på lillhjärnan och hjärnstammen som visas i figur 6A.
Mätning av sNF-L med hjälp av en SIMOA-analys har blivit en användbar biomarkör för att bedöma pågående axonal skada och svar på behandling vid skovvis förlöpande MS 20,21,27,28. Samma SIMOA-analyskit som används för att mäta sNF-L-människor kan användas för att mäta mus sNFL 22,23,24. För att undersöka hur väl denna analys fungerar för att upptäcka axonal skada i EAE, mättes sNF-L i honmöss av C57BL6/J vid slutpunkten av ett EAE-experiment och nivåerna jämfördes med de i könsmatchade friska kontrollmöss som inte hade EAE. Det visade sig att möss med EAE hade mycket högre nivåer av sNF-L än hos friska möss (Figur 7A) och dessa nivåer korrelerade med tätheten av SMI-32+-axoner i ryggmärgen (Figur 7B). Jämfört med histologisk poängsättning av axonal skada är SIMOA-analysen snabbare (från blödande möss till att resultat kan uppnås på drygt en halv dag) och ger därför snabb återkoppling av hur en behandling fungerar i levande möss. Denna analys har också fördelen att den återspeglar axonal skada i både ryggmärgen och hjärnan.
Figur 1: Representativt paraffinblock av hjärn- och ryggmärgssnitt. De 5 koronala hjärnsnitten och ryggmärgstvärsnitten (1,5–2 mm tjocka) är inbäddade i samma block så att de kan skäras i en sektion. Minst 15 sektioner av ryggmärgen bör bäddas in, vilket möjliggör ett adekvat urval av sektioner för analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skattning av meningeal inflammation och procentuell myelinarea i nivå med bröstryggmärgen. (A,B) visar bilder av bröstryggmärgen från en kvinnlig C57BL6/J-mus med MOG p35-55-inducerad EAE färgad med LFB/H&E. Bilden visar det tillvägagångssätt som används för att visualisera kvadranter och exempel på demyeliniserande lesioner (spårade i streckad linje). Musen i A har 4 av 4 kvadranter med konfluenta demyeliniserande lesioner, medan musen i B har 1 av 4 kvadranter drabbade. Musen i B har en viss inflammation i andra kvadranter, men detta har inte manifesterat sig i en sammanflytande lesion och är därför inte poängsatt. (C–E) Exempel på LFB-bild och gråskale- och tröskelbilden i imageJ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ryggmärgssnitt färgade med CD45, LFB H&E, LFB och SMI-32. Exempel på en tidig (A,C,E,G) och sen (B,D,F,H) submeningeal lesion i ryggmärgen färgad för CD45-antikropp (A,B), LFB/H&E (C,D), LFB ensam (E,F) och SMI-32-antikropp (G,H). Svarta pilar visar exempel på celler som färgats med respektive antikropp. Vita pilar visar förmodade mikroglia som har färgats som CD45+. Skalstapel = 50 μm. Denna figur visar representativ färgning av lesioner i ryggmärgen hos en kvinnlig C57BL6/J-mus under EAE och belyser hur patologin kan skilja sig åt mellan olika ryggmärgssektioner. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Tillämpning av poängsättning för lesioner och procentuell demyelinisering i EAE. Här visas ett exempel på ett EAE-experiment där honmöss med brist på G-proteinkopplad receptor 1-gen (OGR1) vid äggstockscancer på C57BL6/J-bakgrunden utvecklade mindre allvarlig klinisk EAE än vildtypsmöss (WT) av C57BL6/J-hona. EAE inducerades genom immunisering med MOG p35-55/CFA plus PTX och möss bedömdes enligt följande kliniska skala: 1 = svansförlamning. 2 = svaghet i bakben och fot, 3 = förlamning i bakbenen, 4 = svaghet i frambenen, 5 = döende. (A) Medelvärde + SEM kliniska poäng för möss över tid. (B) På bilden visas ett exempel på LFB/H&E-färgning i den ventrala ryggmärgen. Skalstapel = 50 μm. (C) Medelvärde + SEM-procentkvadranter som innehöll demyeliniserande lesioner. (D) Medelvärde + SEM-procentuell demyelinisering i varje grupp. (E) visar resultat från ett annat experiment i MOG p35-55-inducerad EAE i C57BL6/J-möss där EAE-poäng för enskilda möss summerades över 30 dagars observation och korrelerades med den procentuella demyeliniseringen i ryggmärgen. Korrelationer utfördes med hjälp av ett Spearman-test. Panelerna i (A–D) är anpassade från Souza C et al.29. Data i (E) är originaldata. