Summary
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) dient als een diermodel van multiple sclerose. Dit artikel beschrijft een benadering voor het scoren van ruggenmergontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel bij EAE. Daarnaast wordt een methode gepresenteerd om oplosbare neurofilamentlichtniveaus in het muizenserum te kwantificeren, waardoor de beoordeling van axonaal letsel bij levende muizen wordt vergemakkelijkt.
Abstract
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een veelvoorkomend immuunmodel van multiple sclerose (MS). Deze ziekte kan bij knaagdieren worden geïnduceerd door actieve immunisatie met eiwitcomponenten van de myelineschede en het adjuvans van Complete Freund (CFA) of door de overdracht van myeline-specifieke T-effectorcellen van knaagdieren die zijn geprimed met myeline-eiwit/CFA naar naïeve knaagdieren. De ernst van EAE wordt doorgaans gescoord op een 5-punts klinische schaal die de mate van oplopende verlamming meet, maar deze schaal is niet optimaal voor het beoordelen van de mate van herstel van EAE. Klinische scores blijven bijvoorbeeld hoog in sommige EAE-modellen (bijv. myeline-oligodendrocytglycoproteïne [MOG] peptide-geïnduceerd model van EAE) ondanks het verdwijnen van de ontsteking. Het is dus belangrijk om de klinische score aan te vullen met histologische scores van EAE, wat ook een middel biedt om de onderliggende mechanismen van cellulaire beschadiging in het centrale zenuwstelsel (CZS) te bestuderen.
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd om ruggenmerg- en hersensecties van muizen voor te bereiden en te kleuren en om ontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel in het ruggenmerg te scoren. De methode voor het scoren van leukocyteninfiltratie in het ruggenmerg kan ook worden toegepast om hersenontsteking bij EAE te scoren. Er wordt ook een protocol beschreven voor het meten van oplosbaar neurofilamentlicht (sNF-L) in het serum van muizen met behulp van een Small Molecule Assay (SIMOA)-assay, die feedback geeft over de omvang van de algehele CZS-schade bij levende muizen.
Introduction
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende muizenmodel voor de demyeliniserende ziekte bij de mens, Multiple Sclerose (MS)1. Klassieke MS-inflammatoire pathologie, waaronder de infiltratie van IFN-γ (gamma) en IL-17-producerende T-helpercellen2, de infiltratie van inflammatoire monocyten3, de vorming van perivasculaire en submeningeale inflammatoire demyeliniserende laesies4, en het optreden van axonletsel4 in het centrale zenuwstelsel (CZS), wordt ook waargenomen bij EAE 5,6,7,8,9 . De gelijkenis in immuunmechanismen tussen EAE en MS heeft EAE tot een geschikt preklinisch model gemaakt voor het testen van de werkzaamheid en werkingsmechanismen van een aantal goedgekeurde immuungebaseerde therapieën voor MS, waaronder natalizumab, fingolimod, dimethylfumaraat en glatirameelacetaat (besproken in 1,5). Bepaalde EAE-regimes modelleren andere aspecten van progressieve MS-pathologie dan axonaal letsel, waaronder de ontwikkeling van submeningeale ontsteking in de hersenen, chronische demyelinisatie, atrofie van het ruggenmerg, synaps en verlies van neuronen 6,10,11,12. EAE heeft dus nut voor het screenen van de werkzaamheid van neuroprotectieve therapieën voor MS.
EAE wordt op verschillende manieren geïnduceerd bij knaagdieren. Actieve immunisatie is de meest gebruikelijke inductiemethode en omvat immunisatie van knaagdieren met myeline-antigenen (hele eiwitten of peptiden) geëmulgeerd in CFA, aangevuld met hittegedode Mycobacterium tuberculosis13. Afhankelijk van de muizenstam wordt kinkhoesttoxine (PTX) ook toegediend op dag 0 en dag 2 van immunisatie om de penetrantie van ziekte te verhogen13. EAE kan ook worden geïnduceerd door myeline-specifieke T-cellen verkregen van myeline/CFA-geprimeerde muizen adopterend over te brengen naar gezonde muizen14 of kan zich spontaan ontwikkelen bij muizen die T-celreceptoren tot overexpressie brengen die specifiek zijn voor de belangrijkste myeline-antigenen5.
De ernst en progressie van de EAE-ziekte worden gewoonlijk gescoord met behulp van een discrete 5-punts klinische schaal: 1 – slapheid van de staart, 2 – zwakte van de achterpoten of voeten, 3 – volledige verlamming van een of beide achterpoten, 4 – zwakte van de voorpoten, 5 – stervende of dood13. Dit klinische scoresysteem is goed in het documenteren van de progressie van oplopende verlamming die optreedt bij het begin van de ziekte, maar is minder gevoelig voor het vastleggen van de mate van herstel van CZS-ontstekingsaanvallen. Zowel muizen die moeilijk lopen als muizen die gemakkelijk lopen maar een zwakke voet vertonen, krijgen bijvoorbeeld een score van 2 op de EAE-schaal. Scores kunnen hoog blijven in de postacute fase van EAE vanwege de aanwezigheid van permanent axonletsel of -verlies, zelfs ondanks het verdwijnen van de ontstekingsreactie9. Er zijn verschillende pogingen gedaan om meer verfijnde scoresystemen, gedragstests, metingen van achterpoten en grijpkracht en infraroodbewakingssystemen te ontwikkelen om verschillen in klinische tekorten in EAE 9,16,17,18 beter vast te leggen; Deze meer ingewikkelde scoremetingen maken echter geen onderscheid tussen de bijdrage van ontsteking versus weefselbeschadiging aan de onderliggende neurologische tekorten. De gouden standaardbenadering om de ernst van EAE te scoren, is dus om zowel klinische als histologische scores uit te voeren.
Hier wordt een protocol beschreven voor het ontleden en inbedden van ruggenmerg- en hersenmonsters van muizen in paraffine op een manier die het stochastische proces van laesievorming dat optreedt bij EAE vastlegt. Er wordt ook een protocol gepresenteerd voor het beitsen van secties met Luxol fast blue (LFB), oorspronkelijk gemaakt door Kluver en Barrera19, dat myeline in het CZS detecteert. Secties worden ofwel gekleurd met alleen LFB (voor demyelinisatieanalyse) of worden tegengekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) om ontstekingslaesies te visualiseren en te scoren. Er worden ook protocollen verstrekt om de aanwezigheid van totale leukocyten (CD45), het verlies van myeline en het aantal gewonde axonen (SMI-32) in het ruggenmerg te kwantificeren met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen, immunohistochemische (IHC) technieken en openbaar toegankelijke software. Het protocol dat wordt gebruikt om leukocyten in het ruggenmerg te kwantificeren, kan ook worden toegepast om leukocyten in de hersenen te kwantificeren.
Histologische evaluatie van axonaal verlies en letsel in de hersenen is relatief moeilijker dan in het ruggenmerg, omdat de wittestofbanen van de hersenen niet parallel aan elkaar lopen. De meting van serum neurofilament licht (sNF-L) is naar voren gekomen als een veelbelovende biomarker voor neuronale beschadiging bij MS20,21. Recente studies hebben deze technologie uitgebreid tot EAE 22,23,24. Hier wordt een methode gepresenteerd om serum neurofilament licht (sNF-L) te meten bij levende muizen met behulp van een Small Molecule Assay (SIMOA) assay. Deze methode vereist slechts een kleine hoeveelheid serum en kan in slechts een halve dag bij levende muizen worden uitgevoerd, waardoor snelle feedback wordt gegeven over hoe een geteste therapie het algehele CZS-letsel beïnvloedt. Alle methoden die hier worden beschreven, kunnen worden toegepast op muizen van elk geslacht of stam.
Protocol
Alle experimenten die met muizen werden uitgevoerd, werden uitgevoerd volgens protocollen voor diergebruik die zijn goedgekeurd door het Unity Health Toronto Animal Care Committee, volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. Zorg ervoor dat u tijdens de laboratoriumprocedures een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril draagt.
1. Oogsten en fixeren van de hersenen en het ruggenmerg
- Euthanaseer de muis volgens het institutionele beleid. Leg de muis liggend op een snijtafel en onthoofd hem met een chirurgische schaar (naar beneden knippen).
- Gebruik een Adson-pincet (in niet-dominante hand) om de huid op de bovenkant van het hoofd van de muis vast te pakken. Maak vervolgens met een chirurgische schaar een incisie van 2,5 cm in de huid aan de bovenkant van het hoofd.
