Summary
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) служит животной моделью рассеянного склероза. В данной статье описан подход к оценке воспаления, демиелинизации и повреждения аксонов спинного мозга при ЭАЭ. Кроме того, представлен метод количественной оценки растворимых уровней света нейрофиламентов в сыворотке крови мышей, облегчающий оценку повреждения аксонов у живых мышей.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является распространенной иммунной моделью рассеянного склероза (РС). Это заболевание может быть индуцировано у грызунов активной иммунизацией белковыми компонентами миелиновой оболочки и полным адъювантом Фройнда (КФА) или переносом миелиноспецифических Т-эффекторных клеток от грызунов, праймированных миелиновым белком/КФА, к наивным грызунам. Тяжесть ЭАЭ, как правило, оценивается по 5-балльной клинической шкале, которая измеряет степень восходящего паралича, но эта шкала не является оптимальной для оценки степени выздоровления от ЭАЭ. Например, клинические показатели остаются высокими в некоторых моделях ЭАЭ (например, в модели ЭАЭ, индуцированной пептидами олигодендроцитарного гликопротеина миелина), несмотря на разрешение воспаления. Таким образом, важно дополнить клиническую оценку гистологической оценкой ЭАЭ, что также дает возможность изучить основные механизмы клеточного повреждения в центральной нервной системе (ЦНС).
Здесь представлен простой протокол для подготовки и окрашивания срезов спинного и головного мозга мышей, а также для оценки воспаления, демиелинизации и повреждения аксонов в спинном мозге. Метод оценки лейкоцитарной инфильтрации в спинном мозге также может быть применен для оценки воспаления головного мозга при ЭАЭ. Также описан протокол измерения растворимого света нейрофиламентов (sNF-L) в сыворотке крови мышей с помощью анализа малых молекул (SIMOA), который обеспечивает обратную связь о степени общего повреждения ЦНС у живых мышей.
Introduction
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является наиболее распространенной мышиной моделью демиелинизирующего заболевания человека, рассеянного склероза (РС)1. Классическая воспалительная патология рассеянного склероза, включающая инфильтрацию ИФН-γ (гамма) и IL-17-продуцирующих Т-хелперов2, инфильтрацию воспалительных моноцитов3, образование периваскулярных и субменингеальных воспалительных демиелинизирующих поражений4 и возникновение повреждения аксонов4 в центральной нервной системе (ЦНС), также наблюдается при ЭАЭ 5,6,7,8,9 . Сходство иммунных механизмов между ЭАЭ и МС сделало ЭАЭ подходящей доклинической моделью для проверки эффективности и механизмов действия ряда одобренных иммунопрепаратов для лечения РС, включая натализумаб, финголимод, диметилфумарат и глатирамера ацетат (обзор в 1,5). Некоторые схемы ЭАЭ моделируют другие аспекты прогрессирующей патологии рассеянного склероза, помимо повреждения аксонов, включая развитие субменингеального воспаления в головном мозге, хроническую демиелинизацию, атрофию спинного мозга, синапс и потерю нейронов 6,10,11,12. Таким образом, ЭАЭ может быть использована для скрининга эффективности нейропротективной терапии рассеянного склероза.
ЭАЭ индуцируется у грызунов несколькими способами. Активная иммунизация является наиболее распространенным методом индукции и включает иммунизацию грызунов миелиновыми антигенами (цельными белками или пептидами), эмульгированными в КФА с добавлением микобактерий туберкулеза, убитых при нагревании 13. В зависимости от штамма мышей коклюшный токсин (ПТХ) также вводится на 0-й и 2-й день иммунизации для повышения пенетрантности болезни13. ЭАЭ также может быть индуцирована путем адоптивного переноса миелино-специфических Т-клеток, полученных от мышей с праймом миелина/КФА, здоровым мышам14 или может развиваться спонтанно у мышей, которые сверхэкспрессируют рецепторы Т-клеток, специфичные для основных миелиновых антигенов5.
Тяжесть и прогрессирование заболевания ЭАЭ обычно оцениваются по дискретной 5-балльной клинической шкале: 1 – хромота хвоста, 2 – слабость задних конечностей или стоп, 3 – полный паралич одной или обеих задних конечностей, 4 – слабость передних конечностей, 5 – умирание или мертвость13. Эта клиническая система оценки является надежной для документирования прогрессирования восходящего паралича, который возникает в начале заболевания, но менее чувствительна для определения степени восстановления после воспалительных приступов ЦНС. Например, как мышам, которые передвигаются с трудом, так и мышам, которые передвигаются легко, но демонстрируют слабость хватания ногами, присваивается 2 балла по шкале EAE. Баллы могут оставаться высокими в постострой фазе ЭАЭ из-за наличия постоянного повреждения или потери аксонов, даже несмотря на разрешение воспалительной реакции9. Было предпринято множество попыток разработать более совершенные системы оценки, поведенческие тесты, измерения силы задних конечностей и хвата, а также системы инфракрасного мониторинга для лучшего выявления различий в клинических дефицитах при EAE 9,16,17,18; Тем не менее, эти более сложные критерии оценки не различают вклад воспаления и повреждения тканей в основной неврологический дефицит. Таким образом, золотым стандартом подхода к оценке тяжести ЭАЭ является проведение как клинической, так и гистологической оценки.
В данной статье описан протокол препарирования и встраивания образцов спинного и головного мозга мыши в парафин таким образом, чтобы отразить стохастический процесс формирования повреждений, происходящий при ЭАЭ. Также представлен протокол окрашивания срезов с помощью Luxol fast blue (LFB), первоначально созданного Kluver и Barrera19, который обнаруживает миелин в ЦНС. Срезы либо окрашивают только LFB (для анализа демиелинизации), либо окрашивают гематоксилином и эозином (H&E), чтобы помочь визуализировать и оценить воспалительные поражения. Также предоставляются протоколы для количественной оценки наличия общего количества лейкоцитов (CD45), потери миелина и количества поврежденных аксонов (SMI-32) в спинном мозге с использованием коммерчески доступных антител, иммуногистохимических (ИГХ) методов и общедоступного программного обеспечения. Протокол, используемый для количественного определения лейкоцитов в спинном мозге, также может быть применен для количественного определения лейкоцитов в головном мозге.
Гистологическая оценка потери аксонов и повреждений в головном мозге сравнительно сложнее, чем в спинном мозге, поскольку тракты белого вещества головного мозга не идут параллельно друг другу. Измерение света нейрофиламентов в сыворотке крови (sNF-L) стало многообещающим биомаркером повреждения нейронов при рассеянном склерозе20,21. Недавние исследования расширили эту технологию до EAE 22,23,24. В данной работе представлен метод измерения света сывороточных нейрофиламентов (sNF-L) у живых мышей с помощью анализа малых молекул (SIMOA). Этот метод требует лишь небольшого количества сыворотки и может быть выполнен на живых мышах всего за полдня, обеспечивая быструю обратную связь о том, как протестированная терапия влияет на общее повреждение ЦНС. Все описанные здесь методы могут быть применены к мышам любого пола и штамма.
Protocol
Все эксперименты, проведенные на мышах, проводились в соответствии с протоколами использования животных, одобренными Комитетом по уходу за животными Unity Health Toronto в соответствии с рекомендациями, установленными Канадским советом по уходу за животными. Обязательно надевайте лабораторный халат, защитные перчатки и очки во время лабораторных процедур.
1. Забор и фиксация головного и спинного мозга
- Усыпляйте мышь в соответствии с институциональной политикой. Положите мышь лежа на препарирующий стол и обезглавьте хирургическими ножницами (разрезая вниз).