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Applicering av SMI-32-färgning för att förstå effekten av en genotyp på klinisk EAE-fenotyp. Denna figur visar ett exempel på ett EAE-experiment där hanar och honor av vildtyp (bär på en loxad allel av Ppard) och myeloida specifika Ppard-muterade möss (LysMCre: Ppardfl/fl) på C57BL6/J-bakgrunden immuniserades med MOG p35-55/CFA och PTX och följdes i 45 dagar. (A) visar medelvärdet + SEM kliniska poäng för möss. (B) visar medelvärde + SEM-resultat av histologisk poängsättning av antalet SMI-32+ axoner i ryggmärgen, %kvadranter med submeningeala lesioner, procentkvadranter med perivaskulära manschetter och #CD3 lesioner i lillhjärnan per mm2 vävnad. Detta experiment visade en genotypeffekt på SMI-32-färgning. Denna figur är hämtad från Drohomyrecky. et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exempel på CD45+/hematoxylinfärgning i hjärnans koronala snitt i MOG p35-55-inducerad EAE hos honmöss av C57BL6/J. CD45+ -lesioner visas i brunt. (A) CD45+ -lesioner i hjärnstammen av koronasnitt. Skalstapel = 150 μm. (B–G) Exempel på CD45+ lesioner i synnerverna (B), meningeala förlängningar under hippocampus (C), hjärnstammen (D), corpus collosum (E), mediala habenula nära ventrikeln (F) och lillhjärnan (G). Skalstapel: (B–G) = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: sNF-L-nivåer i serum i MOG p35-55-inducerad EAE. (A) NFL-serumnivåer insamlade från honmöss och EAE-möss vid slutpunkten för ett experiment. Data analyserades med hjälp av ett tvåsidigt Mann Whitney-test. (****p-värde < 0,0001). (B) Ryggmärgssnitt skördades vid slutpunkten och färgades med SMI-32. Antalet positiva celler per vävnadsområde i vit substans bestämdes och korrelerades med NF-L i serum vid slutpunkten med hjälp av ett Spearman-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Beskrivning av bad som används vid bearbetning av mjukpapper. Kassetter flyttas automatiskt genom dessa serier av bad med hjälp av en automatiserad processor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Steg i Luxol Fast Blue och hematoxylin- och eosinfärgning. Denna tabell beskriver stegordningen i Luxol Fast Blue och Hematoxylin- och Eosin-färgningsprotokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 3: Antikroppar som används för immunhistokemisk färgning. De antikroppar som används i detta protokoll och de som kan användas för att ytterligare utforska inflammation, mikroglios och astroglios beskrivs. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 4: Hur man konverterar .czi till TIFF-filer. Observera att det är optimalt att använda en högupplöst bild, men medelupplösta bilder kan sparas istället om datorns arbetsminne är begränsat. Det är absolut nödvändigt att använda bilder med samma upplösning i alla analyser. Observera också att den sista bilden i serien är bildetiketten. Undvik att läsa etiketten för att säkerställa att analysen är blindad. 30,31 Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Histologisk färgning av ryggmärgen är ett viktigt verktyg för att bedöma svårighetsgraden av EAE-sjukdomen, särskilt i fall där det finns skillnader mellan behandlingsgrupperna i graden av sjukdomsåterhämtning i den postakuta fasen av sjukdomen. Färgning för immuncellsinfiltration (CD45), myelin (LFB) och axonal skada (SMI-32) hjälper till att karakterisera den underliggande orsaken till de förändrade kliniska poängen hos möss. Det histologiska färgningsprotokollet som beskrivs här ger ett perspektiv på inflammation samt omfattningen av myelin- och axonal skada. Dessutom validerar de visade resultaten sNF-L-mätning som en metod för att bedöma omfattningen av den totala neuronala skadan i EAE.
De kritiska parametrarna för denna analys är att säkerställa att prövarna är blinda för sektionernas identitet och att det finns likvärdig provtagning på varje nivå av ryggmärgen över de olika mössen. Detta beror på att svårighetsgraden av inflammation kan vara större vid lägre nivåer av navelsträngen. En annan kritisk parameter är storleken på experimentgrupperna. Ryggmärg och hjärna skördas vanligtvis från 6–8 möss per grupp vid endpoint för att se signifikanta skillnader mellan grupper med behandlingar eller genotyper som har blygsamma effektstorlekar. Det är också viktigt att se till att utvalda möss, när medelvärdet beräknas, har representativa medelvärden för hela gruppen. När det gäller felsökning är ett vanligt problem för dem som inte har erfarenhet av protokollet att ryggmärgen är fixerad under en otillräcklig tid och att den inte lätt kan pressas ut från ryggraden. Om så är fallet kan ryggmärgen dissekeras manuellt från kolonnen genom att klippa längs ryggradsutskotten med en fin sax och öppna kolonnen för att avslöja ryggmärgen. Alternativt kan vävnader fixeras i ytterligare några dagar utan att störa framgången med antikroppsfärgning. De antikroppskloner som beskrivs här verkar i vävnad fixerad upp till 2 veckor i formalin.