- Gebruik vingers om de huid op het hoofd zijdelings te duwen om de onderliggende schedel te visualiseren.
- Stabiliseer het hoofd van de muis door de oogkassen vast te pakken met een standaard Adson-pincet.
- Maak met een fijne schaar (dominante hand) kleine knipsels in de schedel langs de middellijn van de cervicale wervelkolom naar de bulbus olfactorius.
OPMERKING: Plaats slechts een paar millimeter schaarpunten tegelijk onder de schedel om beschadiging van de onderliggende hersenen te voorkomen. - Gebruik een Adson-pincet met tanden om de schedel lateraal te reflecteren om de onderliggende hersenen te onthullen.
- Houd het hoofd vast met de niet-dominante hand. Houd de schaar gesloten (dominante hand), schep het ruggenmerg uit de cervicale wervelkolom en duw de hersenen voorzichtig uit de schedel, waarbij de hersenzenuwen worden doorgeknipt.
- Plaats de hersenen in een conische buis met 10 ml 10% neutraal gebufferde formaline die is gelabeld met de ID van het dier.
- Snijd de vacht langs de middellijn van de romp van de muis van de nek tot de staart.
- Gebruik vingers om de huid zijwaarts te duwen om de wervelkolom te visualiseren.
- Knip met een chirurgische schaar naar beneden door de wervelkolom ter hoogte van de dijbenen die aan de heup vastzitten.
- Gebruik een chirurgische schaar om de lichaamswand aan weerszijden van de wervelkolom van de heup tot de nek door te knippen. Knip alle aangehechte organen weg.
- Plaats de wervelkolom met het ruggenmerg in dezelfde buis met formaline die de hersenen bevat. Laat de hersenen en de wervelkolom 5-7 dagen fixeren.
OPMERKING: De timing van fixatie is belangrijk. Sommige antilichamen werken niet als het weefsel te veel is gefixeerd. Als het weefsel te weinig gefixeerd is, is het moeilijk om het ruggenmerg in stap 2 uit de wervelkolom te extruderen.
2. Bruto en verwerking van het ruggenmerg en de hersenen
NOTITIE: De volgende stappen vinden plaats in een zuurkast. Bereid voor aanvang 2 schone petrischaaltjes van 10 cm, een erlenmeyer met een trechter bekleed met filtreerpapier, twee scalpels (één voor het snijden van bot en één voor het snijden van CZS-weefsels), lenspapier, een potlood, insteekcassettes en monsterpotten die vooraf zijn gevuld met 10% formaline.
- Knip met een schaar een klein stukje lenspapier (even breed maar twee keer zo lang als de cassette) en plaats het in een petrischaaltje.
- Label een plastic cassette met de monster-ID met een potlood.
- Giet de buis met de vaste hersenen en ruggengraat in de trechter. Breng de ruggengraat en hersenen over naar de lege petrischaal.
OPMERKING: De gebruikte formaline wordt doorgesijpeld in de erlenmeyer en kan bij stap 2.13 opnieuw worden gebruikt. - Verdeel de hersenen grofweg in zes coronale stukken met behulp van een scalpel. Maak een snede caudaal naar het cerebellum, een in het midden van het cerebellum, een net rostraal naar het cerebellum en twee sneden in de resterende rostrale hersenen, waardoor 3 extra coronale plakjes van gelijke dikte ontstaan.
- Breng met een pincet hersenmonsters over op de ene helft van het lenspapier in de petrischaal.
- Snijd het ruggenmerg in drie stukken met behulp van de scalpel: de eerste snede wordt gemaakt aan de onderkant van de ribbenkast en de tweede snede wordt gemaakt net onder de kromming in de cervicale wervelkolom.
- Knip met hetzelfde scalpel het stuk van de sacrale wervelkolom aan het caudale uiteinde af totdat het ruggenmerg kan worden gevisualiseerd.
- Pak de thoracale wervelkolom op (niet-dominante hand). Houd de Adson-pincet vast met de tanden stevig gesloten (dominante hand) en duw het uiteinde van de pincet voorzichtig in de kleinere opening van de wervelkolom met een zachte draaiende beweging. Het snoer moet aan het andere uiteinde tevoorschijn komen.
OPMERKINGEN: Elk instrument met een rond uiteinde ter grootte van het ruggenmerg zal voor dit doel werken. Als het ruggenmerg niet op natuurlijke wijze naar buiten springt, forceer het dan niet. Gebruik in plaats daarvan een fijne schaar om de botten langs de zijkant van de wervelkolom te knippen en open te reflecteren om het ruggenmerg te onthullen. U kunt ook het ruggenmerg en de hersenen nog een paar dagen in formaline fixeren; Dezelfde fixatietijd moet echter op alle monsters worden toegepast om variabiliteit in de kleuring van antilichamen te voorkomen. - Pak de standaard Adson-pincet (dominante hand). Terwijl u het stuk ruggenmerg nog steeds vasthoudt met de minder dominante hand, gebruikt u een pincet om het tevoorschijn gekomen koord voorzichtig uit de kolom te trekken. Plaats het stuk ruggenmerg in de petrischaal met daarin het lenspapier.
- Herhaal dit proces voor de lumbale/sacrale en cervicale kolomstukken.
- Verdeel de drie stukken ruggenmerg (cervicaal, thoracaal, lumbaal/sacraal) met een scalpel in kleinere stukken dwarsdoorsnede. Snijd ten minste 15 segmenten, die elk minder dan 2 mm dik moeten zijn.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de segmenten korter zijn dan breed, waardoor de secties gemakkelijker in doorsnede vallen tijdens het inbeddingsproces in stap 3. - Schik de stukjes ruggenmerg op dezelfde helft van het lenspapier met hersenstukken. Vouw het lenspapier om de stukjes tissue te sandwichen en plaats dit in de gelabelde cassette.
NOTITIE: Het lenspapier voorkomt dat kleine stukjes tissue tijdens de verwerking uit de cassette ontsnappen. - Breng de cassette over in een monsterpot met gerecyclede of verse formaline.
- Herhaal stap 2.1–2.13 voor de overige preparaten.
- Breng na 5-7 dagen fixatie de cassettes over van de monsterhouder in het eerste formalinebad in de automatische weefselprocessor (zie Materiaaltabel). Laat de weefselprocessor 's nachts draaien volgens het programma dat wordt beschreven in aanvullende tabel 1. Monsters worden in warme paraffinewas gehouden totdat ze worden ingebed.
3. Inbedden en snijden van hersen- en ruggenmergsecties
- Breng de cassettes over van de processor naar de warme bewaarkamer van het paraffine-inbeddingsstation (zie Materiaaltabel).
- Veranker de dwarsdoorsneden van het ruggenmerg en de hersenen van elke muis als volgt in een enkel paraffineblok (Figuur 1):
- Giet eerst paraffinewas om de bodem van de mal te bedekken. Plaats met een fijne pincet de dwarsdoorsnede van de hersenen en het ruggenmerg in de paraffine op de bodem van de mal.
- Breng de mal enkele seconden over naar het koeloppervlak om de hersen- en ruggenmergstukken op hun plaats te fixeren. Verplaats de vorm terug naar het verwarmde oppervlak en vul deze tot aan de bovenkant met hete paraffine.
- Plaats het cassettedeksel (dat is gelabeld met specimen-ID) bovenop de mal. Giet meer paraffine bovenop het cassettedeksel. Breng de mal over naar het koelstation om de was te laten uitharden (laat 30-60 minuten afkoelen).
OPMERKING: Het inbedden van ruggenmergsecties vereist oefening. Om het succes te vergroten, gebruikt u kortere lengtes van het ruggenmerg (<2 mm), omdat deze meer kans hebben om in dwarsdoorsnede te vallen. Chirurgische oogloepen kunnen worden gedragen om te helpen onderscheiden of stukken ruggenmerg in dwarsdoorsnede zijn. - Monteer het paraffineblok op een roterende microtoom. Knip het blok bij totdat de weefsels van belang verschijnen in de paraffinesectie.
- Knip linten van 5 μM van secties van elk blok en breng ze over in een waterbad van 42 °C.
- Verzamel secties op objectglaasjes en plaats dia's in een glazen objectglaasjesrek.
- Bak de partjes op 37 °C een nacht in een droge oven. Koel de dia's af voordat u doorgaat met kleuren.