- Щипцами Адсона (в недоминантной руке) возьмитесь за кожу на макушке головы мыши. Затем сделайте разрез 2,5 см на коже на макушке с помощью хирургических ножниц.
- Пальцами надавите на кожу на голове в стороны, чтобы визуализировать нижележащий череп.
- Стабилизируйте голову мыши, захватив глазницы стандартными щипцами Адсона.
- Тонкими ножницами (доминантной рукой) сделайте небольшие надрезы в черепе по средней линии от шейного отдела позвоночника до обонятельных луковиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставляйте только несколько миллиметров кончиков ножниц под череп за раз, чтобы не повредить нижележащий мозг. - Используйте щипцы Адсона с зубами, чтобы отразить череп латерально, чтобы открыть лежащий под ним мозг.
- Возьмитесь за голову, используя недоминантную руку. Держа ножницы закрытыми (доминирующая рука), вычерпайте спинной мозг из шейного отдела позвоночника и осторожно вытолкните мозг из черепа, перерезав черепно-мозговые нервы.
- Поместите мозг в коническую пробирку, содержащую 10 мл 10% нейтрального буферного формалина, который помечен идентификатором животного.
- Надрежьте мех вдоль средней линии туловища мыши от шеи до хвоста.
- Пальцами надавите на кожу в стороны, чтобы визуализировать позвоночник.
- Хирургическими ножницами разрежьте вниз позвоночник на том уровне, где бедренная кость прикрепляется к бедру.
- Хирургическими ножницами разрежьте стенку тела с каждой стороны позвоночника от бедра до шеи. Удалите все прикрепленные органы.
- Поместите позвоночник, содержащий спинной мозг, в ту же пробирку с формалином, в которой находится головной мозг. Дайте головному и позвоночному столбу закрепиться в течение 5–7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время фиксации имеет важное значение. Некоторые антитела не будут работать, если ткань чрезмерно фиксирована. Если ткань недостаточно фиксирована, трудно выдавить спинной мозг из позвоночного столба на этапе 2.
2. Исследование и обработка спинного и головного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: В вытяжном шкафу выполняются следующие действия. Перед началом работы подготовьте 2 чистые чашки Петри размером 10 см, колбу Эрленмейера с воронкой, выстланной фильтровальной бумагой, два скальпеля (один для резки костей и один для разрезания тканей ЦНС), бумагу для линз, карандаш, кассеты для встраивания и банки для образцов, предварительно заполненные 10% формалином.
- С помощью ножниц отрежьте небольшой кусочек бумаги для линз (такой же ширины, но в два раза длиннее кассеты) и поместите его в одну чашку Петри.
- Наклейте на пластиковую кассету с идентификатором образца с помощью карандаша.
- Вылейте пробирку, содержащую неподвижный мозг и позвоночник, в воронку. Перенесите позвоночник и мозг в пустую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный формалин будет просачиваться в колбу Эрленмейера и может быть повторно использован на шаге 2.13. - Грубо разделите мозг на шесть корональных частей с помощью скальпеля. Сделайте один разрез каудально от мозжечка, один в середине мозжечка, один только ростральный к мозжечку и два надреза в оставшемся ростральном мозге, создав 3 дополнительных корональных среза одинаковой толщины.
- С помощью щипцов перенесите образцы мозга на одну половину бумаги для линз в чашке Петри.
- Разрежьте спинной мозг на три части с помощью скальпеля: первый надрез делается в нижней части грудной клетки, а второй – чуть ниже искривления в шейном отделе позвоночника.
- С помощью того же скальпеля обрежьте крестцовую часть позвоночника на каудальном конце до тех пор, пока спинной мозг не будет визуализирован.
- Поднимите грудной отдел позвоночника (недоминантная рука). Держите щипцы Адсона с плотно сомкнутыми зубами (доминирующая рука) и осторожно протолкните конец щипцов в меньшее отверстие позвоночного столба, используя мягкое скручивающее движение. Шнур должен выходить с другого конца.
ПРИМЕЧАНИЯ: Для этой цели подойдет любой инструмент с закругленным концом, размером со спинной мозг. Если спинной мозг не выскакивает естественным путем, не заставляйте его. Вместо этого используйте тонкие ножницы, чтобы обрезать кости вдоль боковой стороны позвоночника и отразить его, чтобы открыть спинной мозг. В качестве альтернативы зафиксируйте спинной и головной мозг еще на несколько дней в формалине; Тем не менее, ко всем образцам следует применять одинаковое время фиксации, чтобы избежать внесения вариабельности в окрашивание антител. - Возьмите стандартные щипцы Адсона (доминирующая рука). Все еще удерживая участок спинного мозга менее доминирующей рукой, используйте щипцы, чтобы осторожно вытащить появившийся спинной мозг из столба. Поместите кусочек спинного мозга в чашку Петри, содержащую бумагу для линз.
- Повторите этот процесс для поясничного/крестцового и шейного отделов позвоночника.
- Разделите три части спинного мозга (шейный, грудной, поясничный/крестцовый) на более мелкие части поперечного сечения с помощью скальпеля. Отрежьте не менее 15 сегментов, каждый из которых должен быть толщиной менее 2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что сегменты короче, чем их ширина, что облегчит их падение в поперечном сечении в процессе закладки на шаге 3. - Разложите кусочки спинного мозга на той же половине бумаги для линз, содержащей кусочки головного мозга. Сложите бумагу для линз, чтобы прослоить кусочки салфетки, и поместите их в кассету с этикеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бумага для линз предотвращает попадание мелких кусочков ткани из кассеты во время обработки. - Переложите кассету в банку с образцами, содержащую переработанный или свежий формалин.
- Повторите шаги 2.1–2.13 для оставшихся образцов.
- Через 5-7 дней после фиксации переложите кассеты из контейнера с образцом в первую ванну с формалином в автоматическом тканевом процессоре (см. Таблицу материалов). Запустите тканевый процессор на ночь в соответствии с программой, описанной в дополнительной таблице 1. Образцы выдерживают в теплом парафиновом воске до заделки.
3. Встраивание и вырезание отделов головного и спинного мозга
- Перенесите кассеты из процессора в теплую камеру выдержки станции заделки парафина (см. Таблицу материалов).
- Встройте поперечные срезы спинного и головного мозга каждой мыши в один парафиновый блок следующим образом (рис. 1):
- Сначала налейте парафин, чтобы покрыть дно формы. С помощью тонких щипцов поместите кусочки поперечного сечения головного и спинного мозга в парафин на дне формы.
- Переместите форму на остывающую поверхность на несколько секунд, чтобы зафиксировать кусочки головного и спинного мозга на месте. Переместите форму обратно на нагретую поверхность и наполните ее доверху горячим парафином.
- Поместите крышку кассеты (с маркировкой идентификатора образца) на верхнюю часть формы. Налейте еще парафина сверху на крышку кассеты. Переместите форму на станцию охлаждения, чтобы воск застыл (охладите в течение 30–60 минут).
ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание отделов спинного мозга требует практики. Чтобы добиться успеха, используйте более короткие участки спинного мозга (<2 мм), так как они с большей вероятностью упадут в поперечном сечении. Хирургические лупы для глаз можно носить, чтобы помочь различить, находятся ли кусочки спинного мозга в поперечном сечении. - Монтаж парафинового блока на ротационный микротом. Обрезайте блок до тех пор, пока в парафиновом срезе не появятся интересующие вас ткани.
- Отрежьте ленты по 5 мкМ из секций каждого блока и перенесите их на водяную баню с температурой 42 °C.
- Соберите разделы на слайдах и поместите слайды в стойку для стеклянных слайдов.
- Выпекать секции при температуре 37 °C в сухой духовке на ночь. Остудите предметные стекла перед тем, как приступить к окрашиванию.