Att bädda in ryggmärgsbitarna kräver skicklighet och övning. Det rekommenderas att ögonluppar bärs och att en lampa riktas över inbäddningsstationen för att bättre visualisera om sektionerna faller i tvärsnitt eller i längsgående sektion. Att hålla ryggmärgsbitarnas längd på mindre än 2 mm under grovning hjälper dem att falla i tvärsnitt. Ett annat vanligt problem som uppstår för mindre erfarna användare är att LFB avdunstar under inkubationen över natten, vilket gör att hälften av objektglaset är fläckigt och hälften ofärgat. För att undvika avdunstning bör glasfärgningsskålen förseglas med termoplastfilm och sedan plastfolie. Om avdunstning sker och sektionerna är ojämnt färgade, rekommenderas det att helt avblå glasen med litiumkarbonat och färga om dem i LFB över natten. Ett annat vanligt problem är att användarna inte helt avblåar den grå substansen efter LFB. Det är viktigt att undersöka enskilda sektioner under mikroskopet för att säkerställa att en tillräcklig mängd avblåning har uppnåtts innan du fortsätter med andra steg i protokollet. Dessutom, även om CD45- och SMI-32 IHC-färgerna presterar robust, är det fortfarande viktigt att felsöka antikroppskoncentrationer i preliminära experiment för varje nytt antikroppsparti som tas emot. Detta kan göras genom att testa en mängd olika koncentrationer av antikroppen på en positiv kontrollsektion (EAE ryggmärg). Förstagångsfärgning bör också inkludera en negativ kontroll som består av enbart sekundär antikropp utan tillsatt primär antikropp. Slutligen är det viktigt i bildanalysen att tröskelra enskilda bilder eftersom färgningen kan vara ojämn över bilder eller sektioner.
Detta protokoll använder fritt tillgänglig programvara. Om man inte har tillgång till en processor, en inbäddare eller mikrotom kan dessa steg hämtas till en sjukhusbaserad patologikärna som erbjuder dessa tjänster. Dessutom, om man inte har tillgång till en diabildsskanner, kan man använda ett ljusmikroskop som är utrustat med en videokamera för att spara TIFF-bilder av ryggmärgen eller hjärnregionerna. För ett mikroskopbaserat arbetsflöde, fånga LFB- eller LFB/H&E-sektioner vid låg effekt (40x förstoring) och för CD45- och SMI-32-färgning, avbilda minst fyra fönster som är centrerade i de ventrala, dorsala och laterala delarna av ryggmärgen (200x förstoring för CD45 och 400x förstoring för SMI-32). Bildanalys kan utföras på dessa bilder för att kvantifiera färgning på ett liknande sätt som beskrivs.
Beslutet om vilket histologiskt tillvägagångssätt som ska användas för att poängsätta EAE beror på hur mycket de kliniska poängen skiljer sig åt mellan grupperna. Till exempel, om det finns drastiska skillnader i EAE:s kliniska poäng (en grupp fick EAE och en inte), relaterar detta vanligtvis till skillnader i perifert medierad inflammation. I det här fallet räcker det med att poängsätta för förekomsten av demyeliniserande lesioner på LFB/H&E-färgade sektioner och kommer att avslöja skillnader mellan grupperna. Om grupperna är mer likartade i klinisk poäng vid debut och det istället finns skillnader i omfattningen av klinisk återhämtning (t.ex. experimentet i figur 5A), är det bäst att tillämpa hela det histologiska arbetsflödet som beskrivs här, inklusive poängsättning av hjärninflammation i hjärnstammen och lillhjärnan, för att särskilja om skillnaderna i sjukdomens kronicitet relaterar till skillnader i inflammation eller vävnadsskada. Om skillnader i inflammation upptäcks, bedömda genom CD45-räkning, kan ytterligare IHC-studier göras för att färga för T-celler (anti-CD3), infiltrerande monocyter/makrofager (Mac3) och mikroglia (Iba-1/TMEM119) (rekommenderade antikroppskloner finns i tilläggstabell 3). Mikrogliaaktiveringen återspeglas av en ökning av intensiteten av Iba-1-färgning på dubbelmärkta Iba-1+TMEM-19+ mikroglia och en ökad retraktion av mikrogliaprocesser som kan bedömas genom Sholl-analys på avsnitt32. Dessutom kan tekniker som flödescytometri eller encells-RNA-sekvensering tillämpas för att genomföra en djupare karakterisering av frekvensen och fenotypen av immunpopulationer i hjärnan och ryggmärgen.
