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Immunology and Infection

स्कोरिंग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सूजन, demyelination, और प्रायोगिक autoimmune encephalomyelitis में अक्षतंतु चोट

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65738
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 3, 1, 1, 2, 2,4, 1,2,5
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Keenan Research Centre for Biomedical Science of St. Michael’s Hospital, 3Sickkids Research Institute, The Hospital for Sick Children, 4BARLO MS Centre, St. Michael’s Hospital, 5Women’s College Research Institute, Women’s College Hospital

Summary

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस के एक पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है। यह लेख ईएई में रीढ़ की हड्डी की सूजन, डिमाइलिनेशन और एक्सोनल चोट को स्कोर करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, चूहों के सीरम में घुलनशील न्यूरोफिलामेंट प्रकाश के स्तर को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है, जिससे जीवित चूहों में अक्षीय चोट का आकलन किया जा सकता है।

Abstract

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) का एक सामान्य प्रतिरक्षा-आधारित मॉडल है। इस बीमारी को माइलिन म्यान और पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) के प्रोटीन घटकों के साथ सक्रिय टीकाकरण द्वारा कृन्तकों में प्रेरित किया जा सकता है या माइलिन प्रोटीन / सीएफए के साथ प्राइमेड कृन्तकों से माइलिन-विशिष्ट टी प्रभावक कोशिकाओं के हस्तांतरण से भोले कृन्तकों में प्रेरित किया जा सकता है। ईएई की गंभीरता आमतौर पर 5-बिंदु नैदानिक पैमाने पर बनाई जाती है जो आरोही पक्षाघात की डिग्री को मापती है, लेकिन यह पैमाना ईएई से वसूली की सीमा का आकलन करने के लिए इष्टतम नहीं है। उदाहरण के लिए, सूजन के संकल्प के बावजूद कुछ ईएई मॉडल (जैसे, माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन [एमओजी] ईएई के पेप्टाइड-प्रेरित मॉडल) में नैदानिक स्कोर उच्च रहते हैं। इस प्रकार, ईएई के हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग के साथ नैदानिक स्कोरिंग को पूरक करना महत्वपूर्ण है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सेलुलर चोट के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने का एक साधन भी प्रदान करता है।

यहाँ, एक सरल प्रोटोकॉल तैयार करने और चूहों से रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क वर्गों दाग और सूजन स्कोर करने के लिए प्रस्तुत किया है, demyelination, और रीढ़ की हड्डी में axonal चोट. रीढ़ की हड्डी में ल्यूकोसाइट घुसपैठ को स्कोर करने की विधि भी ईएई में मस्तिष्क की सूजन को स्कोर करने के लिए लागू की जा सकती है। एक छोटे अणु परख (SIMOA) परख का उपयोग कर चूहों के सीरम में घुलनशील neurofilament प्रकाश (sNF-L) को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल भी जीवित चूहों में समग्र सीएनएस चोट की सीमा पर प्रतिक्रिया प्रदान करता है जो वर्णित.

Introduction

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मानव डिमाइलेटिंग बीमारी, मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)1के लिए सबसे आम म्यूरिन मॉडल है। क्लासिक एमएस भड़काऊ विकृति, IFN-γ (गामा) और IL-17-उत्पादक टी हेल्पर कोशिकाओं2 की घुसपैठ सहित, भड़काऊ मोनोसाइट्स3 की घुसपैठ, पेरिवास्कुलर और उप-मेनिंगियल भड़काऊ demyelinating घावोंका गठन 4, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) में अक्षतंतु चोट4 की घटना, EAE 5,6,7,8,9 में भी देखी जाती है. ईएई और एमएस के बीच प्रतिरक्षा तंत्र में समानता ने ईएई को एमएस के लिए कई अनुमोदित प्रतिरक्षा-आधारित उपचारों की प्रभावकारिता और तंत्र के परीक्षण के लिए एक उपयुक्त पूर्व-नैदानिक मॉडल बना दिया है, जिसमें नतालिज़ुमाब, फिंगोलिमॉड, डाइमिथाइल फ्यूमरेट और ग्लैटीरामेर एसीटेट (1,5 में समीक्षा की गई) शामिल हैं। कुछ ईएई रेजिमेंस एक्सोनल चोट से परे प्रगतिशील एमएस पैथोलॉजी के अन्य पहलुओं को मॉडल करते हैं, जिसमें मस्तिष्क में उप-मेनिंगियल सूजन, क्रोनिक डिमाइलिनेशन, रीढ़ की हड्डी शोष, सिनैप्स और न्यूरॉन हानि 6,10,11,12 का विकास शामिल है। इस प्रकार, ईएई में एमएस के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव थेरेपी की प्रभावकारिता की जांच के लिए उपयोगिता है।