4. Deparaffinisatie en rehydratatie van secties ter voorbereiding op kleuring
NOTITIE: Stappen worden uitgevoerd in een zuurkast. Voordat u begint, bereidt u baden met oplosmiddelen voor. Bereid 5 L 1x PBS (1 L ddH2O, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4; pH = 7,4) met 0,05% Tween-20 (PBS-T) voor alle wasstappen.
- Deparaffiniseer door objectglaasjes in twee opeenvolgende baden met xyleen of een oplosmiddel op basis van niet-xyleen op een shaker te plaatsen gedurende 5 minuten elk met zachte beweging.
- Rehydrateer weefsels door objectglaasjes over te brengen door opeenvolgende baden met dalende percentages ethanol: 2 x 100% ethanol (elk 5 min), 2 x 95% ethanol (elk 3 min) en 1 x 70% ethanol (3 min). Houd 95% ethanol vast voor LFB-kleuring, en rehydrateer tot 70% ethanol, en houd PBS-T vast voor immunohistochemie (IHC).
5. LFB voor myeline met H&E
- Bereid een oplossing van 0,1% LFB (0,2 g LFB, zie materiaaltabel, 200 ml 95% ethanol, 0,5 ml ijsazijn). Meng en filtreer in een erlenmeyer. Bewaar in een donkere fles tot gebruik.
- Breng secties van 95% ethanol over in een glasglaasjesrek dat in een kleurschaal met LFB wordt geplaatst. Dek de schaal af en sluit af met paraffinefolie om verdamping te voorkomen.
- Incubeer secties bij 56 °C oven gedurende een nacht (maximaal 16 uur).
- Breng de volgende ochtend de glijders over in een ddH2O-bad en houd ze vast.
- Bereid ondertussen (1) verse 0,05% lithiumcarbonaatoplossing (0,05 g lithiumcarbonaat, 100 ml ddH2O); (2) Eosine Y-oplossing (voeg 2 g eosinezout toe aan 40 ml ddH20 en meng tot het is opgelost en meng vervolgens met 160 ml 95% ethanol).
- Bereid de volgende baden voor: 1 x lithiumcarbonaat, 3 x 70% ethanol, 3 x 95% ethanol, 2 x 100% ethanol, 3 x ddH20. Plaats de baden in volgorde van gebruik (zie aanvullende tabel 2).
- Volg de stappen zoals beschreven in aanvullende tabel 2.
- Nadat de objectglaasjes droog zijn, visualiseert u de demyeliniserende laesies onder de microscoop.
6. LFB voor myeline zonder H&E
- Voer deze kleuringsprocedure uit voor de analyse van myeline.
OPMERKING: De procedure is identiek aan stap 5 (zie aanvullende tabel 2), maar heeft een verkorte workflow. Ga na stap 4 verder met de procedure vanaf stap 10.
7. Antigeenextractie en peroxidase-afschrikking voor immunohistochemische (IHC) kleuringen
NOTITIE: Bereid voordat u begint 100 ml waterstofperoxide in methanol (1 deel 30% waterstofperoxide-oplossing in 9 delen 100% methanol, in een zuurkast). Bereid 1 l 10 mM citraatbuffer met Tween-20 (2,94 g trinatriumcitraat, opgelost in 1 l ddH20 in een bekerglas op roerplaat, breng de pH op 6,0 en voeg 500 μl Tween-20 toe). Bereid PBS-T voor (zie stap 4). Alle wasbeurten worden gedaan in baden van PBS-T met zachte agitatie (op een shaker), tenzij anders aangegeven.
- Blus endogeen peroxidase door objectglaasjes in 3% waterstofperoxide in methanol te plaatsen gedurende 15 minuten (in een zuurkast). Was de glaasjes twee keer in PBS-T (elk 2 minuten).
- Breng de objectglaasjes over naar een metalen objectglaasjeshouder en plaats ze in 1 L citraatbuffer in een snelkookpan. Sluit het deksel af en plaats een rubberen stop aan de bovenkant van de stoomontsnapping.
- Kook op hoog in de magnetron tot het gele lipje op de snelkookpan omhoog komt, wat aangeeft dat de maximale druk is bereikt. Kook nog eens 5 minuten op maximale druk en haal vervolgens de snelkookpan uit de magnetron met beschermende handschoenen.
- Maak de druk lager door de stop te verwijderen. Verwijder het deksel en laat de glaasjes 20 minuten afkoelen in de citraatbuffer en ga dan verder met de gewenste kleurmethode.
LET OP: Ga achteruit bij het laten ontsnappen van de stoom, aangezien dit brandwonden kan veroorzaken.
8. CD45 immunohistochemie
OPMERKING: Deze IHC-methode wordt gebruikt om infiltrerende leukocyten te visualiseren. De avidine/biotine-blokkerende stappen worden gecombineerd met de blokkerende en primaire antilichaam-incubatiestappen.
- Bereid blokkerende buffer voor (2% BSA, 2% konijnenserum in 1x PBS).
- Breng de objectglaasjes over naar de glazen glaasjesbak en was ze twee keer met PBS-T (elk 2 minuten). Bereid avidine/blokkerende oplossing (4 druppels/ml avidine in 2% BSA/2% konijnenserum in 1 x PBS, zie Materiaaltabel).
- Droog overtollig PBS-T rond het weefsel af met behulp van een papieren zakdoekje. Teken met een hydrofobe pen een cirkel rond het weefsel en plaats het glaasje in de vochtige kamer.
- Breng avidine/blokkeringsoplossing aan op elke sectie (400 μL/objectglaasje).
- Dek de vochtige kamer af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens deze stap anti-CD45-antilichaam (aanvullende tabel 3) in een blokkeerbuffer die biotine bevat (4 druppels/ml biotine, 2% BSA/2% konijnenserum in 1x PBS).
- Tik de blokkerende oplossing van het glaasje af op een pluisvrij laboratoriumdoekje. Dep rond het weefsel met een laboratoriumdoekje om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Plaats het glaasje terug in een vochtige kamer. Voeg 400 μL CD45-antilichaamoplossing (zie Materiaaltabel) toe aan de sectie. Incubeer een nacht bij 4 °C in een afgedekte, vochtige kamer.
- Giet de volgende dag het primaire antilichaam af en was de objectglaasjes 3 x in PBS-T (elk 5 minuten).
- Droog het gebied rond de sectie met behulp van een pluisvrij laboratorium en voeg vervolgens 400 μL secundair antilichaam (1:200 verdunning in blokkeerbuffer) toe aan elke sectie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid ondertussen ABC-reagens (zie Materiaaltabel) door 2 druppels reagens A toe te voegen aan 5 ml 1x PBS en meng. Voeg 2 druppels reagens B toe aan dezelfde oplossing en meng (bereid ~30 min voor gebruik).
- Was de objectglaasjes in 3 wisselingen van 1x PBS-T (elk 5 min) en plaats de glaasjes in een vochtige kamer.
- Voeg 400 μL ABC-reagens toe aan secties. Dek de vochtige kamer af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de glaasjes in 3 wisselingen van 1x PBS-T (elk 5 min). Bereid intussen een geschikte hoeveelheid DAB-oplossing in een met folie bedekte centrifugebuis van 15 ml volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Neem een dia en concentreer je op een dwarslauw onder een microscoop. Voeg 400 μL DAB toe aan het glaasje en start de labtimer.
- Visualiseer de sectie terwijl deze zich ontwikkelt en stop de timer wanneer leukocyten bruin zijn. Breng het glaasje over in een bad ddH20 om de reactie te stoppen. Houd 5 minuten in water. Dezelfde ontwikkeltijd wordt gebruikt voor de overige dia's.
LET OP: DAB is kankerverwekkend. Gooi DAB-afval en post-DAB ddH2O weg als gevaarlijk afval. - Tegenbeitsglaasjes met Mayer's Hematoxyline gedurende ~4-10 min (zie aanvullende tabel 2). Spoel de glaasjes 10 minuten af onder stromend kraanwater.
- Dehydrateer in 95% ethanol (1 x 3 min), gevolgd door absolute 100% ethanol (elk 2 x 3 min).
- Plaats de objectglaasjes in een zuurkast en breng ze gedurende 5 minuten over in xyleen of een xyleenvervangend oplosmiddel. Afdekglaasje met montagemedium en laat de glaasjes 1-2 dagen drogen in de zuurkast.
LET OP: Als u xyleen gebruikt, gebruik dan dubbele handschoenen en een pincet om dia's te hanteren bij het wegglijden van de hoes, aangezien dit giftig is en handschoenen kan oplossen. - Reinig de glaasjes met xyleen en scan ze met een diascanner met een vergroting van 20x.