4. Депарафинизация и регидратация срезов при подготовке к окрашиванию
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги выполняются в вытяжном шкафу. Перед началом работы приготовьте ванночки с растворителями. Приготовьте 5 л 1x PBS (1 л ddH2O, 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 гNa2HPO4, 0,24 г KH2PO4; pH = 7,4) с 0,05% Tween-20 (PBS-T) для всех этапов стирки.
- Депарафинизируйте, поместив предметные стекла в две последовательные ванны с ксилолом или растворителем на основе ксилола на шейкере на 5 минут каждая при легком перемешивании.
- Регидратация тканей путем переноса предметных стекол через последовательные ванны с убывающим процентным содержанием этанола: 2 x 100% этанола (5 мин каждая), 2 x 95% этанола (3 мин каждая) и 1 x 70% этанола (3 мин). Удерживают в 95% этаноле для окрашивания LFB, регидратируют до 70% этанола и удерживают в PBS-T для иммуногистохимии (ИГХ).
5. LFB для миелина с H&E
- Приготовьте раствор 0,1% LFB (0,2 г LFB, см. таблицу материалов, 200 мл 95% этилового спирта, 0,5 мл ледяной уксусной кислоты). Смешайте и процедите в колбу Эрленмейера. Хранить в темном флаконе до использования.
- Переложите секции с 95% этанола в штатив для предметных стекол, который помещается в чашку для окрашивания, содержащую LFB. Накройте блюдо и закройте парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение.
- Инкубируйте срезы в духовке при температуре 56 °C в течение ночи (максимум 16 часов).
- На следующее утро переложите слайды в ванну ddH2O и задержите.
- Тем временем приготовьте (1) свежий 0,05% раствор карбоната лития (0,05 г карбоната лития, 100 мл ddH2O); (2) Раствор эозина Y (добавьте 2 г соли эозина к 40 мл ddH20 и перемешайте до растворения, а затем смешайте со 160 мл 95% этанола).
- Приготовьте следующие ванны: 1 х карбонат лития, 3 х 70% этанол, 3 х 95% этанол, 2 х 100% этанол, 3 х ддН20. Размещайте ванны в порядке использования (см. Дополнительную таблицу 2).
- Выполните действия, описанные в Дополнительной таблице 2.
- После того, как предметные стекла высохнут, визуализируйте демиелинизирующие поражения под микроскопом.
6. LFB для миелина без H&E
- Выполняют эту процедуру окрашивания для анализа на миелин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура идентична шагу 5 (см. Дополнительную таблицу 2), но имеет сокращенный рабочий процесс. После шага 4 продолжите процедуру, начиная с шага 10.
7. Извлечение антигена и гашение пероксидазы при иммуногистохимическом (ИГХ) окрашивании
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы приготовьте 100 мл перекиси водорода в метаноле (1 часть 30% раствора перекиси водорода в 9 частях 100% метанола, в вытяжном шкафу). Приготовьте 1 л цитратного буфера 10 мМ с Tween-20 (2,94 г тринатриевого цитрата, растворенного в 1 л ddH20 в стакане на пластине для перемешивания, доведите pH до 6,0 и добавьте 500 мкл Tween-20). Подготовьте PBS-T (см. шаг 4). Все промывки производятся в ваннах PBS-T с легким перемешиванием (на шейкере), если не указано иное.
- Гасят эндогенную пероксидазу, помещая предметные стекла в 3% перекись водорода в метаноле на 15 мин (в вытяжной шкаф). Промойте горки дважды в PBS-T (по 2 минуты каждая).
- Переложите слайды в металлический держатель слайдов и поместите в 1 л цитратного буфера в скороварку. Закройте крышку и добавьте резиновую пробку в верхнюю часть вентиляционного отверстия для выхода пара.
- Готовьте на высокой мощности в микроволновой печи, пока не появится желтый язычок на скороварке, указывающий на то, что достигнуто максимальное давление. Готовьте еще 5 минут при максимальном давлении, а затем выньте скороварку из микроволновой печи, надев защитные перчатки.
- Сбросьте давление, сняв пробку. Снимите крышку и дайте предметным стеклам остыть в цитратном буфере в течение 20 минут, а затем приступайте к желаемому методу окрашивания.
ВНИМАНИЕ: Отойдите в сторону, выпуская пар, так как это может привести к ожогам.
8. Иммуногистохимический анализ CD45
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод ИГХ используется для визуализации инфильтрирующих лейкоцитов. Этапы блокирования авидина/биотина сочетаются со стадиями блокирования и инкубации первичных антител.
- Приготовьте блокирующий буфер (2% БСА, 2% сыворотка кролика в 1х ПБС).
- Переложите предметные стекла в лоток для стеклянных предметных стекол и дважды промойте PBS-T (по 2 минуты каждый). Приготовьте авидин/блокирующий раствор (4 капли/мл авидина в 2% БСА/2% сыворотке кроликов в 1 х ПБС, см. таблицу материалов).
- Высушите излишки PBS-T вокруг ткани с помощью лабораторной папиросной бумаги. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте круг вокруг ткани и поместите предметное стекло во влажную камеру.
- Нанесите авидин/блокирующий раствор на каждую секцию (400 мкл/предметное стекло).
- Накройте влажной камерой и выдержите 30 мин при комнатной температуре. На этом этапе подготавливают антитела к CD45 (дополнительная таблица 3) в блокирующем буфере, содержащем биотин (4 капли/мл биотина, 2% BSA/2% сыворотки кролика в 1x PBS).
- Смахните блокирующий раствор со слайда на безворсовую лабораторную салфетку. Промокните ткань лабораторной салфеткой, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Поместите слайд обратно во влажную камеру. Добавьте 400 мкл раствора антител CD45 (см. таблицу материалов) на срез. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C в крытой влажной камере.
- На следующий день слейте первичные антитела и промойте предметные стекла 3 раза в PBS-T (по 5 мин каждый).
- Высушите участок вокруг участка в безворсовой лаборатории, а затем добавьте 400 мкл вторичного антитела (разведение 1:200 в блокирующем буфере) на каждый срез. Выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Тем временем приготовьте реактив ABC (см. Таблицу материалов), добавив 2 капли реагента А на 5 мл 1x PBS и перемешайте. В этот же раствор добавить 2 капли реагента Б и перемешать (готовить ~30 мин перед применением).
- Вымойте предметные стекла в 3 смены по 1x PBS-T (по 5 минут каждая) и поместите предметные стекла во влажную камеру.
- Добавьте 400 мкл реагента ABC в срезы. Накройте влажной камерой и выдержите 30 мин при комнатной температуре.
- Вымойте предметные стекла в 3 смены по 1x PBS-T (по 5 минут каждая). Тем временем приготовьте соответствующее количество раствора DAB в покрытой фольгой центрифужной пробирке объемом 15 мл в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
- Возьмите одно предметное стекло и сосредоточьтесь на участке спинного мозга под микроскопом. Добавьте DAB объемом 400 мкл на слайд и запустите лабораторный таймер.
- Визуализируйте срез, пока он развивается, и останавливайте таймер, когда лейкоциты становятся коричневыми. Перенесите предметное стекло в ванну ddH20, чтобы остановить реакцию. Подержать в воде 5 минут. Такое же время проявки используется для остальных слайдов.
ВНИМАНИЕ: DAB является канцерогеном. Утилизируйте отходы DAB и ddH2O после DAB как опасные отходы. - Противоокрашивание препаратом Гематоксилина Майера в течение ~4-10 мин (см. Дополнительную таблицу 2). Промыть горки под проточной водой из-под крана в течение 10 минут.