ईएई कृन्तकों में कई तरीकों से प्रेरित होता है। सक्रिय टीकाकरण सबसे आम प्रेरण विधि है और इसमें माइलिन एंटीजन (या तो पूरे प्रोटीन या पेप्टाइड्स) के साथ कृन्तकों का टीकाकरण शामिल है, जो सीएफए में गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस13 के साथ पूरक है। माउस के तनाव के आधार पर, पर्टुसिस विष (पीटीएक्स) भी रोग13 की पैठ बढ़ाने के लिए टीकाकरण के दिन 0 और दिन 2 पर प्रशासित किया जाता है। ईएई को स्वस्थ चूहों14 में माइलिन / सीएफए-प्राइमेड चूहों से प्राप्त माइलिन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को गोद लेने से भी प्रेरित किया जा सकता है या चूहों में अनायास विकसित हो सकता है जो प्रमुख माइलिन एंटीजन5 के लिए विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स को ओवरएक्सप्रेस करते हैं।

ईएई रोग की गंभीरता और प्रगति आमतौर पर एक असतत 5-बिंदु नैदानिक पैमाने का उपयोग करके स्कोर की जाती है: 1 - पूंछ लंगड़ापन, 2 - हिंडलिंब या पैर की कमजोरी, 3 - एक या दोनों हिंदलिंब में पूर्ण पक्षाघात, 4 - फोरलिंब कमजोरी, 5 - मरणासन्न या मृत13। यह नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली आरोही पक्षाघात की प्रगति का दस्तावेजीकरण करने में ध्वनि है जो रोग की शुरुआत में होती है लेकिन सीएनएस भड़काऊ हमलों से वसूली की सीमा को पकड़ने में कम संवेदनशील है। उदाहरण के लिए, दोनों चूहे जो कठिनाई से चलते हैं और चूहे जो आसानी से एम्बुलेट करते हैं लेकिन पैर-लोभी कमजोरी का प्रदर्शन करते हैं, उन्हें ईएई पैमाने पर 2 का स्कोर सौंपा जाता है। स्थायी अक्षतंतु चोट या हानि की उपस्थिति के कारण ईएई के बाद के तीव्र चरण में स्कोर उच्च रह सकते हैं, यहां तक कि भड़काऊ प्रतिक्रिया9 के संकल्प के बावजूद। ईएई 9,16,17,18 में नैदानिक घाटे में अंतर को बेहतर ढंग से पकड़ने के लिए अधिक परिष्कृत स्कोरिंग सिस्टम, व्यवहार परीक्षण, हिंदलिंब और पकड़ शक्ति के उपाय, और अवरक्त निगरानी प्रणाली विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं; हालांकि, ये अधिक जटिल स्कोरिंग उपाय अंतर्निहित न्यूरोलॉजिकल घाटे में सूजन बनाम ऊतक की चोट के योगदान को अलग नहीं करते हैं। इस प्रकार, ईएई की गंभीरता को स्कोर करने के लिए स्वर्ण मानक दृष्टिकोण नैदानिक और हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग दोनों का संचालन करना है।

यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है कि कैसे पैराफिन में माउस रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के नमूनों को विच्छेदन और एम्बेड किया जाए, जो ईएई में होने वाले घाव के गठन की स्टोकेस्टिक प्रक्रिया को पकड़ता है। एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया जाता है कि लक्सोल फास्ट ब्लू (एलएफबी) के साथ वर्गों को कैसे दाग दिया जाए, मूल रूप से क्लूवर और बैरेरा19 द्वारा बनाया गया है, जो सीएनएस में माइलिन का पता लगाता है। अनुभाग या तो अकेले एलएफबी (डिमाइलिनेशन विश्लेषण के लिए) के साथ दाग दिए जाते हैं या भड़काऊ घावों को देखने और स्कोर करने में मदद करने के लिए हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) के साथ प्रति-दाग होते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) तकनीकों और सार्वजनिक रूप से सुलभ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी में कुल ल्यूकोसाइट्स (सीडी 45), माइलिन की हानि, और घायल अक्षतंतु (एसएमआई -32) की संख्या को निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान किए जाते हैं। रीढ़ की हड्डी में ल्यूकोसाइट्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को मस्तिष्क में ल्यूकोसाइट्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

मस्तिष्क में अक्षीय हानि और चोट का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन रीढ़ की हड्डी की तुलना में तुलनात्मक रूप से अधिक कठिन है क्योंकि मस्तिष्क के सफेद पदार्थ एक दूसरे के समानांतर नहीं चलते हैं। सीरम न्यूरोफिलामेंट लाइट (एसएफएन-एल) का माप एमएस20,21 में न्यूरोनल चोट के लिए एक आशाजनक बायोमार्कर के रूप में उभरा है। हाल के अध्ययनों ने इस तकनीक को ईएई 22,23,24 तक बढ़ा दिया है। यहां, एक छोटे अणु परख (SIMOA) परख का उपयोग करके जीवित चूहों में सीरम न्यूरोफिलामेंट लाइट (sNF-L) को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। इस विधि सीरम की केवल एक छोटी मात्रा की आवश्यकता है और केवल आधे दिन में जीवित चूहों में किया जा सकता है, कैसे एक परीक्षण चिकित्सा समग्र सीएनएस चोट को प्रभावित कर रहा है पर तेजी से प्रतिक्रिया प्रदान करना. यहां वर्णित सभी विधियों को किसी भी लिंग या तनाव के चूहों पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