9. SMI-32 IHC voor axonale schade
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een SMI-32-antilichaam van muizen, dat reageert tegen niet-gefosforyleerd neurofilament zwaar, dat zich kan ophopen in gewondeaxonen 25. Aangezien dit antilichaam in muizen is verhoogd en een muizenantigeen detecteert, wordt aanbevolen om een Mouse on Mouse (MOM)-kit te gebruiken. In deze procedure wordt de stap voor het blokkeren van avidine/biotine uitgevoerd als een afzonderlijke stap van de primaire incubatie van antilichamen. Voordat u met dit protocol begint, moet u deparaffiniseren, rehydrateren, de endogene peroxidase-activiteit doven en antigeenextractie uitvoeren zoals beschreven in stap 4 en stap 7.
- Was secties twee keer met 2 x PBS-T (elk 2 min). Verwijder extra vloeistof rond secties met behulp van een laboratoriumtissue en teken een cirkel rond weefsels met een hydrofobe pen.
- Voeg 400 μL blokkeerbuffer (2% (m/v) geitenserum in 1x PBS-T) met avidine (4 druppels/ml) toe aan de secties. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Doop de glaasjes twee keer in 1x PBS-T. Voeg 400 μL blokkeerbuffer met biotine (4 druppels/ml) toe aan het objectglaasje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de glaasjes in een 1 x PBS-T bad gedurende 2 min. Bereid ondertussen MOM-blokkerend reagens voor door 2 druppels stockoplossing (zie materiaaltabel) toe te voegen aan 2,5 ml 1x PBS.
- Voeg 400 μL MOM-reagens toe aan de sectie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de glaasjes twee keer in een 1x PBS-T bad gedurende 2 min. Bereid ondertussen MOM-verdunningsmiddel door 300 μL eiwitconcentraatvoorraadoplossing toe te voegen aan 3,75 ml 1x PBS.
- Voeg 400 μL MOM-verdunningsmiddel toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verdun ondertussen het SMI-32-antilichaam (zie materiaaltabel) in het MOM-verdunningsmiddel.
- Tik het verdunningsmiddel van de objectglaasjes af en voeg 400 μL SMI-32-antilichaamoplossing toe aan het gedeelte. Dek de vochtige kamer af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de glijders twee keer in een 1x PBS-T-bad gedurende 2 minuten, elk met zachte beweging. Verdun ondertussen MOM anti-muis IgG werkreagens in het verdunningsmiddel (10 μL bouillon in 2,5 ml verdunningsmiddel).
- Voeg 400 μL anti-muis IgG-werkreagens per glaasje toe. Incubeer gedurende 10 min.
- Was de glijders twee keer in een 1x PBS-T-bad gedurende elk 2 minuten. Ga door met kleuring volgens de stappen die worden beschreven in het CD45-kleuringsprotocol (stap 8.11 – 8.19).
10. LFB- en H&E-score voor de aanwezigheid van demyeliniserende laesies
OPMERKING: Het volgende is een analysebenadering die kan worden toegepast om snel inzicht te krijgen in de ernst van inflammatoire demyelinisatie. Deze analyse wordt uitgevoerd in secties van de navelstreng die op verschillende niveaus worden bemonsterd (cervicaal, thoracaal en lumbaal, ten minste 3 secties per/niveau). Raadpleeg de Allen Brain Atlas for Mouse spinal cord26 om het anatomische niveau van het ruggenmerg te helpen identificeren. Voor deze analyse zijn TIFF-bestanden nodig. Als gescande afbeeldingen de indeling .czi hebben, volgt u de instructies in aanvullende tabel 4 om czi-bestanden te converteren naar TIFF-bestanden.
- Open de TIFF-afbeelding van de sectie die moet worden geanalyseerd door het bestand naar de ImageJ te slepen en neer te zetten. Observeer de doorsnede van het ruggenmerg in 4 kwadranten: dorsaal, links lateraal, rechts lateraal en anterieur (Figuur 2A,B).
- Score voor de aanwezigheid van demyeliniserende laesies in elk kwadrant zoals weergegeven in figuur 2.
OPMERKING: De aanwezigheid van een laesie resulteert in een score van 1 in dat kwadrant, voor een totaal van 4 mogelijke punten per sectie. Een score van 1 wordt toegekend, zelfs als er meerdere laesies binnen een kwadrant zijn. - Tel alle punten voor elke muis bij elkaar op en deel dit door het totale aantal bemonsterde kwadranten om de fractie kwadranten met submeningeale laesies te verkrijgen.
11. Berekening van de oppervlaktefractie van LFB-kleuring in de witte stof van het ruggenmerg
OPMERKING: Deze analyse meet het percentage gebiedsfractie van de witte stof van het ruggenmerg dat is gekleurd met LFB.
- Open een LFB-gekleurde sectie die is opgeslagen als een TIFF-bestand door het bestand naar ImageJ te slepen of neer te zetten.
- Klik op Afbeelding > Typ > 8-bits om een afbeelding in grijswaarden te maken. Klik op Afbeelding > pas > drempel aan. Pas de onderste schuifregelaar zo aan dat de rode overlay alle donkere gebieden (myeline) opvangt die met het oog worden gezien (Figuur 2C-E). Klik op Toepassen.
- Klik op Analyze > Tools > ROI Manager om de ROI Manager te openen.
- Selecteer het tekengereedschap voor polygonen op de werkbalk van ImageJ. Met dit tekengereedschap kan men met de computermuis een gebied van het ruggenmerg schetsen.
- Maak een overzicht van het dorsale gebied van het ruggenmerg en voeg de polygoon toe aan de ROI Manager door op t op het toetsenbord te klikken.
- Omlijn het anterieure-laterale gebied van de witte stof van het ruggenmerg en voeg de polygoon toe aan de ROI-manager.
OPMERKING: Sluit bij het traceren grote bloedvaten, scheuren in het weefsel, artefacten en gebieden grenzend aan de dorsale hoorn uit (Figuur 2A,B-pijl), die normaal gesproken minder gemyeliniseerd zijn. Wees zo nauwkeurig mogelijk bij het overtrekken, aangezien het opnemen van te veel witte achtergrond de resultaten scheeftrekt. - Klik op Analyseren > Metingen instellen en selecteer Oppervlaktefractie.
- Klik op Meten in de ROI Manager. Dit geeft de fractie van het omlijnde gebied die is gekleurd met LFB.
- Kopieer de waarden vanuit het nieuw geproduceerde resultatenvak naar Excel en sluit het afbeeldingsvenster. Bereken het gemiddelde percentage fractie oppervlakte gekleurd voor de dorsale en ventro-laterale regio's. Bereken het gemiddelde hiervan om een waarde voor die sectie te krijgen.
- Herhaal stap 11.1–11.9 voor cervicale, thoracale en lumbale secties (N = 3/niveau/muis).
- Bereken het gemiddelde percentage myelinefractie voor alle secties voor elke muis. Het percentage demyelinisatie wordt geschat door het percentage gebiedskleuring af te trekken van 100.
12. Analyse van het aantal CD45+ cellen en SMI-32+ axon ovoïden
- Sleep een CD45- of SMI-32-gekleurd TIFF-afbeelding naar ImageJ. Klik op Analyseren > Schaal instellen > Globaal > OK om de schaalbalk voor alle afbeeldingen in te stellen. Merk op dat dit alleen voor de eerste afbeelding wordt gedaan.
- Selecteer het tekengereedschap voor polygonen en trek met de computermuis rond de grijze massa. Klik op Analyze > Measure en leg de resultaten vast in Excel als "Grey Matter Area".
- Terwijl de getekende veelhoek nog steeds op de afbeelding staat, verwijdert u de grijze massa uit de afbeelding door op de Delete-toets (toetsenbord) te klikken. Door deze actie hoeft alleen de witte stof te worden geanalyseerd.
- Maak een schets van het hele ruggenmerggedeelte met behulp van het veelhoektekengereedschap . Sluit alle delen van het weefsel uit die ontbreken of beschadigd zijn.
- Klik op Analyze > Measure en noteer de resultaten als "Total Tissue Area" in het Excel-bestand.
- Klik op Afbeelding > Kleur > Kleurdeconvolutie. Selecteer in het vervolgkeuzevenster Vectoren de optie H DAB. Er verschijnen drie nieuwe vensters: behoud het bruin getinte venster (DAB-kanaal) en verwijder andere afbeeldingsvensters.