- Обезвоживание в 95% этаноле (1 x 3 мин), а затем в абсолютном 100% этаноле (2 x 3 мин каждый).
- Переместив в вытяжной шкаф, переложите предметные стекла в ксилол или растворитель, заменяющий ксилол, на 5 мин. Накройте монтажным средством и дайте предметным стеклам высохнуть в течение 1-2 дней в вытяжном шкафу.
ВНИМАНИЕ: При использовании ксилола используйте двойные перчатки и щипцы для обработки слайдов при соскальзывании с покрытия, так как он токсичен и может растворить перчатки. - Очистите слайды с помощью ксилола и отсканируйте с помощью сканера слайдов с 20-кратным увеличением.
9. SMI-32 IHC при повреждении аксонов
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется мышиное антитело SMI-32, которое реагирует против нефосфорилированных тяжелых нейрофиламентов, которые могут накапливаться в поврежденных аксонах25. Поскольку это антитело было выращено в мышах и обнаруживает мышиный антиген, рекомендуется использовать набор «Мышь на мыши» (MOM). В этой процедуре этап блокировки авидина/биотина проводится отдельно от первичной инкубации антител. Перед началом этого протокола необходимо провести депарафинизацию, регидратацию, погасить активность эндогенной пероксидазы и провести забор антигена, как описано на шагах 4 и 7.
- Промойте секции дважды с помощью 2 x PBS-T (2 минуты каждая). Удалите лишнюю жидкость вокруг срезов с помощью лабораторной салфетки и нарисуйте круг вокруг тканей с помощью гидрофобной ручки.
- Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (2% (w/v) козьей сыворотки в 1x PBS-T) с авидином (4 капли/мл) в срезы. Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
- Дважды окуните слайды в 1x PBS-T. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера с биотином (4 капли/мл) к предметному стеклу и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Промойте предметные стекла в ванне с 1 x PBS-T в течение 2 минут. Тем временем приготовьте реагент, блокирующий МОМ, добавив 2 капли исходного раствора (см. Таблицу материалов) к 2,5 мл 1x PBS.
- Добавьте 400 мкл реагента MOM на срез. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре.
- Вымойте предметные стекла дважды в ванне PBS-T в течение 2 минут. Тем временем приготовьте разбавитель MOM, добавив 300 мкл исходного раствора белкового концентрата к 3,75 мл 1x PBS.
- Добавьте 400 мкл разбавителя MOM и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Тем временем разбавьте антитело SMI-32 (см. таблицу материалов) в разбавителе MOM.
- Снимите разбавитель со слайдов и добавьте 400 мкл раствора антител SMI-32 на срез. Накройте влажной камерой и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Промыть горки два раза в ванне PBS-T в течение 2 минут, каждый раз с легким перемешиванием. В то же время разбавьте в разбавителе рабочий реагент MOM против мышей IgG (10 мкл запаса на 2,5 мл разбавителя).
- Добавьте 400 мкл рабочего реагента IgG против мышей на предметное стекло. Выдерживать 10 мин.
- Промыть горки дважды в 1x ванне PBS-T по 2 минуты каждая. Продолжайте окрашивание, следуя шагам, описанным в протоколе окрашивания CD45 (этапы 8.11 – 8.19).
10. Оценка LFB и H&E на наличие демиелинизирующих поражений
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен подход к анализу, который может быть применен для быстрого получения информации о тяжести воспалительной демиелинизации. Этот анализ проводится на участках спинного мозга, отобранных на разных уровнях (шейном, грудном и поясничном, не менее 3 срезов на каждый уровень). Обратитесь к Allen Brain Atlas for Mouse spinal cord26 , чтобы определить анатомический уровень спинного мозга. Для этого анализа требуются файлы в формате TIFF. Если отсканированные изображения имеют формат .czi, следуйте инструкциям в дополнительной таблице 4 для преобразования файлов czi в файлы TIFF.
- Откройте TIFF-изображение анализируемого раздела, перетащив файл в ImageJ. Осмотрите отдел спинного мозга в 4 квадрантах: дорсальный, левосторонний, правый латеральный и передний (рис. 2A,B).
- Оценка наличия демиелинизирующих поражений в каждом квадранте, как показано на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие поражения приводит к оценке 1 балл в этом квадранте, что в общей сложности составляет 4 возможных балла на разрез. 1 балл присваивается даже при наличии множественных поражений в квадранте. - Сложите все точки для каждой мыши и разделите на общее количество квадрантов, отобранных для выборки, чтобы получить долю квадрантов с субменингеальными поражениями.
11. Расчет площади LFB-окрашивания в белом веществе спинного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ измеряет процентную долю белого вещества спинного мозга, окрашенного LFB.
- Откройте окрашенный LFB раздел, сохраненный в формате TIFF, перетащив файл в ImageJ.
- Нажмите на Image > Введите > 8-bit, чтобы получить изображение в оттенках серого. Нажмите на изображение > Настроить порог >. Отрегулируйте нижний ползунок таким образом, чтобы красное наложение охватывало все темные области (миелин), видимые глазом (рис. 2C–E). Нажмите « Применить».
- Нажмите Analyze > Tools > ROI Manager, чтобы открыть ROI Manager.
- Выберите инструмент рисования многоугольника на панели инструментов ImageJ. Этот инструмент для рисования позволяет очертить область спинного мозга с помощью компьютерной мыши.
- Обведите черту спинного отдела спинного мозга и добавьте полигон в диспетчер ROI, нажав t на клавиатуре.
- Очертите передне-боковой отдел белого вещества спинного мозга и добавьте полигон в менеджер ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: При трассировке исключите крупные кровеносные сосуды, разрывы в тканях, артефакты и области, прилегающие к спинному рогу (рис. 2A, стрелка B ), которые обычно менее миелинизированы. Будьте как можно более точными при трассировке, так как включение слишком большого количества белого фона исказит результаты. - Нажмите « Анализ» > «Задать измерения» и выберите «Доля площади».
- Нажмите « Измерить » в менеджере ROI. Это даст фракцию очерченной области, которая окрашена LFB.
- В открывшемся окне результатов скопируйте значения в Excel и закройте окно изображения. Вычислите средний % площади окрашиваемой фракции для дорсальной и вентролатеральной областей. Усредните их, чтобы получить значение для этого раздела.
- Повторите шаги 11.1–11.9 для шейного, грудного и поясничного отделов (N = 3/уровень/мышь).
- Вычислите среднее процентное содержание миелиновой фракции для всех секций для каждой мыши. Процент демиелинизации оценивается путем вычитания % площади окрашивания из 100.
12. Анализ количества CD45+ клеток и яйцевидных аксонов SMI-32+
- Перетащите окрашенное CD45 или SMI-32 изображение TIFF в ImageJ. Нажмите « Анализировать > задать масштаб» > «Глобальный» > «ОК », чтобы установить масштабную линейку для всех изображений. Обратите внимание, что это делается только для первого изображения.
- Выберите инструмент рисования многоугольника и обведите серое вещество с помощью компьютерной мыши. Нажмите « Анализ > измерение » и запишите результаты в Excel как «Область серого вещества».
- Когда нарисованный многоугольник все еще находится на изображении, удалите серое вещество с изображения, нажав на клавишу Delete (клавиатура). Это действие оставляет только белое вещество для анализа.
- Наметьте контур всего участка спинного мозга с помощью инструмента рисования многоугольника . Исключите любые участки ткани, которые отсутствуют или повреждены.
- Нажмите « Анализировать > измерить » и запишите результаты как «Общая площадь ткани» в файле Excel.
- Нажмите на Изображение > Цвет > Цветовая деконволюция. В раскрывающемся окне векторов выберите H DAB. Появятся три новых окна – оставьте окно коричневого оттенка (канал DAB) и удалите другие окна изображений.