चूहों के साथ किए गए सभी प्रयोगों को यूनिटी हेल्थ टोरंटो एनिमल केयर कमेटी द्वारा अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत किया गया था, जो कैनेडियन काउंसिल ऑन एनिमल केयर द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों का पालन करता है। प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के दौरान लैब कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने और आईवियर पहनना सुनिश्चित करें।

1. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की कटाई और फिक्सिंग

  1. संस्थागत नीतियों के अनुसार माउस euthanize. एक विदारक मेज पर माउस प्रवण रखना और सर्जिकल कैंची (नीचे की ओर काटने) का उपयोग सिर काटना.
  2. एडसन संदंश (गैर प्रमुख हाथ में) का प्रयोग, माउस के सिर के शीर्ष पर त्वचा समझ. फिर सर्जिकल कैंची का उपयोग करके सिर के शीर्ष पर त्वचा में 2.5 सेमी चीरा लगाएं।
  3. अंतर्निहित खोपड़ी की कल्पना करने के लिए बाद में सिर पर त्वचा को धक्का देने के लिए उंगलियों का उपयोग करें।
  4. मानक Adson संदंश के साथ आंख सॉकेट लोभी द्वारा माउस के सिर को स्थिर करें।
  5. ठीक कैंची (प्रमुख हाथ) का उपयोग करके, ग्रीवा रीढ़ से घ्राण बल्बों तक मिडलाइन के साथ खोपड़ी में छोटे टुकड़े करें।
    नोट: अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एक समय में खोपड़ी के नीचे कैंची युक्तियों के केवल कुछ मिलीमीटर एम्बेड करें।
  6. अंतर्निहित मस्तिष्क को प्रकट करने के लिए खोपड़ी को प्रतिबिंबित करने के लिए दांतों के साथ एडसन संदंश का प्रयोग करें।
  7. गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग करके सिर को पकड़ें। कैंची बंद (प्रमुख हाथ) पकड़े हुए, रीढ़ की हड्डी को ग्रीवा रीढ़ से बाहर निकालें और धीरे से मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर निकालें, कपाल नसों को छीन लें।
  8. मस्तिष्क को एक शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन के 10 एमएल होते हैं जिसे जानवर की आईडी के साथ लेबल किया जाता है।
  9. गर्दन से पूंछ तक माउस के धड़ की मध्य रेखा के साथ फर को चीरें।
  10. रीढ़ की कल्पना करने के लिए त्वचा को बाद में धक्का देने के लिए उंगलियों का उपयोग करें।
  11. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, रीढ़ के माध्यम से नीचे की ओर उस स्तर पर काट लें जहां फीमर कूल्हे से जुड़ते हैं।
  12. कूल्हे से गर्दन तक रीढ़ की हड्डी के प्रत्येक तरफ शरीर की दीवार को काटने के लिए सर्जिकल कैंची का प्रयोग करें। किसी भी संलग्न अंगों को ट्रिम करें।
  13. रीढ़ की हड्डी वाली रीढ़ को फॉर्मेलिन की उसी ट्यूब में रखें जिसमें मस्तिष्क हो। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को 5-7 दिनों के लिए ठीक करने दें।
    नोट: निर्धारण का समय महत्वपूर्ण है। ऊतक के अधिक तय होने पर कुछ एंटीबॉडी काम नहीं करेंगे। यदि ऊतक को कम तय किया जाता है, तो चरण 2 में रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से रीढ़ की हड्डी को बाहर निकालना मुश्किल होता है।

2. रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क की कमाई और प्रसंस्करण

नोट: निम्नलिखित कदम एक धूआं हुड में जगह ले लो. शुरू करने से पहले, 2 x 10 सेमी साफ पेट्री व्यंजन, एक एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें जो फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध फ़नल के साथ फिट हो, दो स्केलपेल (एक हड्डी काटने के लिए और एक सीएनएस ऊतकों को काटने के लिए), लेंस पेपर, एक पेंसिल, एम्बेडिंग कैसेट, और नमूना जार 10% फॉर्मेलिन से पहले से भरे हुए हैं।