- Klik op de afbeelding > pas > drempel aan. Pas de onderste schuifregelaar aan om de afbeelding te drempelen, zodat de rode overlay dezelfde hoeveelheid bruine vlekken vastlegt die met het oog worden gedetecteerd. Klik op Toepassen.
- Klik op Proces > Binary > Watershed. Vergelijk in deze stap de originele afbeelding en de binaire afbeelding om er zeker van te zijn dat ze met elkaar in overeenstemming zijn.
- Klik op Analyseren > Deeltjes analyseren. Selecteer Overlay weergeven en wijzig de instellingen: Grootte = 5 - 150 μm2, Circulariteit = 0,4 – 1. Klik op OK.
OPMERKING: Met deze instellingen kunnen afzonderlijke cellen en kleine groepen cellen die niet zijn gesplitst met de functie Watershed worden opgenomen in plaats van uitgesloten in de analyse. - Noteer in het resultatenvenster het laatste getal in de meest linkse kolom in Excel, dat het totale aantal deeltjes vertegenwoordigt. Bereken vervolgens het gebied van de witte stof (totale weefseloppervlakte – oppervlakte grijze stof in mm2). Druk het totale aantal deeltjes per gebied van de witte stof uit (aantal/mm2).
- Herhaal de stappen voor elke opgeslagen RGB-afbeelding. Zodra alle ruggenmergsecties voor één muis zijn geanalyseerd, neemt u het gemiddelde van het aantal deeltjes per mm2 weefsel voor die muis.
OPMERKING: De workflow die wordt gebruikt om leukocyten van het ruggenmerg te analyseren, kan ook worden toegepast op hersengebieden.
13. Meting van sNF-L met behulp van een SIMOA-assay
- Verzamel 100-200 μL bloed van levende muizen door saphena bloeding met behulp van capillaire microtainerbuisjes of via hartpunctie met behulp van een spuit en een naald van 25 G (terminale procedure). Breng voor dit laatste bloed over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Laat het bloed 30-60 minuten stollen bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer monsters bij 2660 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en pipetteer de bovenste fractie (serum) in een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar het serum bij -80 °C tot gebruik.
- Voorbereiding: Laat kalibratoren en regelaars (NF-light assay kit, zie Tabel met materialen) 1 uur voor gebruik opwarmen tot kamertemperatuur. Haal het enzymsubstraat (RGP) uit de koelkast en plaats het in een waterbad van 30 °C gedurende ten minste 30 min, werveling om de 10 min.
- Ontdooi de serummonsters op ijs. Eenmaal ontdooid, draai je de monsters voorzichtig in een draaikolk en centrifugeer je ze gedurende 5 minuten op 10000 x g om eventueel vuil te pelleteren.
- Laad de plaat: Draai de kalibratoren en de bedieningselementen. Plaats de kalibratoren in tweevoud, de bedieningselementen in tweevoud en serummonsters in tweevoud op de plaat met 96 putjes die bij de kit is geleverd. Serummonsters worden verdund in een verhouding van 1:3 met verdunningsmiddel in de kit. Sluit de plaat.
- Schakel de SIMOA-machine in (zie Materiaaltabel) in de volgorde computer, programma en vervolgens machine. Laat het apparaat initialiseren en voer het onderhoud aan het begin van de dag uit.
- Draai de magnetische kralen gedurende 30 s.
- Laad het tabblad Reagentia op het scherm, dubbelklik op de rekpositie waar de reagensfles moet worden geplaatst en scan vervolgens de streepjescode van de fles.
- Plaats magnetische kralen in de schudpositie op het rek (posities 1-3).
- Ga verder met het laden van de detector, het SBG-reagens en het RGP-reagens in de machine.
- Klik op instelling in de software. Zorg ervoor dat de monstermodus op de plaat staat. Geef het experiment een naam op het tabblad Uitvoeren instellen.
- Wijs de putjes op de plaat als volgt toe aan de kalibratoren: Klik op het putje en selecteer vervolgens de test. Selecteer kalibreren A en klik vervolgens op oplopend. Markeer de putten A1-8 en klik vervolgens op replicaten (2) om de coördinaten toe te wijzen voor de kalibratoren die in tweevoud moeten worden uitgevoerd. Uitvoeren met behulp van het nette protocol.
NOTITIE: Raadpleeg het analysecertificaat (website van de fabrikant) om de concentraties van elke kalibrator voor elk specifiek lotnummer te krijgen. Zodra putten zijn toegewezen, is het niet mogelijk om van dit scherm weg te navigeren zonder het werk te verliezen, totdat de plaat op zijn plaats is vergrendeld. - Wijs de voorbeelden toe aan de hand van de onderstaande stappen:
- Klik rechtsonder in het scherm op de knop om de monsters toe te wijzen. Markeer putten waar de monsters zich moeten bevinden.
- Vink de uit te voeren test uit de lijst af, kies het aantal replicaten en specificeer de ingebouwde verdunning van 4x.
- Terwijl de putjes nog steeds gemarkeerd zijn, voert u een voorvoegsel in voor de monster-ID en het startnummer en klikt u vervolgens op genereren om opeenvolgende ID's voor de monsters te produceren. Herhaal de stappen voor controlemonsters.
- Laad de plaat in de plaathouder (A1 tot A12).
- Klik in de scherminterface op gereed programmeervoorbeelden en ga verder naar het tabblad systeembronnen. Controleer of alle reagenscontainers vol zijn en of de afvalcontainers leeg zijn.
- Klik op Uitvoeren.
- Wanneer de run is voltooid, controleert u de kalibratiecurve onder het tabblad "Gegevensreductie" door de assay en plaatnaam te selecteren.
- Ga naar "Uitvoeringsgeschiedenis" en gebruik de filters om de meest recente uitvoering te vinden. Selecteer uitvoeren en vervolgens alle resultaten. Klik op exporteren en sla het .csv bestand op. Klik op rapport en selecteer vervolgens batchkalibratierapport en selecteer de recente uitvoering. Bekijk een voorbeeld van het rapport en exporteer het.
- Voer het door de fabrikant aanbevolen onderhoud aan het einde van de dag uit. Schakel het programma, de machine en vervolgens de computer uit.
Representative Results
Figuur 3 toont representatieve IHC- en histochemische kleuring, met voorbeelden van zowel acute (links) als oudere EAE-laesies (rechts). Representatieve CD45-kleuring met hematoxyline-tegenkleuring wordt weergegeven in figuur 3A,B. Figuur 3C-F toont voorbeelden van LFB-kleuring met (Figuur 3C,D) of zonder (Figuur 3E,F) de H&E-tegenkleuring. Hoewel hematoxyline niet specifiek is voor immuuncellen, kleuren de kernen van de immuuncellen donkerder en kunnen ze worden onderscheiden van CZS-residente cellen. Figuur 3G,H toont representatieve kleuring van SMI-32+ axonen, tegengekleurd met hematoxyline. Let op het toegenomen uiterlijk van deze vlek bij oudere EAE-laesies.
Beschadiging van gemyeliniseerde sporen komt het meest voor in het ruggenmerg bij actieve muizen EAE en dit is de belangrijkste oorzaak van verlamming bij deze ziekte 7,9. Het scoren op de aanwezigheid van ontsteking en weefselbeschadiging in het ruggenmerg krijgt dus prioriteit in histologische analyses. EAE-laesies komen sporadisch voor in verschillende regio's (anterieur, lateraal of dorsaal) (Figuur 2A,B) en op verschillende niveaus (sacraal, lumbaal, thoracaal, cervicaal) van het ruggenmerg. De beschreven inbeddingsmethode zorgt voor een goede bemonstering van laesies door de hele navelstreng. Er worden meer secties ingebed dan geanalyseerd, omdat sommige secties beschadigd kunnen raken tijdens het verwerkings- of sectieproces. Om representatieve bemonstering te garanderen, worden voor elke muis minimaal 3 representatieve secties geanalyseerd op cervicaal, thoracaal en lumbaal niveau van het ruggenmerg. De identiteit van elk monster is geblindeerd, zodat de persoon die de analyse uitvoert niet bevooroordeeld is bij het selecteren van representatieve secties voor analyse.