- Нажмите на изображение > Настроить порог >. Отрегулируйте нижний ползунок, чтобы установить пороговое значение изображения таким образом, чтобы красное наложение захватывало такое же количество коричневого цвета, обнаруженного на глаз. Нажмите « Применить».
- Нажмите на Process > Binary > Watershed. На этом шаге сравните исходное изображение и двоичное изображение, чтобы убедиться, что они согласуются.
- Нажмите «Анализ» > «Анализ частиц». Выберите «Показать наложение» и измените параметры: Размер = 5 - 150мкм 2, Круглость = 0,4 – 1. Нажмите кнопку ОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки позволяют включать в анализ отдельные ячейки и небольшие группы ячеек, которые не были разделены с помощью функции Watershed, а не исключать их. - В окне результатов запишите последнее число в крайнем левом столбце Excel, которое представляет общее количество частиц. Затем рассчитайте площадь белого вещества (общая площадь ткани – площадь серого вещества вмм2). Выразите общее количество частиц на площадь белого вещества (кол-во/мм2).
- Повторите действия для каждого сохраненного изображения RGB. После того, как все срезы спинного мозга были проанализированы для одной мыши, усредните количество частиц намм2 ткани для этой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс, используемый для анализа лейкоцитов спинного мозга, также может быть применен к областям головного мозга.
13. Измерение sNF-L с помощью анализа SIMOA
- Забор 100–200 мкл крови у живых мышей путем подкожного кровотечения с помощью капиллярных микротюбиков или через пункцию сердца с помощью шприца и иглы 25 G (терминальная процедура). В последнем случае переносят кровь в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Дайте крови свернуться при комнатной температуре в течение 30–60 мин.
- Центрифужируют образцы при 2660 x g в течение 5 мин при 4 °C и пипетируют верхнюю фракцию (сыворотку) в новую микроцентрифужную пробирку. Храните сыворотку при температуре -80 °C до использования.
- Подготовка: Перед использованием дайте калибраторам и элементам управления (набор для анализа NF-light, см. Таблицу материалов) нагреться до комнатной температуры в течение 1 часа. Достаньте ферментный субстрат (RGP) из холодильника и поставьте на водяную баню с температурой 30 °C не менее чем на 30 минут, помешивая каждые 10 минут.
- Разморозьте образцы сыворотки на льду. После размораживания осторожно встряхните образцы и центрифугируйте при 10000 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать мусор.
- Загрузите пластину: Вихрите калибраторы и элементы управления. Загрузите калибраторы в двух экземплярах, контрольные элементы в два раза и образцы сыворотки в двух экземплярах на 96-луночный планшет, входящий в комплект. Образцы сыворотки разводят в соотношении 1:3 с помощью разбавителя, входящего в комплект. Запечатайте пластину.
- Включите аппарат SIMOA (см. Таблицу материалов) в порядке компьютера, программы, а затем аппарата. Разрешите компьютеру инициализироваться и запустить техническое обслуживание в начале дня .
- Вихрите магнитные шарики в течение 30 с.
- Загрузите вкладку «Реагенты» на экране, дважды щелкнув позицию стойки, в которую должен быть помещен флакон с реагентом, а затем отсканировав штрих-код флакона.
- Поместите магнитные шарики в положение встряхивания на стойке (позиции 1–3).
- Продолжайте, загружая детектор, реагент SBG и реагент RGP в машину.
- Нажмите «Настройка » в программном обеспечении. Убедитесь, что режим образца установлен на пластине. На вкладке Запуск установки присвойте эксперименту имя.
- Назначьте лунки на пластине для калибраторов следующим образом: щелкните лунку, затем выберите анализ. Выберите калибровку A , затем нажмите по возрастанию. Выделите лунки A1-8, затем нажмите кнопку Replicates (2), чтобы назначить координаты для калибровщиков, которые будут работать в двух экземплярах. Запускайте по аккуратному протоколу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к сертификату анализа (веб-сайт производителя), чтобы получить концентрации каждого калибратора для каждого конкретного номера партии. После того, как скважины назначены, невозможно отойти от этого экрана без потери работы, пока пластина не будет зафиксирована на месте. - Назначьте образцы, выполнив следующие действия:
- В правом нижнем углу экрана нажмите кнопку , чтобы назначить образцы. Выделите скважины, в которых должны находиться образцы.
- Отметьте из списка анализ, который нужно выполнить, выберите количество репликаций и укажите встроенное разбавление 4x.
- Выделив лунки, введите префикс для идентификатора образца и начальный номер, а затем нажмите кнопку « Создать », чтобы создать последовательные идентификаторы образцов. Повторите шаги для контрольных образцов.
- Загрузите пластину в держатель пластины (от A1 до A12).
- В интерфейсе экрана нажмите на готовые примеры программирования и перейдите на вкладку системных ресурсов. Убедитесь, что все контейнеры с реагентами заполнены, а контейнеры для отходов пусты.
- Нажмите « Выполнить».
- Когда прогон будет завершен, проверьте калибровочную кривую на вкладке «Уменьшение данных», выбрав пробу и название пластины.
- Перейдите в «Историю выполнения» и используйте фильтры, чтобы найти самый последний запуск. Выберите «Выполнить », а затем «Все результаты». Нажмите « Экспорт» и сохраните .csv файл. Нажмите на отчет , а затем выберите отчет о пакетной калибровке и выберите последний запуск. Предварительный просмотр отчета и его экспорт.
- Выполняйте техническое обслуживание в конце дня, рекомендованное производителем. Выключите программу, аппарат, а затем компьютер.
Representative Results
На рисунке 3 показаны репрезентативные ВПХ и гистохимическое окрашивание, с примерами как острых (слева), так и старых поражений ЭАЭ (справа). Репрезентативное окрашивание CD45 с помощью контроксилинового окрашивания гематоксилином показано на рисунке 3A, B. На рисунках 3C–F показаны примеры окрашивания LFB с (рис. 3C, D) или без (рис. 3E, F) контрокрашивания H&E. Хотя гематоксилин не специфичен для иммунных клеток, ядра иммунных клеток окрашиваются более темным цветом и могут быть отличимы от резидентных клеток ЦНС. На рисунке 3G,H показано репрезентативное окрашивание аксонов SMI-32+, окрашенных гематоксилином. Обратите внимание на повышенное появление этого пятна при более старых поражениях ЭАЭ.
Повреждение миелинизированных путей наиболее распространено в спинном мозге у активных мышей ЭАЭ, и это является основным фактором паралича при этом заболевании 7,9. Таким образом, оценка наличия воспаления и повреждения тканей в спинном мозге является приоритетной при гистологическом анализе. Поражения ЭАЭ спорадически возникают в разных областях (передние, боковые или дорсальные) (рис. 2А, Б) и на разных уровнях (крестцовом, поясничном, грудном, шейном) спинного мозга. Описанный метод встраивания обеспечивает хорошую выборку очагов поражения по всей пуповине. Встраивается больше сечений, чем анализируется, так как некоторые разделы могут быть повреждены в процессе обработки или секционирования. Для обеспечения репрезентативной выборки анализируется не менее 3 репрезентативных срезов на шейном, грудном и поясничном уровнях спинного мозга для каждой мыши. Идентификация каждого образца скрыта, чтобы лицо, проводящее анализ, не было предвзятым при выборе репрезентативных срезов для анализа.