Räkningen av SMI-32+ axoner är en känslig metod för att detektera axonskador i EAE32,33 och i MS34. SMI-32, som detekterar den icke-fosforylerade formen av neurofilament tungt eller medium, ackumuleras i ändbulber av transekterade neuroner. Ett alternativ för att upptäcka skadade axoner är att färga med amyloidprekursorprotein (APP) som kan ansamlas i axoner till följd av störd axontransport33. Färgningsmönstret för SMI-32 och APP, även om båda båda återspeglar axonskada, överlappar vanligtvis inte, vilket tyder på att de upptäcker olika patologier33. Man kan också komplettera histologiska mått på axonskada genom att mäta sNF-L, som är ett snabbt och känsligt mått på pågående axonal skada i både ryggmärgen och hjärnan. Det har fördelen att det kan göras på en halv dag i levande möss. En nackdel med denna metod är att satserna är dyra och maskinen är mycket specialiserad. Företaget som säljer sNF-L-kitet erbjuder en avgift för service för dem som inte har tillgång till en SIMOA-maskin. Ett alternativ till att bedöma axonskada är att poängsätta axonförlust genom att antingen räkna axoner i toluidinblåfärgade delar av ryggmärgen12 eller räkna neurofilamentbuntar detekterade av SMI-31 i områden av ryggmärgens vita substans32. Båda dessa är mer mödosamma metoder än SMI-32 eller sNF-L-mätning.
Om EAE:s kliniska poäng skiljer sig åt mellan grupperna, men skattning för inflammation, demyelinisering och axonal skada inte avslöjar skillnader mellan grupperna, kan det vara användbart att färga för astrocytaktivering med GFAP (se tilläggstabell 3 för rekommenderad antikroppsklon). Aktivering av astrocyter är förknippad med en ökning av GFAP-färgning och detta har visat sig korrelera med EAE-progression i vissa EAE-modeller, inklusive kronisk EAE hos DA-råttan35.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll metoder och tillhandahåller ett analysarbetsflöde för att utföra histologisk poängsättning av EAE.
Disclosures
Shannon Dunn är konsult för FSD Lucid Psycheceuticals.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Raymond Sobel (Stanford University) för att han visade oss sin metod för att grovhugga och fixa hjärn- och ryggmärgssnitt. Vi tackar Kyle Roberton och Milan Ganguly från Toronto Centre for Phenogenomics för att de lärt sig inbäddningsmetoden och för att ha skurit av så många av våra hjärn- och ryggmärgssektioner. Vi tackar Dr. Matthew Cussick och Dr. Robert Fujinami (University of Utah) för att de delar med sig av sina protokoll för att bedöma submeningeal och perivaskulär inflammation i ryggmärgen. Vi tackar Shalina Ousman för att hon delade med sig av klonen av CD45-antikroppen. Vi tackar Xiofang Lu för utbildning på vävnadsprocessorn och vävnadsinbäddningsstationen och för underhållet av denna utrustning vid Keenan Research Centre of Biomedical Research vid St. Michael's Hospital. Detta arbete stöddes av ett biomedicinskt anslag från MS Canada (till SED). Carmen Ucciferri stöds av en studenttjänst från Kanadas regering. Nuria Alvarez-Sanchez stöds av ett Keenan postdoktoralt stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
| 1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
| 15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
| 500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
| 92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
| 95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
| ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
| Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
| Biosafety Cabinet | Any | ||
| Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
| DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
| ddH2O | - | - | |
| Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
| Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
| Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
| Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
| Fumehood | Any | ||
| Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
| Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
| Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
| Light microscope | Any | ||
| Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
| Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
| M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
| Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
| Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
| Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
| Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
| Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
| NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
| Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
| Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
| Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
| OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
| p1000 Pipette and Tips | various | ||
| p200 Pipette and Tips | various | ||
| Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
| pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
| Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
| Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
| Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
| Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
| Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
| Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
| Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
| Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
| SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
| Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
| Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
| Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
| Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
| Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
| Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
| Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
| X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
| Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
| Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
| Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
| Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
| Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408--129 | Used to store mouse serum samples |
| Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
| Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |
References
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
- Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144 (2022).
- Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
- Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
- Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836 (2022).
- Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866 (2022).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194 (2019).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
- Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
- Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
- Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431 (2021).
- Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864 (2020).
- Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419 (2021).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
- Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
- Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
- D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439 (2016).
- Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
- Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
- Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425 (2021).
- Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
- Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).