  1. कैंची का प्रयोग, लेंस कागज का एक छोटा सा टुकड़ा (एक ही चौड़ाई लेकिन दो बार कैसेट की लंबाई) में कटौती और एक पेट्री डिश में जगह है.
  2. एक पेंसिल का उपयोग करके नमूना आईडी के साथ एक प्लास्टिक कैसेट लेबल करें।
  3. निश्चित मस्तिष्क और रीढ़ युक्त ट्यूब को फ़नल में डालें। रीढ़ और मस्तिष्क को खाली पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रयुक्त फॉर्मेलिन एर्लेनमेयर फ्लास्क में फ़िल्टर हो जाएगा और चरण 2.13 पर फिर से उपयोग किया जा सकता है।
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करके मस्तिष्क को छह कोरोनल टुकड़ों में विभाजित करें। सेरिबैलम के लिए एक कट दुम बनाएं, सेरिबैलम के बीच में एक, सेरिबैलम के लिए एक सिर्फ रोस्ट्रल, और शेष रोस्ट्रल मस्तिष्क में दो कटौती, समान मोटाई के 3 अतिरिक्त कोरोनल स्लाइस बनाएं।
  5. संदंश का प्रयोग, पेट्री डिश में लेंस कागज के एक आधे पर मस्तिष्क के नमूनों हस्तांतरण.
  6. स्केलपेल का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी को तीन टुकड़ों में काटें: पहला कट रिब पिंजरे के नीचे बनाया जाता है, और दूसरा कट ग्रीवा रीढ़ में वक्रता के ठीक नीचे बनाया जाता है।
  7. एक ही स्केलपेल का उपयोग करके, दुम के अंत में त्रिक रीढ़ के टुकड़े को ट्रिम करें जब तक कि रीढ़ की हड्डी की कल्पना नहीं की जा सकती।
  8. वक्षीय रीढ़ (गैर-प्रमुख हाथ) उठाओ। कसकर बंद (प्रमुख हाथ) दांतों के साथ एडसन संदंश पकड़ो और धीरे एक कोमल घुमा गति का उपयोग रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के छोटे उद्घाटन में संदंश के अंत धक्का. कॉर्ड को दूसरे छोर से निकलना चाहिए।
    नोट: कोई भी गोलाकार उपकरण जो रीढ़ की हड्डी का आकार है, इस उद्देश्य के लिए काम करेगा। यदि रीढ़ की हड्डी स्वाभाविक रूप से बाहर नहीं निकलती है, तो इसे मजबूर न करें। इसके बजाय, रीढ़ की हड्डी के किनारे हड्डियों को क्लिप करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें और रीढ़ की हड्डी को प्रकट करने के लिए इसे खुला प्रतिबिंबित करें। वैकल्पिक रूप से, फॉर्मेलिन में कुछ अतिरिक्त दिनों के लिए रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क को ठीक करें; हालांकि, एंटीबॉडी धुंधला में परिवर्तनशीलता शुरू करने से बचने के लिए सभी नमूनों पर एक ही निर्धारण समय लागू किया जाना चाहिए।
  9. मानक Adson संदंश (प्रमुख हाथ) उठाओ. अभी भी कम प्रमुख हाथ के साथ रीढ़ की हड्डी के टुकड़े पकड़े हुए, धीरे स्तंभ से बाहर उभरा कॉर्ड खींचने के लिए संदंश का उपयोग करें. लेंस पेपर युक्त पेट्री डिश में रीढ़ की हड्डी का टुकड़ा रखें.
  10. काठ/त्रिक और ग्रीवा स्तंभ के टुकड़ों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  11. तीन रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों (ग्रीवा, वक्ष, काठ / त्रिक) को एक स्केलपेल का उपयोग करके छोटे क्रॉस-अनुभागीय टुकड़ों में विभाजित करें। कम से कम 15 खंडों को काटें, जिनमें से प्रत्येक 2 मिमी से कम मोटा होना चाहिए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि खंड चौड़े होने से छोटे हैं, जिससे चरण 3 में एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान अनुभागों को क्रॉस-सेक्शन में अधिक आसानी से गिरना होगा।
  12. रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों को मस्तिष्क के टुकड़ों वाले लेंस पेपर के एक ही आधे हिस्से पर व्यवस्थित करें। ऊतक के टुकड़ों को सैंडविच करने के लिए लेंस पेपर को मोड़ो और लेबल वाले कैसेट में इसे रखें।
    नोट: लेंस पेपर ऊतक के छोटे टुकड़ों को प्रसंस्करण के दौरान कैसेट से बचने से रोकता है।
  13. कैसेट को पुनर्नवीनीकरण या ताजा फॉर्मेलिन युक्त नमूना जार में स्थानांतरित करें।
  14. शेष नमूनों के लिए चरण 2.1-2.13 दोहराएं।
  15. निर्धारण के 5-7 दिनों के बाद, नमूना कंटेनर से कैसेट को स्वचालित ऊतक प्रोसेसर में पहले फॉर्मेलिन स्नान में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। पूरक तालिका 1 में वर्णित कार्यक्रम के अनुसार रात भर ऊतक प्रोसेसर चलाएं। नमूनों को एम्बेडिंग तक गर्म पैराफिन मोम में रखा जाता है।

3. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के वर्गों को एम्बेड करना और काटना

  1. प्रोसेसर से कैसेट को पैराफिन एम्बेडिंग स्टेशन के गर्म होल्डिंग चैंबर में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. प्रत्येक माउस से रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क क्रॉस-सेक्शन को एक एकल पैराफिन ब्लॉक में एम्बेड करें (चित्र 1):
    1. सबसे पहले, मोल्ड के नीचे को कवर करने के लिए पैराफिन मोम डालें। ठीक संदंश का प्रयोग, मोल्ड के तल में पैराफिन में मस्तिष्क कोरोनल और रीढ़ की हड्डी पार अनुभागीय टुकड़े जगह है.
    2. जगह में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के टुकड़े को ठीक करने के लिए कई सेकंड के लिए ठंडा सतह पर मोल्ड स्थानांतरित करें। मोल्ड को वापस गर्म सतह पर ले जाएं और इसे गर्म पैराफिन के साथ शीर्ष पर भरें।
    3. मोल्ड के ऊपर कैसेट ढक्कन (जो नमूना आईडी के साथ लेबल किया गया है) रखें। कैसेट ढक्कन के ऊपर अधिक पैराफिन डालो। मोम को सेट करने की अनुमति देने के लिए मोल्ड को कूलिंग स्टेशन पर स्थानांतरित करें (30-60 मिनट के लिए ठंडा)।
      नोट: रीढ़ की हड्डी वर्गों एम्बेडिंग अभ्यास की आवश्यकता है. सफलता में सुधार करने के लिए, रीढ़ की हड्डी (<2 मिमी) की छोटी लंबाई का उपयोग करें क्योंकि ये क्रॉस-सेक्शन में गिरने की अधिक संभावना है। रीढ़ की हड्डी के टुकड़े क्रॉस-सेक्शन में हैं या नहीं, यह भेद करने में मदद करने के लिए सर्जिकल आई लूप पहने जा सकते हैं।
    4. रोटरी माइक्रोटोम पर माउंट पैराफिन ब्लॉक। ट्रिम ब्लॉक जब तक ब्याज के ऊतकों पैराफिन अनुभाग में दिखाई देते हैं.
    5. प्रत्येक ब्लॉक के वर्गों के 5 माइक्रोन रिबन काटें और उन्हें 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें।
    6. स्लाइड्स पर अनुभाग एकत्र करें और स्लाइड को ग्लास स्लाइड रैक में रखें।
    7. रात भर एक सूखे ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों सेंकना. धुंधला होने के लिए आगे बढ़ने से पहले कूल स्लाइड।

4. धुंधला हो जाने की तैयारी में वर्गों के डी-पैराफिनाइजेशन और पुनर्जलीकरण

नोट: कदम एक धूआं हुड में किया जाता है। शुरू करने से पहले, सॉल्वैंट्स के स्नान तैयार करें। 1x पीबीएस के 5 एल (1 एल डीडीएच2हे, 8 जी NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.44 ग्राम Na2HPO4, 0.24 ग्राम KH2PO4; पीएच = 7.4) 0.05% ट्वीन -20 (पीबीएस-टी) के साथ सभी धोने चरणों के लिए तैयार करें।

  1. कोमल आंदोलन के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर xylene या एक गैर xylene आधारित विलायक के लगातार दो स्नान में स्लाइड रखकर de-paraffinize.
  2. इथेनॉल के अवरोही प्रतिशत के क्रमिक स्नान के माध्यम से स्लाइड स्थानांतरित करके ऊतकों को पुनर्जलीकरण: 2 x 100% इथेनॉल (5 मिनट प्रत्येक), 2 x 95% इथेनॉल (3 मिनट प्रत्येक), और 1 x 70% इथेनॉल (3 मिनट)। एलएफबी धुंधला हो जाना के लिए 95% इथेनॉल में पकड़ो, और 70% इथेनॉल को पुनर्जलीकरण, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए पीबीएस-टी में पकड़ो।