Чтобы быстро получить представление о различиях в гистологической тяжести ЭАЭ, можно оценить наличие субменингеальных демиелинизирующих поражений в квадрантах спинного мозга в отдельных срезах (рис. 2A, B). Это быстрый метод, который можно выполнить на отсканированных изображениях или с помощью светового микроскопа. Этот анализ достаточно чувствителен, чтобы выявить различия в гистологической тяжести ЭАЭ между группами, когда ЭАЭ тяжелая в одной группе и легкая в другой. Например, в эксперименте на рисунке 4 ЭАЭ индуцировали у самок дикого типа (WT) и мышей с делецией OGR1 (OGR1 KO) с использованием MOG p35-55/CFA плюс PTX. У мышей в группе WT развилась тяжелая ЭАЭ с полным параличом, в то время как в группе с нокаутом OGR1 заболевание развилось в легкой форме. Эта разница в клинических показателях соответствовала разнице в доле квадрантов с субменингеальными поражениями (рис. 4C).
Важно дополнить оценку демиелинизирующих поражений процентной долей окрашивания миелина, чтобы зафиксировать степень потери миелина и/или миелинизированных аксонов во время аутоиммунной атаки. В примере, приведенном на рисунке 4, процентная фракция миелина также значительно различалась между мышами OGR1 и WT (рис. 4D). Процентная фракция миелина также значимо коррелирует с кумулятивной оценкой ЭАЭ у мышей с ЭАЭ (рис. 4E) и, следовательно, служит хорошим показателем общего повреждения тканей при этом заболевании. Обратите внимание, что этот протокол не различает интенсивность окрашивания миелином. Если это желаемый результат, следует провести иммунофлуоресцентное окрашивание на белки миелина, такие как протеолипидный белок или основной белок миелина, и измерить интенсивность этого окрашивания.
В случае, когда ЭАЭ является тяжелой в обеих группах сравнения, более высокая доля квадрантов спинного мозга будет содержать воспалительные/демиелинизирующие поражения. В этом случае более чувствительным подходом к оценке воспаления является подсчет количества CD45+ лейкоцитов на мм2 белого вещества (см. репрезентативное окрашивание на рисунке 3А). Описанный здесь клон антитела к CD45 обнаруживает все инфильтрирующие лейкоциты и лишь изредка окрашивает микроглию, которая повышает экспрессию CD45 в EAE (см. открытую стрелку на рисунке 3B) и, следовательно, полезен для захвата инфильтрации периферических иммунных клеток.
При более длительных исследованиях ЭАЭ (>20 дней) рекомендуется также провести анализ повреждения аксонов. Окрашивание SMI-32 в отделах спинного мозга является чувствительным методом обнаружения поврежденных аксонов. Несмотря на то, что воспаление в спинном мозге со временем стихает, а сохраненные аксоны могут ремиелинизироваться, выжившие аксоны демонстрируют различную степень остаточного повреждения9 (рис. 3G, H). Например, в модели ЭАЭ, индуцированной MOG p35-55, у мышей C57BL6/J степень повреждения и потери аксонов является фактором, влияющим на клинические показатели после того, как воспалительный процессстихнет. На рисунке 5 показан пример этого в эксперименте EAE на самцах и самках мышей WT и мышах с дефицитом гена под названием рецептор-дельта, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR-delta) в миелоидном компартменте (LysMCre: Ppardfl/fl). У самцов у мышей WT восстановилась функция задних конечностей, однако клинические показатели оставались высокими в группе самцов LysMCre: Ppardfl/fl . Напротив, в эксперименте с участием женщин обе экспериментальные группы имели высокие баллы на протяжении всего эксперимента. На первый взгляд, этот результат позволяет предположить, что PPAR-дельта оказывает специфичный для пола эффект при ЭАЭ; однако патологоанатомическая оценка спинного мозга показала, что у мышей обоих полов в группе LysMCre: Ppardfl/fl наблюдалось более частое повреждение аксонов по сравнению с аналогами WT (рис. 5B). Влияние генотипа на клинические показатели, вероятно, не наблюдалось у самок, потому что самки мышей WT, как правило, демонстрировали повышенное повреждение аксонов, которое проявлялось в хроническом неврологическом дефиците.
В этом же эксперименте у самок мышей LysMCre: Ppardfl/fl была обнаружена более обширная инфильтрация Т-клеток в мозжечке, что является примером того, как оценка воспаления мозга может быть полезна при ЭАЭ. При ЭАЭ воспаление в головном мозге преимущественно локализуется в мозжечке и стволе мозга (рис. 6A, D, G), но также может быть обнаружено в мозговых оболочках (виден под гиппокампом на рисунке 6C), рядом с желудочками (рис. 6F) и другими трактами белого вещества, включая зрительный нерв и коллоозное тело (рис. 6B, E). Оценка воспаления головного мозга проводится в определенной области мозга (например, белом веществе мозжечка) путем подсчета количества клеток CD45 на участок тканимм2 с использованием той же методологии, что и протокол спинного мозга. В описанном здесь методе гроссинга разрез находится в середине мозжечка, что обеспечивает перспективу мозжечка и ствола мозга, как показано на рисунке 6А.
Измерение sNF-L с помощью анализа SIMOA стало полезным биомаркером для оценки продолжающегося повреждения аксонов и ответов на терапию при рецидивирующе-ремиттирующем рассеянном склерозе 20,21,27,28. Тот же набор для анализа SIMOA, который используется для измерения sNF-L человека, может быть применен для измерения sNFL 22,23,24 мыши. Чтобы изучить, насколько хорошо этот анализ выявляет повреждение аксонов при EAE, sNF-L был измерен у самок мышей C57BL6/J в конечной точке эксперимента с EAE, и уровни были сравнены с уровнями у здоровых мышей соответствующего пола, у которых не было EAE. Было обнаружено, что у мышей с ЭАЭ уровни sNF-L были значительно выше, чем у здоровых мышей (рис. 7A), и эти уровни коррелировали с плотностью аксонов SMI-32+ в спинном мозге (рис. 7B). По сравнению с гистологической оценкой повреждения аксонов, анализ SIMOA проводится быстрее (от кровотечения мышей до результатов может быть достигнут чуть более чем за полдня) и, следовательно, обеспечивает быструю обратную связь о том, как лечение работает на живых мышах. Преимущество этого анализа также заключается в том, что он отражает повреждение аксонов как в спинном, так и в головном мозге.