Om snel inzicht te krijgen in verschillen in de histologische ernst van EAE, kan men scoren op de aanwezigheid van submeningeale demyeliniserende laesies in ruggenmergkwadranten in geselecteerde secties (Figuur 2A,B). Dit is een snelle methode die kan worden uitgevoerd op gescande afbeeldingen of met behulp van een lichtmicroscoop. Deze analyse is gevoelig genoeg om verschillen in histologische EAE-ernst tussen groepen te detecteren wanneer EAE ernstig is in de ene groep en mild in een andere. In het experiment in figuur 4 werd EAE bijvoorbeeld geïnduceerd bij vrouwelijk wildtype (WT) en muizen met een deletie in OGR1 (OGR1 KO) met behulp van MOG p35-55/CFA plus PTX. Muizen in de WT-groep ontwikkelden ernstige EAE met volledige verlamming, terwijl de OGR1-knock-outgroep een milde ziekte ontwikkelde. Dit verschil in klinische score kwam overeen met een verschil in de fractie van kwadranten met submeningeale laesies (Figuur 4C).
Het is belangrijk om de score van demyeliniserende laesies aan te vullen met een procentuele oppervlaktefractie van myelinekleuring om de mate van verlies van myeline en/of gemyeliniseerde axonen tijdens de auto-immuunaanval vast te leggen. In het voorbeeld in figuur 4 verschilde het percentage myelinefractie ook significant tussen de OGR1- en WT-muizen (figuur 4D). Het percentage myelinefractie correleert ook significant met de cumulatieve EAE-score bij muizen met EAE (Figuur 4E) en dient daarom als een goede maat voor de algehele weefselschade bij deze ziekte. Merk op dat dit protocol geen onderscheid maakt tussen de intensiteit van de myelinekleuring. Als dit het gewenste resultaat is, moet men immunofluorescentiekleuring uitvoeren voor myeline-eiwitten zoals proteolipide-eiwit of myeline-basisch eiwit en de intensiteit van deze kleuring meten.
In het geval dat EAE ernstig is in beide vergelijkingsgroepen, zal een groter deel van de kwadranten van het ruggenmerg inflammatoire/demyeliniserende laesies bevatten. In dit geval is een gevoeligere benadering om ontsteking te scoren het tellen van het aantal CD45+- leukocyten per mm2 witte stof (zie representatieve kleuring in figuur 3A). De hier beschreven CD45-antilichaamkloon detecteert alle infiltrerende leukocyten en kleurt alleen incidentele microglia die de CD45-expressie in EAE reguleren (zie open pijl in figuur 3B) en is daarom nuttig bij het opvangen van infiltratie van perifere immuuncellen.
In EAE-onderzoeken op langere termijn (>20 dagen) wordt aanbevolen om ook een analyse van axonletsel uit te voeren. SMI-32-kleuring in ruggenmergsecties is een gevoelige methode om beschadigde axonen te detecteren. Hoewel de ontsteking in het ruggenmerg na verloop van tijd afneemt en gespaard gebleven axonen opnieuw kunnen myeliniseren, vertonen overlevende axonen een differentiële mate van restletsel9 (Figuur 3G,H). In het MOG p35-55-geïnduceerde model van EAE bij C57BL6/J-muizen is de mate van axonaal letsel en verlies bijvoorbeeld een drijvende kracht achter klinische scores nadat het ontstekingsproces is afgenomen9. Figuur 5 toont een voorbeeld hiervan in een EAE-experiment bij mannelijke en vrouwelijke muizen, WT-muizen en muizen die een tekort hebben aan een gen genaamd peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor-delta (PPAR-delta) in het myeloïde compartiment (LysMCre: Ppardfl/fl). Bij de mannetjes kregen de WT-muizen de functie van de achterpoten terug, maar de klinische scores bleven hoog in de mannelijke LysMCre: Ppardfl/fl-groep. Daarentegen, in het experiment bij de vrouwtjes, hadden beide experimentele groepen overal hoge scores. Op het eerste gezicht suggereerde dit resultaat dat PPAR-delta een seksespecifiek effect had bij EAE; pathologische scoring van het ruggenmerg onthulde echter dat muizen van beide geslachten in de LysMCre: Ppardfl/fl-groep meer axonaal letsel hadden in vergelijking met WT-tegenhangers (Figuur 5B). Een genotype-effect op klinische scores werd waarschijnlijk niet waargenomen bij vrouwtjes omdat WT-vrouwelijke muizen de neiging hadden om verhoogde axonale schade te vertonen, wat zich manifesteerde in chronische neurologische tekorten.
In ditzelfde experiment bleken vrouwelijke vrouwelijke muizen van LysMCre: Ppardfl/fl een uitgebreidere T-celinfiltratie in het cerebellum te hebben, wat een voorbeeld is van hoe het scoren van hersenontsteking nuttig kan zijn bij EAE. Bij EAE wordt ontsteking in de hersenen voornamelijk aangetroffen in het cerebellum en de hersenstam (Figuur 6A,D,G), maar kan ook worden aangetroffen in de hersenvliezen (te zien onder de hippocampus in Figuur 6C), in de buurt van de ventrikels (Figuur 6F) en andere wittestofbanen, waaronder de oogzenuw en het corpus collosum (Figuur 6B,E). Het scoren van hersenontsteking wordt gedaan in een specifiek hersengebied (bijv. cerebellaire witte stof) door het aantal CD45-cellen per mm2 weefselgebied te tellen met behulp van dezelfde methodologie als beschreven voor het ruggenmergprotocol. Bij de hier geschetste grossiemethode bevindt zich een snede in het midden van het cerebellum, die het perspectief biedt van het cerebellum en de hersenstam zoals weergegeven in figuur 6A.
Het meten van sNF-L met behulp van een SIMOA-assay is een nuttige biomarker geworden voor het beoordelen van aanhoudend axonaal letsel en reacties op therapie bij relapsing-remitting MS 20,21,27,28. Dezelfde SIMOA-testkit die wordt gebruikt om sNF-L-mensen te meten, kan worden toegepast om sNFL 22,23,24 bij muizen te meten. Om te onderzoeken hoe goed deze test presteert bij het detecteren van axonaal letsel bij EAE, werd sNF-L gemeten bij vrouwelijke C57BL6/J-muizen aan het eindpunt van een EAE-experiment en werden de niveaus vergeleken met die in op geslacht afgestemde gezonde controlemuizen die geen EAE hadden. Het bleek dat muizen met EAE veel hogere niveaus van sNF-L hadden dan bij gezonde muizen (Figuur 7A) en deze niveaus correleerden met de dichtheid van SMI-32+ axonen in het ruggenmerg (Figuur 7B). Vergeleken met histologische scores van axonaal letsel, is de SIMOA-test sneller (van bloedende muizen tot resultaten kunnen in iets meer dan een halve dag worden bereikt) en geeft daarom snelle feedback over hoe een behandeling werkt bij levende muizen. Deze test heeft ook het voordeel dat het axonaal letsel in zowel het ruggenmerg als de hersenen weerspiegelt.