5. एच एंड ई के साथ माइलिन के लिए एलएफबी

  1. 0.1% एलएफबी (0.2 ग्राम एलएफबी, सामग्री की तालिका, 200 एमएल 95% इथेनॉल, 0.5 एमएल ग्लेशियल एसिटिक एसिड) का समाधान तैयार करें। एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में मिलाएं और फ़िल्टर करें।  उपयोग करने तक एक अंधेरे बोतल में स्टोर करें।
  2. 95% इथेनॉल से एक ग्लास स्लाइड रैक में स्थानांतरण वर्गों कि LFB युक्त एक धुंधला पकवान में रखा गया है. वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ पकवान और सील को कवर करें।
  3. 56 डिग्री सेल्सियस ओवन रात भर (अधिकतम 16 एच) पर वर्गों सेते हैं.
  4. अगली सुबह, स्लाइड को डीडीएच2ओ स्नान में स्थानांतरित करें और पकड़ें।
  5. इस बीच, (1) ताजा 0.05% लिथियम कार्बोनेट समाधान (0.05 ग्राम लिथियम कार्बोनेट, 100 एमएल डीडीएच2ओ) तैयार करें; (2) Eosin Y समाधान (40 mL ddH20 में 2 ग्राम ईोसिन नमक जोड़ें और भंग होने तक मिलाएं और फिर 95% इथेनॉल के 160 एमएल के साथ मिलाएं)।
    1. निम्नलिखित स्नान तैयार करें: 1 एक्स लिथियम कार्बोनेट, 3 एक्स 70% इथेनॉल, 3 एक्स 95% इथेनॉल, 2 एक्स 100% इथेनॉल, 3 एक्स डीडीएच20। उपयोग के क्रम में स्नान करें ( पूरक तालिका 2 देखें)।
  6. अनुपूरक तालिका 2 में उल्लिखित चरणों का पालन करें।
  7. स्लाइड सूखी कर रहे हैं के बाद, खुर्दबीन के तहत demyelinating घावों कल्पना.

6. एच एंड ई के बिना माइलिन के लिए एलएफबी

  1. माइलिन के विश्लेषण के लिए इस धुंधला प्रक्रिया को करें।
    नोट: प्रक्रिया चरण 5 के समान है ( पूरक तालिका 2 देखें), लेकिन एक संक्षिप्त कार्य-प्रवाह है। चरण 4 के बाद, चरण 10 से प्रारंभ होने वाली प्रक्रिया जारी रखें।

7. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) दाग के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति और पेरोक्सीडेज शमन

नोट: शुरू करने से पहले, मेथनॉल में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 100 एमएल तैयार करें (9 भागों में 1 भाग 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान, एक धूआं हुड में)। ट्वीन -20 (ट्राइसोडियम साइट्रेट के 2.94 ग्राम, हलचल प्लेट पर एक बीकर में डीडीएच20 0 के 1 एल में भंग, पीएच को 6.0 तक लाएं, और ट्वीन -20 के 500 माइक्रोन जोड़ें) के साथ 10 एमएम साइट्रेट बफर का 1 एल तैयार करें। पीबीएस-टी तैयार करें (चरण 4 देखें)। सभी washes कोमल आंदोलन (एक प्रकार के बरतन पर) के साथ पीबीएस-टी के स्नान में किया जाता है जब तक अन्यथा संकेत दिया.

  1. 15 मिनट (एक धूआं हुड में) के लिए मेथनॉल में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में स्लाइड रखकर अंतर्जात peroxidase बुझाना. पीबीएस-टी (2 मिनट प्रत्येक) में दो बार स्लाइड धो लें.
  2. स्लाइड को धातु स्लाइड धारक में स्थानांतरित करें और प्रेशर कुकर में साइट्रेट बफर के 1 एल में रखें। ढक्कन को सील करें और स्टीम एस्केप वेंट के शीर्ष पर एक रबर स्टॉपर जोड़ें।
  3. माइक्रोवेव में उच्च पर पकाएं जब तक कि प्रेशर कुकर पर पीला टैब पॉप अप न हो जाए, यह दर्शाता है कि अधिकतम दबाव पहुंच गया है। अधिकतम दबाव पर अतिरिक्त 5 मिनट के लिए पकाएं, और फिर सुरक्षात्मक दस्ताने का उपयोग करके माइक्रोवेव से प्रेशर कुकर को हटा दें।
  4. डाट को हटाकर अवसादन करें।  ढक्कन निकालें और स्लाइड्स 20 मिनट के लिए साइट्रेट बफर में ठंडा और फिर वांछित धुंधला विधि के लिए आगे बढ़ें.
    चेतावनी: भाप छोड़ते समय पीछे खड़े रहें क्योंकि इससे तीखी चोट लग सकती है।

8. सीडी 45 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

नोट: इस आईएचसी विधि का उपयोग घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स की कल्पना करने के लिए किया जाता है। एविडिन/बायोटिन अवरुद्ध चरणों को अवरुद्ध और प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन चरणों के साथ जोड़ा जाता है।