Рисунок 1: Репрезентативная парафиновая блокада отделов головного и спинного мозга. 5 корональных срезов головного мозга и спинного мозга (толщиной 1,5–2 мм) встраиваются в один блок, чтобы их можно было разрезать в одном блоке. Должно быть внедрено не менее 15 участков спинного мозга, что позволяет обеспечить адекватный отбор срезов для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка воспаления мозговых оболочек и процентного содержания миелина на уровне грудного отдела спинного мозга. (A,B) показаны изображения грудного отдела спинного мозга самки мыши C57BL6/J с MOG p35-55-индуцированным ЭАЭ, окрашенным LFB/H&E. Показан подход, используемый для визуализации квадрантов и примеры демиелинизирующих поражений (обведены пунктирной линией). У мыши в А 4 из 4 квадрантов поражены сливающимися демиелинизирующими поражениями, в то время как у мыши в В поражен 1 из 4 квадрантов. У мыши в В есть некоторое воспаление в других квадрантах, но оно не проявилось в виде слияния и поэтому не оценивается. (К–Э) Пример изображения LFB, а также изображения в оттенках серого и порогового изображения в imageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Срезы спинного мозга, окрашенные CD45, LFB H&E, LFB и SMI-32. Примеры раннего (A, C, E, G) и позднего (B, D, F, H) субменингеального поражения спинного мозга, окрашенного на антитела к CD45 (A,B), LFB/H&E (C,D), только LFB (E,F) и антитела к SMI-32 (G,H). Черными стрелками показаны примеры клеток, окрашенных каждым соответствующим антителом. Белыми стрелками показана предполагаемая микроглия, окрашенная как CD45+. Масштабная линейка = 50 мкм. На этом рисунке показано репрезентативное окрашивание поражений в спинном мозге самки мыши C57BL6/J во время ЭАЭ и показано, как патология может отличаться в разных отделах спинного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Применение скоринга для поражений и процента демиелинизации при ЭАЭ. Показан пример эксперимента с ЭАЭ, в котором у самок мышей с дефицитом гена рецептора 1 (OGR1), связанного с раком яичников, на фоне C57BL6/J развилась менее тяжелая клиническая ЭАЭ, чем у самок мышей дикого типа (WT) C57BL6/J. ЭАЭ индуцировали путем иммунизации MOG p35-55/CFA плюс PTX, а мышей оценивали по следующей клинической шкале: 1 = паралич хвоста. 2 = слабость задних конечностей и стоп, 3 = паралич задних конечностей, 4 = слабость передних конечностей, 5 = умирание. (A) Среднее значение + клинические баллы SEM мышей с течением времени. (B) Показан пример окрашивания LFB/H&E в вентральном спинном мозге. Масштабная линейка = 50 мкм. (C) Среднее значение + процентные квадранты SEM, содержащие демиелинизирующие поражения. (D) Среднее значение + процент демиелинизации SEM в каждой группе. На рисунке (E) показаны результаты другого эксперимента по MOG p35-55-индуцированному ЭАЭ у мышей C57BL6/J, в котором баллы ЭАЭ отдельных мышей суммировались в течение 30 дней наблюдения и коррелировали с процентом демиелинизации в спинном мозге. Корреляции проводили с помощью критерия Спирмена. Панели в (A–D) адаптированы из Souza C et al.29. Данные в пункте (E) являются исходными данными. *<0,05, **<0,01, ***<0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Применение окрашивания SMI-32 для понимания влияния генотипа на клинический фенотип ЭАЭ. На этом рисунке показан пример эксперимента EAE, в котором самцы и самки дикого типа (несущие флоксированный аллель Ppard) и миелоид-специфичные мутантные мыши Ppard (LysMCre: Ppardfl/fl) на фоне C57BL6/J были иммунизированы MOG p35-55/CFA и PTX и находились под наблюдением в течение 45 дней. (А) показано среднее значение + клинические баллы SEM мышей. (B) показаны средние + SEM результаты гистологической оценки количества аксонов SMI-32+ в спинном мозге, %квадрантов с субменингеальными поражениями, процентных квадрантов с периваскулярными манжетами и #CD3 поражений в мозжечке намм2 ткани. Этот эксперимент показал влияние генотипа на окрашивание SMI-32. Эта фигура заимствована из Дрогомирецкого. и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Примеры окрашивания CD45+/гематоксилином в корональных срезах головного мозга при MOG p35-55-индуцированной ЭАЭ у самок мышей C57BL6/J. CD45+ поражения показаны коричневым цветом. (А) CD45+ поражения ствола головного мозга коронарного сечения. Масштабная линейка = 150 мкм. (Б–Г) Примеры CD45+ поражений зрительных нервов (B), менингеальных расширений под гиппокампом (C), ствола мозга (D), коллозного тела (E), медиальной хабенулы возле желудочка (F) и мозжечка (G). Масштабная линейка: (B–G) = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Уровни sNF-L в сыворотке крови при ЭАЭ, индуцированной р35-55 MOG. (A) Уровни НФЛ в сыворотке крови, полученные от самок контрольной группы и мышей с ЭАЭ в конечной точке одного эксперимента. Данные были проанализированы с помощью двустороннего критерия Манна-Уитни. (****p значение < 0,0001). (B) Срезы спинного мозга были собраны в конечной точке и окрашены SMI-32. Количество положительных клеток на участке ткани белого вещества определяли и коррелировали с сывороточным NF-L в конечной точке с помощью теста Спирмена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Описание ванн, используемых при обработке тканей. Кассеты автоматически перемещаются через эти серии ванн с помощью автоматизированного процессора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 2: Этапы окрашивания Luxol Fast Blue и гематоксилином и эозином. В этой таблице показан порядок этапов в протоколе окрашивания Luxol Fast Blue и гематоксилином и эозином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 3: Антитела, используемые для иммуногистохимического окрашивания. Описаны антитела, которые используются в этом протоколе, а также те, которые могут быть использованы для дальнейшего изучения воспаления, микроглиоза и астроглиоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 4: Как конвертировать .czi в файлы TIFF. Обратите внимание, что оптимально использовать изображение с высоким разрешением, но вместо него можно сохранить изображения со средним разрешением, если рабочая память компьютера ограничена. Крайне важно использовать изображения с одинаковым разрешением при разных анализах. Кроме того, обратите внимание, что последнее изображение серии — это подпись слайда. Избегайте чтения этикетки, чтобы убедиться, что анализ слепой. 30,31 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Гистологическое окрашивание спинного мозга является важным инструментом оценки тяжести заболевания ЭАЭ, особенно в тех случаях, когда существуют различия между группами лечения в степени выздоровления от заболевания в постострой фазе заболевания. Окрашивание на инфильтрацию иммунных клеток (CD45), миелин (LFB) и повреждение аксонов (SMI-32) помогает охарактеризовать основную причину изменения клинических показателей у мышей. Описанный здесь протокол гистологического окрашивания дает представление о воспалении, а также о степени повреждения миелина и аксонов. Кроме того, показанные результаты подтверждают достоверность измерения sNF-L в качестве метода оценки степени общего повреждения нейронов при ЭАЭ.
Важнейшими параметрами этого анализа являются обеспечение того, чтобы исследователи не могли идентифицировать срезы и чтобы на каждом уровне спинного мозга у разных мышей был проведен эквивалентный отбор проб. Это связано с тем, что тяжесть воспаления может быть выше на более низких уровнях пуповины. Еще одним важным параметром является размер экспериментальных групп. Спинной и головной мозг обычно берут у 6-8 мышей в каждой группе в конечной точке, чтобы увидеть значительные различия между группами с лечением или генотипами со скромными размерами эффекта. Также важно убедиться, что отобранные мыши, при усреднении, имеют репрезентативные средние баллы всей группы. Что касается устранения неполадок, распространенная проблема, с которой сталкиваются те, кто не имеет опыта работы с протоколом, заключается в том, что спинной мозг фиксируется в течение недостаточного периода времени и его нелегко выдавить из позвоночного столба. В этом случае спинной мозг можно вручную отделить от столба, обрезав вдоль остистых отростков с помощью тонких ножниц и открыв колонку, чтобы обнажить спинной мозг. В качестве альтернативы, ткани могут быть зафиксированы на несколько дополнительных дней, не мешая успеху окрашивания антителами. Описанные здесь клоны антител работают в тканях, зафиксированных в формалине до 2 недель.
Встраивание частей спинного мозга требует навыков и практики. Рекомендуется надеть лупы для глаз и направить лампу на станцию заделки, чтобы лучше визуализировать, падают ли секции в поперечном или продольном сечении. Сохранение длины частей спинного мозга на уровне менее 2 мм во время гроссинга поможет им упасть в поперечном сечении. Еще одна распространенная проблема, с которой сталкиваются менее опытные пользователи, заключается в том, что LFB испаряется во время ночной инкубации, оставляя половину предметного стекла окрашенной, а половину неокрашенной. Чтобы избежать испарения, стеклянную форму для окрашивания следует запечатать термопластичной пленкой, а затем полиэтиленовой пленкой. Если происходит испарение и участки окрашиваются неравномерно, рекомендуется полностью очистить предметные стекла карбонатом лития и повторно окрасить их в LFB на ночь. Еще одна распространенная проблема заключается в том, что пользователи не полностью очищают серое вещество после LFB. Очень важно исследовать отдельные срезы под микроскопом, чтобы убедиться, что достигнут достаточный объем обесцвечивания, прежде чем переходить к другим этапам протокола. Кроме того, несмотря на то, что окрашивание CD45 и SMI-32 на ИГХ работает надежно, по-прежнему важно устранять неполадки с концентрацией антител в предварительных экспериментах для каждой новой партии антител. Это можно сделать путем тестирования различных концентраций антител на положительном контрольном участке (ЭАЭ спинного мозга). Окрашивание в первый раз также должно включать отрицательный контроль, который состоит только из вторичных антител без добавления первичных антител. Наконец, при анализе изображений очень важно определить пороговые значения для отдельных изображений, так как окрашивание может быть неравномерным на разных предметных стеклах или участках.