Figuur 1: Representatief paraffineblok van hersen- en ruggenmergsecties. De 5 coronale hersensecties en dwarsdoorsneden van het ruggenmerg (1,5-2 mm dik) zijn ingebed in hetzelfde blok, zodat ze in één sectie kunnen worden gesneden. Ten minste 15 secties van het ruggenmerg moeten worden ingebed, zodat een adequate selectie van secties voor analyse mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Scoren van meningeale ontsteking en percentage myelinegebied ter hoogte van het thoracale ruggenmerg. (A,B) tonen beelden van het thoracale ruggenmerg van een vrouwelijke C57BL6/J-muis met MOG p35-55-geïnduceerde EAE gekleurd met LFB/H&E. Getoond is de benadering die wordt gebruikt om kwadranten en voorbeelden van demyeliniserende laesies te visualiseren (getraceerd in stippellijn). De muis in A heeft 4 van de 4 kwadranten met confluente demyeliniserende laesies, terwijl de muis in B 1 van de 4 aangetaste kwadranten heeft. De muis in B heeft wel wat ontstekingen in andere kwadranten, maar dit heeft zich niet gemanifesteerd in een confluente laesie en wordt daarom niet gescoord. (C-E) Voorbeeld van een LFB-afbeelding en de afbeelding in grijswaarden en drempelwaarden in afbeeldingJ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ruggenmergcoupes gekleurd met CD45, LFB H&E, LFB en SMI-32. Voorbeelden van een vroege (A,C,E,G) en late (B,D,F,H) submeningeale laesie in het ruggenmerg gekleurd voor CD45-antilichaam (A,B), LFB/H&E (C,D), LFB alleen (E,F) en SMI-32-antilichaam (G,H). Zwarte pijlen tonen voorbeelden van cellen die gekleurd zijn met elk respectievelijke antilichaam. Witte pijlen tonen vermeende microglia die zijn gekleurd als CD45+. Schaalbalk = 50 μm. Deze figuur toont representatieve kleuring van laesies in het ruggenmerg van een vrouwelijke C57BL6/J-muis tijdens EAE en benadrukt hoe pathologie kan verschillen tussen verschillende ruggenmergsecties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Toepassing van scores voor laesies en percentage demyelinisatie in EAE. Getoond is een voorbeeld van een EAE-experiment waarbij vrouwelijke muizen met een tekort aan eierstokkanker G-proteïne gekoppelde receptor 1 (OGR1)-gen op de C57BL6/J-achtergrond minder ernstige klinische EAE ontwikkelden dan wildtype (WT) vrouwelijke C57BL6/J-muizen. EAE werd geïnduceerd door immunisatie met MOG p35-55/CFA plus PTX en muizen werden gescoord volgens de volgende klinische schaal: 1 = staartverlamming. 2 = zwakte van de achterpoten en voeten, 3 = verlamming van de achterpoten, 4 = zwakte van de voorpoten, 5 = stervende. (A) Gemiddelde + SEM klinische scores van muizen in de loop van de tijd. (B) Getoond is een voorbeeld van LFB/H&E-kleuring in het ventrale ruggenmerg. Schaalbalk = 50 μm. (C) Gemiddelde + SEM procent kwadranten die demyeliniserende laesies bevatten. (D) Gemiddelde + SEM procent demyelinisatie in elke groep. (E) toont het resultaat van een ander experiment in MOG p35-55-geïnduceerde EAE bij C57BL6/J-muizen, waarbij EAE-scores van individuele muizen werden opgeteld gedurende de 30 dagen observatie en werden gecorreleerd met het percentage demyelinisatie in het ruggenmerg. Correlaties werden uitgevoerd met behulp van een Spearman-test. Panelen in (A-D) zijn aangepast van Souza C et al.29. Gegevens in (E) zijn originele gegevens. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Toepassing van SMI-32-kleuring om inzicht te krijgen in het effect van een genotype op het klinische EAE-fenotype. Deze figuur toont een voorbeeld van een EAE-experiment waarbij mannelijke en vrouwelijke wildtype (drager van een gefloxt allel van Ppard) en myeloïde specifieke Ppard-mutante muizen (LysMCre: Ppardfl/fl) op de C57BL6/J-achtergrond werden geïmmuniseerd met MOG p35-55/CFA en PTX en gedurende 45 dagen werden gevolgd. (A) toont de gemiddelde + SEM klinische scores van muizen. (B) toont gemiddelde + SEM-resultaten van histologische scores van het aantal SMI-32+ axonen in het ruggenmerg, %-kwadranten met submeningeale laesies, procentkwadranten met perivasculaire manchetten en #CD3 laesies in het cerebellum per mm2 weefsel. Dit experiment toonde een genotype-effect op SMI-32-kleuring. Deze figuur is een bewerking van Drohomyrecky. et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van CD45+/hematoxylinekleuring in coronale secties van de hersenen in MOG p35-55-geïnduceerde EAE bij vrouwelijke C57BL6/J-muizen. CD45+ laesies worden in bruin weergegeven. (A) CD45+ laesies in de hersenstam van coronale secties. Schaalbalk = 150 μm. (B-G) Voorbeelden van CD45+- laesies in de oogzenuwen (B), meningeale extensies onder de hippocampus (C), de hersenstam (D), het corpus collosum (E), de mediale habenula nabij het ventrikel (F) en het cerebellum (G). Schaalbalk: (B–G) = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: sNF-L-waarden in serum in MOG p35-55-geïnduceerde EAE. (A) Serum NFL-spiegels verzameld van vrouwelijke controle- en EAE-muizen aan het eindpunt van één experiment. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van een tweezijdige Mann Whitney-test. (****p waarde < 0,0001). (B) Coupes van het ruggenmerg werden op het eindpunt geoogst en gekleurd met SMI-32. Het aantal positieve cellen per weefselgebied van de witte stof werd bepaald en gecorreleerd met serum NF-L op het eindpunt met behulp van een Spearman-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Beschrijving van de baden die worden gebruikt voor weefselbewerking. Cassettes worden automatisch door deze serie baden verplaatst met behulp van een geautomatiseerde processor. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Stappen in Luxol Fast Blue en Hematoxyline en Eosine kleuring. Deze tabel geeft de volgorde van de stappen in het Luxol Fast Blue en Hematoxyline- en Eosine-kleuringsprotocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Antilichamen die worden gebruikt voor immunohistochemische kleuring. Beschreven zijn de antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, evenals de antilichamen die kunnen worden gebruikt om ontsteking, microgliose en astrogliose verder te onderzoeken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Hoe .czi naar TIFF-bestanden te converteren. Houd er rekening mee dat het optimaal is om een afbeelding met een hoge resolutie te gebruiken, maar dat afbeeldingen met een gemiddelde resolutie in plaats daarvan kunnen worden opgeslagen als het werkgeheugen van de computer beperkt is. Het is absoluut noodzakelijk om afbeeldingen met dezelfde resolutie te gebruiken voor alle analyses. Merk ook op dat de laatste afbeelding van de serie het dialabel is. Vermijd het lezen van het etiket om ervoor te zorgen dat de analyse geblindeerd is. 30,31 Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Histologische kleuring van het ruggenmerg is een belangrijk hulpmiddel bij het beoordelen van de ernst van de EAE-ziekte, met name in gevallen waarin er verschillen zijn tussen behandelingsgroepen in de mate van herstel van de ziekte in de postacute fase van de ziekte. Kleuring voor immuuncelinfiltratie (CD45), myeline (LFB) en axonaal letsel (SMI-32) helpt bij het karakteriseren van de onderliggende oorzaak van de veranderde klinische scores bij muizen. Het histologische kleuringsprotocol dat hier wordt beschreven, biedt een perspectief op ontsteking en de mate van myeline- en axonaal letsel. Bovendien valideren de getoonde resultaten sNF-L-meting als een methode om de omvang van de totale neuronale schade bij EAE te beoordelen.
De kritische parameters voor deze analyse zijn ervoor te zorgen dat onderzoekers blind zijn voor de identiteit van de secties en dat er gelijkwaardige bemonstering is op elk niveau van het ruggenmerg bij de verschillende muizen. Dit komt omdat de ernst van de ontsteking groter kan zijn bij lagere niveaus van het koord. Een andere kritische parameter is de grootte van de experimentele groepen. Ruggenmerg en hersenen worden meestal geoogst van 6-8 muizen per groep op het eindpunt om significante verschillen te zien tussen groepen met behandelingen of genotypen met een bescheiden effectgrootte. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat geselecteerde muizen, wanneer gemiddeld, representatieve gemiddelde scores van de hele groep hebben. Wat het oplossen van problemen betreft, is een veelvoorkomend probleem dat wordt ondervonden door degenen die geen ervaring hebben met het protocol, dat het ruggenmerg onvoldoende lang wordt gefixeerd en niet gemakkelijk uit de wervelkolom kan worden geëxtrudeerd. Als dit het geval is, kan het ruggenmerg handmatig van de kolom worden ontleed door met een fijne schaar langs de processus spinosus te knippen en de kolom te openen om het ruggenmerg te onthullen. Als alternatief kunnen weefsels nog een paar dagen worden gefixeerd zonder het succes van antilichaamkleuring te verstoren. De antilichaamklonen die hier worden beschreven, werken in weefsel dat tot 2 weken in formaline is gefixeerd.