  1. अवरुद्ध बफर (2% बीएसए, 1x पीबीएस में 2% खरगोश सीरम) तैयार करें।
  2. स्लाइड को ग्लास स्लाइड ट्रे में स्थानांतरित करें और पीबीएस-टी (2 मिनट प्रत्येक) के साथ दो बार धोएं। एविडिन/ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें (1 एक्स पीबीएस में 2% बीएसए/2% खरगोश सीरम में एविडिन की 4 बूंदें/एमएल, सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. एक प्रयोगशाला टिशू पेपर का उपयोग ऊतक के आसपास अतिरिक्त पीबीएस-टी बंद सूखी. हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके, ऊतक के चारों ओर एक सर्कल बनाएं और आर्द्र कक्ष में स्लाइड रखें।
  4. प्रत्येक अनुभाग (400 माइक्रोन / स्लाइड) पर एविडिन / अवरुद्ध समाधान लागू करें।
  5. आर्द्र कक्ष को कवर करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।  इस चरण के दौरान, बायोटिन युक्त बफर को अवरुद्ध करने में एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी (पूरक तालिका 3) तैयार करें (4 बूंदें/एमएल बायोटिन, 1x पीबीएस में 2% बीएसए/2% खरगोश सीरम)।
  6. एक लिंट-फ्री प्रयोगशाला वाइप पर स्लाइड से अवरुद्ध समाधान को टैप करें। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग कर ऊतक के चारों ओर थपकाओ.
  7. स्लाइड को वापस एक आर्द्र कक्ष में रखें। अनुभाग पर CD45 एंटीबॉडी समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 400 माइक्रोन जोड़ें। एक कवर आर्द्र कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
  8. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी बंद नाली और पीबीएस-टी (5 मिनट प्रत्येक) में स्लाइड 3 एक्स धोने.
  9. एक लिंट-फ्री प्रयोगशाला का उपयोग करके अनुभाग के चारों ओर शुष्क क्षेत्र और फिर प्रत्येक अनुभाग पर माध्यमिक एंटीबॉडी (बफर को अवरुद्ध करने में 1:200 कमजोर पड़ने) के 400 माइक्रोन जोड़ें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  10. इस बीच, एबीसी अभिकर्मक ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x पीबीएस के 5 एमएल के लिए अभिकर्मक ए की 2 बूंदों को जोड़कर तैयार करें और मिश्रण करें। एक ही समाधान के लिए अभिकर्मक बी की 2 बूँदें जोड़ें और मिश्रण (उपयोग करने से पहले ~ 30 मिनट तैयार).
  11. स्लाइड्स को 1x पीबीएस-टी (5 मिनट प्रत्येक) के 3 परिवर्तनों में धोएं और स्लाइड्स को आर्द्र कक्ष में रखें।
  12. वर्गों के लिए 400 माइक्रोन एबीसी अभिकर्मक जोड़ें. आर्द्र कक्ष को कवर करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. 1x पीबीएस-टी (5 मिनट प्रत्येक) के 3 परिवर्तनों में स्लाइड्स धो लें। इस बीच, निर्माता के निर्देशों के अनुसार पन्नी से ढके 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में उचित मात्रा में डीएबी समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  14. एक स्लाइड लें और एक माइक्रोस्कोप के तहत एक रीढ़ की हड्डी अनुभाग पर ध्यान केंद्रित करें। स्लाइड में 400 माइक्रोन डीएबी जोड़ें और लैब टाइमर शुरू करें।
  15. अनुभाग की कल्पना करें, जबकि यह विकसित हो रहा है और ल्यूकोसाइट्स भूरे रंग के होने पर टाइमर बंद कर दें। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए स्लाइड को डीडीएच20 स्नान में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए पानी में पकड़ो। शेष स्लाइड्स के लिए समान विकास समय का उपयोग किया जाता है।
    चेतावनी: डीएबी एक कार्सिनोजेन है। DAB अपशिष्ट और पोस्ट-DAB ddH2O को खतरनाक कचरे के रूप में निपटाएं।
  16. ~ 4-10 मिनट के लिए मेयर के Hematoxylin के साथ counterstain स्लाइड ( पूरक तालिका 2 देखें). 10 मिनट के लिए नल के पानी के नीचे स्लाइड कुल्ला.
  17. 95% इथेनॉल (1 x 3 मिनट) में निर्जलीकरण, इसके बाद पूर्ण 100% इथेनॉल (2 x 3 मिनट प्रत्येक)।
  18. एक धूआं हुड में चलती है, 5 मिनट के लिए xylene या एक xylene विकल्प विलायक में स्लाइड हस्तांतरण. बढ़ते माध्यम के साथ coverslip, और धूआं हुड में 1-2 दिनों के लिए सूखी स्लाइड की अनुमति देते हैं.
    चेतावनी: यदि xylene का उपयोग कर, डबल दस्ताने और संदंश का उपयोग करने के लिए स्लाइड को संभालने के लिए जब कवर-फिसलने, के बाद से यह विषाक्त है और दस्ताने भंग कर सकते हैं.
  19. xylene का उपयोग कर स्लाइड साफ और 20 एक्स बढ़ाई पर एक स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर स्कैन.