Этот протокол использует свободно доступное программное обеспечение. Если у кого-то нет доступа к процессору, встраивателю или микротому, эти шаги могут быть переданы в больничный патологоанатомический центр, который предлагает эти услуги. Кроме того, если у вас нет доступа к сканеру слайдов, вы можете использовать световой микроскоп, оснащенный видеокамерой, для сохранения изображений TIFF спинного мозга или головного мозга. Для работы под микроскопом необходимо получить срезы LFB или LFB/H&E при низкой мощности (40-кратное увеличение), а при окрашивании CD45 и SMI-32 — не менее четырех окон, расположенных по центру в вентральном, дорсальном и латеральном отделах спинного мозга (200-кратное увеличение для CD45 и 400-кратное увеличение для SMI-32). Анализ изображений может быть выполнен на этих изображениях для количественной оценки окрашивания аналогичным образом, как описано.
Решение о том, какой гистологический подход использовать для оценки ЭАЭ, зависит от того, насколько сильно различаются клинические показатели в разных группах. Например, если существуют резкие различия в клинических показателях ЭАЭ (одна группа получила ЭАЭ, а другая нет), это обычно связано с различиями в периферическо-опосредованном воспалении. В этом случае достаточно оценки наличия демиелинизирующих поражений на срезах, окрашенных LFB/H&E, и позволит выявить различия между группами. Если группы более похожи по клиническим показателям в начале заболевания, а вместо этого есть различия в степени клинического выздоровления (например, эксперимент на рисунке 5А), лучше всего применить полный гистологический рабочий процесс, описанный здесь, включая оценку воспаления мозга в стволе мозга и мозжечке, чтобы определить, связаны ли различия в хроничности заболевания с различиями в воспалении или повреждении тканей. Если будут обнаружены различия в воспалении, оцениваемые с помощью подсчета CD45, могут быть проведены дальнейшие исследования ИГХ для окрашивания на Т-клетки (анти-CD3), инфильтрирующие моноциты/макрофаги (Mac3) и микроглию (Iba-1/TMEM119) (рекомендуемые клоны антител приведены в дополнительной таблице 3). Активация микроглии отражается в увеличении интенсивности окрашивания Iba-1 на микроглии Iba-1+TMEM-19+ с двойной метеной и увеличении ретракции процессов микроглии, что может быть оценено с помощью анализа Шолля на срезах32. Кроме того, такие методы, как проточная цитометрия или секвенирование одноклеточной РНК, могут быть применены для проведения более глубокой характеристики частоты и фенотипа иммунных популяций в головном и спинном мозге.
Подсчет аксонов SMI-32+ является чувствительным методом для выявления повреждения аксонов в EAE32,33 и в MS34. SMI-32, который обнаруживает нефосфорилированную форму тяжелых или средних нейрофиламентов, накапливается в концевых луковицах пересекающихся нейронов. Альтернативой для обнаружения поврежденных аксонов является окрашивание белком-предшественником амилоида (APP), который может накапливаться в аксонах в результате нарушения транспорта аксонов33. Характер окрашивания для SMI-32 и APP, хотя оба отражают повреждение аксонов, обычно не перекрываются, что указывает на то, что они выявляют различные патологии33. Можно также дополнить гистологические измерения повреждения аксонов измерением sNF-L, который является быстрым и чувствительным показателем продолжающегося повреждения аксонов как в спинном, так и в головном мозге. Его преимущество заключается в том, что это можно сделать за полдня на живых мышах. Недостатком этого метода является то, что комплекты дорогие, а станок узкоспециализированный. Компания, которая продает комплект sNF-L, предлагает плату за обслуживание для тех, у кого нет доступа к машине SIMOA. Альтернативой оценке повреждения аксонов является оценка потери аксонов путем подсчета аксонов в окрашенных толуидиновым синим участках спинного мозга12 или подсчета пучков нейрофиламентов, обнаруженных SMI-31 в областях белого вещества спинного мозга32. Оба эти подхода являются более трудоемкими, чем измерение SMI-32 или sNF-L.
Если клинические показатели ЭАЭ различаются между группами, но оценка по воспалению, демиелинизации и повреждению аксонов не выявляет различий между группами, может быть полезно окрасить астроциты для активации с помощью GFAP (см. Дополнительную таблицу 3 для рекомендуемого клона антител). Активация астроцитов связана с увеличением окраски GFAP, и было показано, что это коррелирует с прогрессированием ЭАЭ в некоторых моделях ЭАЭ, включая хроническую ЭАЭ у крысы DA35.
В заключение, в этом протоколе описаны методы и представлен рабочий процесс анализа для проведения гистологической оценки ЭАЭ.
Disclosures
Шеннон Данн консультирует FSD Lucid Psycheceuticals.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Раймонда Собела (Стэнфордский университет) за то, что он показал нам свой метод проведения срезов головного и спинного мозга. Мы благодарим Кайла Робертона (Kyle Roberton) и Милана Гангули (Milan Ganguly) из Центра феноменомики Торонто (Toronto Centre for Phenogenomics) за то, что они изучили метод встраивания и вырезали так много участков головного и спинного мозга. Мы благодарим д-ра Мэтью Кассика и д-ра Роберта Фудзинами (Университет штата Юта) за то, что они поделились своими протоколами оценки субменингеального и периваскулярного воспаления в спинном мозге. Мы благодарим Шалину Усман за то, что она поделилась клоном антитела к CD45. Мы благодарим Сиофан Лу за обучение работе с тканевым процессором и станцией встраивания тканей, а также за обслуживание этого оборудования в Исследовательском центре биомедицинских исследований Кинана при больнице Святого Михаила. Эта работа была поддержана биомедицинским грантом от MS Canada (для SED). Кармен Уччиферри получает стипендию от правительства Канады. Нурия Альварес-Санчес получает постдокторскую стипендию Кинана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
| 1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
| 15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
| 500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
| 92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
| 95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
| ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
| Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
| Biosafety Cabinet | Any | ||
| Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
| DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
| ddH2O | - | - | |
| Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
| Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
| Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
| Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
| Fumehood | Any | ||
| Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
| Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
| Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
| Light microscope | Any | ||
| Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
| Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
| M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
| Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
| Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
| Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
| Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
| Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
| NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
| Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
| Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
| Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
| OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
| p1000 Pipette and Tips | various | ||
| p200 Pipette and Tips | various | ||
| Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
| pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
| Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
| Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
| Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
| Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
| Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
| Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
| Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
| Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
| SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
| Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
| Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
| Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
| Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
| Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
| Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
| Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
| X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
| Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
| Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
| Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
| Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
| Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408--129 | Used to store mouse serum samples |
| Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
| Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |
References
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
- Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144 (2022).
- Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
- Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
- Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836 (2022).
- Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866 (2022).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194 (2019).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
- Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
- Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
- Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431 (2021).
- Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864 (2020).
- Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419 (2021).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
- Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
- Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
- D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439 (2016).
- Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
- Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
- Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425 (2021).
- Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
- Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).