Het inbedden van de ruggenmergstukken vereist vaardigheid en oefening. Het wordt aanbevolen om oogloepen te dragen en een lamp op het inbeddingsstation te richten om beter te kunnen zien of de secties in dwarsdoorsnede of in longitudinale doorsnede vallen. Door de lengtes van de stukken ruggenmerg tijdens het groeven op minder dan 2 mm te houden, kunnen ze in dwarsdoorsnede vallen. Een ander veelvoorkomend probleem voor minder ervaren gebruikers is dat de LFB verdampt tijdens de nachtelijke incubatie, waardoor de helft van het objectglaasje bevlekt en de andere helft onbevlekt blijft. Om verdamping te voorkomen, moet de glazen kleurschaal worden afgesloten met thermoplastische folie en vervolgens met plasticfolie. Als er verdamping optreedt en secties ongelijkmatig gekleurd zijn, wordt aanbevolen om de objectglaasjes volledig te ontblauwen met lithiumcarbonaat en ze 's nachts opnieuw te kleuren in LFB. Een ander veelvoorkomend probleem is dat gebruikers de grijze massa na LFB niet volledig ontblauwen. Het is van cruciaal belang om afzonderlijke secties onder de microscoop te onderzoeken om er zeker van te zijn dat er voldoende ontblauwing is bereikt voordat u doorgaat met andere stappen in het protocol. Bovendien, hoewel de CD45- en SMI-32 IHC-kleuringen robuust presteren, is het nog steeds belangrijk om antilichaamconcentraties in voorlopige experimenten op te lossen voor elke nieuwe antilichaampartij die wordt ontvangen. Dit kan worden gedaan door verschillende concentraties van het antilichaam te testen op een positieve controlesectie (EAE-ruggenmerg). De eerste kleuring moet ook een negatieve controle omvatten die alleen bestaat uit secundair antilichaam zonder toevoeging van primair antilichaam. Ten slotte is het van cruciaal belang bij de beeldanalyse om individuele afbeeldingen te drempelen, aangezien de kleuring ongelijkmatig kan zijn over dia's of secties.
Dit protocol maakt gebruik van vrij beschikbare software. Als men geen toegang heeft tot een processor, een embedder of microtoom, kunnen deze stappen worden uitbesteed aan een pathologiekern in een ziekenhuis die deze diensten aanbiedt. Ook als men geen toegang heeft tot een diascanner, kan men een lichtmicroscoop gebruiken die is uitgerust met een videocamera om TIFF-beelden van het ruggenmerg of hersengebieden op te slaan. Voor een op microscoop gebaseerde workflow legt u LFB- of LFB/H&E-secties vast met een laag vermogen (40x vergroting) en voor CD45- en SMI-32-kleuring brengt u ten minste vier vensters in beeld die gecentreerd zijn in de ventrale, dorsale en laterale delen van het ruggenmerg (200x vergroting voor CD45 en 400x vergroting voor SMI-32). Op deze afbeeldingen kan beeldanalyse worden uitgevoerd om kleuring op een vergelijkbare manier te kwantificeren als beschreven.
De beslissing welke histologische benadering moet worden gevolgd om EAE te scoren, hangt af van hoeveel de klinische scores verschillen tussen groepen. Als er bijvoorbeeld drastische verschillen zijn in de klinische score van EAE (de ene groep kreeg EAE en de andere niet), heeft dit meestal betrekking op verschillen in perifeer gemedieerde ontsteking. In dit geval is het voldoende om te scoren op de aanwezigheid van demyeliniserende laesies op LFB/H&E-gekleurde secties en zullen verschillen tussen groepen aan het licht komen. Als groepen bij aanvang meer op elkaar lijken in klinische score en er in plaats daarvan verschillen zijn in de mate van klinisch herstel (bijv. experiment in figuur 5A), is het het beste om de volledige histologische workflow toe te passen die hier wordt geschetst, inclusief het scoren van hersenontsteking in de hersenstam en het cerebellum, om te onderscheiden of de verschillen in de chroniciteit van de ziekte verband houden met verschillen in ontsteking of weefselschade. Als er verschillen in ontsteking worden gevonden zoals beoordeeld door CD45-telling, kunnen verdere IHC-onderzoeken worden gedaan om te kleuren voor T-cellen (anti-CD3), infiltrerende monocyten/macrofagen (Mac3) en microglia (Iba-1/TMEM119) (aanbevolen antilichaamklonen staan in aanvullende tabel 3). Activering van microglia wordt weerspiegeld door een toename van de intensiteit van Iba-1-kleuring op dubbel gelabelde Iba-1+TMEM-19+ microglia en een verhoogde terugtrekking van microglia-processen die kunnen worden beoordeeld door Sholl-analyse opsecties 32. Bovendien kunnen technieken zoals flowcytometrie of single cell RNA-sequencing worden toegepast om een diepere karakterisering van de frequentie en het fenotype van immuunpopulaties in de hersenen en het ruggenmerg uit te voeren.
Het tellen van SMI-32+ axonen is een gevoelige methode om axonschade op te sporen in EAE32,33 en in MS34. SMI-32, dat de niet-gefosforyleerde vorm van zwaar of medium neurofilament detecteert, hoopt zich op in eindbollen van doorgesneden neuronen. Een alternatief voor het detecteren van gewonde axonen is het kleuren met amyloïde precursoreiwit (APP) dat zich kan ophopen in axonen als gevolg van verstoordaxonentransport33. Het kleuringspatroon voor SMI-32 en APP, hoewel beide een weerspiegeling zijn van axonletsel, overlappen elkaar doorgaans niet, wat aangeeft dat ze verschillende pathologieën detecteren33. Men kan histologische metingen van axonletsel ook aanvullen door sNF-L te meten, wat een snelle en gevoelige maat is voor aanhoudend axonaal letsel in zowel het ruggenmerg als de hersenen. Het biedt het voordeel dat het bij levende muizen in een halve dag kan worden gedaan. Een nadeel van deze methode is dat de kits duur zijn en de machine zeer gespecialiseerd is. Het bedrijf dat de sNF-L-kit verkoopt, biedt wel een vergoeding voor service voor degenen die geen toegang hebben tot een SIMOA-machine. Een alternatief voor het beoordelen van axonletsel is om te scoren voor axonverlies door axonen te tellen in toluïdineblauw gekleurde delen van het ruggenmerg12 of neurofilamentbundels te tellen die door SMI-31 worden gedetecteerd in gebieden van de witte stof van het ruggenmerg32. Beide zijn bewerkelijker benaderingen dan SMI-32- of sNF-L-metingen.
Als de klinische scores van EAE verschillen tussen de groepen, maar de scores voor ontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel geen verschillen tussen groepen aan het licht brengen, kan het nuttig zijn om te kleuren voor astrocytenactivering met behulp van GFAP (zie aanvullende tabel 3 voor aanbevolen antilichaamkloon). Activering van astrocyten wordt geassocieerd met een toename van GFAP-kleuring en het is aangetoond dat dit correleert met EAE-progressie in sommige EAE-modellen, waaronder chronische EAE in de DA-rat35.
Concluderend beschrijft dit protocol methoden en biedt het een analyseworkflow om histologische scores van EAE uit te voeren.
Disclosures
Shannon Dunn consulteert voor FSD Lucid Psycheceuticals.
Acknowledgments
We danken Dr. Raymond Sobel (Stanford University) voor het tonen van zijn methode om hersen- en ruggenmergsecties te verbeteren en te repareren. We danken Kyle Roberton en Milan Ganguly van het Toronto Centre for Phenogenomics voor het leren van de inbeddingsmethode en voor het snijden van zoveel van onze hersen- en ruggenmergsecties. We danken Dr. Matthew Cussick en Dr. Robert Fujinami (University of Utah) voor het delen van hun protocollen voor het scoren van submeningeale en perivasculaire ontsteking in het ruggenmerg. We danken Shalina Ousman voor het delen van de kloon van het CD45-antilichaam. We danken Xiofang Lu voor de training over de weefselprocessor en het weefselinbeddingsstation en het onderhouden van deze apparatuur in het Keenan Research Centre of Biomedical Research in het St. Michael's Hospital. Dit werk werd ondersteund door een biomedische subsidie van MS Canada (aan SED). Carmen Ucciferri wordt ondersteund door een studentschap van de regering van Canada. Nuria Alvarez-Sanchez wordt ondersteund door een Keenan postdoctorale fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
| 1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
| 15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
| 500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
| 92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
| 95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
| ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
| Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
| Biosafety Cabinet | Any | ||
| Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
| DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
| ddH2O | - | - | |
| Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
| Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
| Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
| Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
| Fumehood | Any | ||
| Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
| Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
| Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
| Light microscope | Any | ||
| Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
| Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
| M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
| Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
| Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
| Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
| Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
| Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
| NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
| Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
| Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
| Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
| OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
| p1000 Pipette and Tips | various | ||
| p200 Pipette and Tips | various | ||
| Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
| pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
| Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
| Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
| Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
| Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
| Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
| Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
| Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
| Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
| SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
| Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
| Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
| Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
| Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
| Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
| Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
| Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
| X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
| Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
| Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
| Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
| Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
| Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408--129 | Used to store mouse serum samples |
| Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
| Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |
References
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
- Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144 (2022).
- Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
- Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
- Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836 (2022).
- Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866 (2022).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194 (2019).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
- Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
- Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
- Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431 (2021).
- Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864 (2020).
- Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419 (2021).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
- Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
- Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
- D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439 (2016).
- Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
- Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
- Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425 (2021).
- Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
- Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).