9. एसएमआई -32 आईएचसी अक्षीय क्षति के लिए

नोट: यह प्रोटोकॉल एक माउस एसएमआई -32 एंटीबॉडी का उपयोग करता है, जो गैर-फॉस्फोराइलेटेड न्यूरोफिलामेंट भारी के खिलाफ प्रतिक्रिया करता है, जो घायल अक्षतंतु25 में जमा हो सकता है। चूंकि इस एंटीबॉडी माउस में उठाया गया है और एक माउस प्रतिजन का पता लगाता है, यह अनुशंसित है कि माउस पर एक माउस (माँ) किट का उपयोग किया जा. इस प्रक्रिया में, एविडिन/बायोटिन ब्लॉकिंग स्टेप को प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन से अलग कदम के रूप में किया जाता है। इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, de-paraffinize, पुनर्जलीकरण, अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने, और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के रूप में चरण 4 और चरण 7 में वर्णित आचरण करते हैं.

  1. 2 एक्स पीबीएस-टी (2 मिनट प्रत्येक) के साथ दो बार वर्गों धो लें. एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग वर्गों के आसपास अतिरिक्त तरल निकालें और एक हाइड्रोफोबिक कलम का उपयोग ऊतकों के चारों ओर एक सर्कल आकर्षित.
  2. वर्गों में एविडिन (4 बूंदों/एमएल) के साथ 400 माइक्रोन अवरुद्ध बफर (1x पीबीएस-टी में 2% (डब्ल्यू / वी) बकरी सीरम जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. 1x पीबीएस-टी में दो बार स्लाइड डुबकी. स्लाइड में बायोटिन (4 बूंदों/एमएल) के साथ अवरुद्ध बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. 2 मिनट के लिए एक 1 एक्स पीबीएस-टी स्नान में स्लाइड्स धो लें. इस बीच, 1x पीबीएस के 2.5 एमएल के लिए स्टॉक समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) की 2 बूंदों को जोड़कर एमओएम अवरुद्ध अभिकर्मक तैयार करें।
  5. अनुभाग पर MOM अभिकर्मक के 400 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  6. 2 मिनट के लिए एक 1x पीबीएस-टी स्नान में दो बार स्लाइड्स धो लें. इस बीच, 1x पीबीएस के 3.75 एमएल के लिए प्रोटीन ध्यान केंद्रित स्टॉक समाधान के 300 माइक्रोन जोड़कर एमओएम मंदक तैयार करें।
  7. एमओएम मंदक के 400 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। इस बीच एसएमआई -32 एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) को एमओएम मंदक में पतला करें।
  8. स्लाइड्स से मंदक बंद नल और अनुभाग पर SMI-32 एंटीबॉडी समाधान के 400 माइक्रोन जोड़ें. आर्द्र कक्ष को कवर करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 2 मिनट के लिए एक 1x पीबीएस-टी स्नान में दो बार स्लाइड धो लें, कोमल आंदोलन के साथ प्रत्येक. इस बीच, मंदक में एमओएम एंटी-माउस आईजीजी काम करने वाले अभिकर्मक को पतला करें (मंदक के 2.5 एमएल में स्टॉक का 10 माइक्रोन)।
  10. प्रति स्लाइड एंटी-माउस IgG काम करने वाले अभिकर्मक के 400 माइक्रोन जोड़ें। 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  11. प्रत्येक 2 मिनट के लिए एक 1x पीबीएस-टी स्नान में दो बार स्लाइड धो लें. CD45 धुंधला प्रोटोकॉल (8.11 - 8.19 कदम) में उल्लिखित चरणों के बाद धुंधला जारी रखें.

10. LFB और H&E demilating घावों की उपस्थिति के लिए स्कोरिंग

नोट: निम्नलिखित एक विश्लेषण दृष्टिकोण है जिसे भड़काऊ डिमाइलिनेशन की गंभीरता में तेजी से अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह विश्लेषण विभिन्न स्तरों (ग्रीवा, वक्ष और काठ, कम से कम 3 वर्गों प्रति / स्तर) पर नमूना कॉर्ड के वर्गों में आयोजित किया जाता है। रीढ़ की हड्डी के शारीरिक स्तर की पहचान करने में मदद करने के लिए माउस रीढ़ की हड्डी26 के लिए एलन ब्रेन एटलस का संदर्भ लें। इस विश्लेषण के लिए TIFF फ़ाइलों की आवश्यकता होती है। यदि स्कैन की गई छवियाँ .czi स्वरूप में हैं, तो czi फ़ाइलों को TIFF फ़ाइलों में कनवर्ट करने के लिए पूरक तालिका 4 में दिए गए निर्देशों का पालन करें।

  1. फ़ाइल को ImageJ में खींचकर और छोड़ कर विश्लेषण किए जाने वाले अनुभाग की TIFF छवि खोलें। 4 चतुर्थांशों में रीढ़ की हड्डी अनुभाग का निरीक्षण करें: पृष्ठीय, बाएं पार्श्व, दाएं पार्श्व, और पूर्वकाल (चित्रा 2ए, बी)।
  2. चित्रा 2 में दर्शाया के रूप में प्रत्येक चतुर्थांश में demyelinating घावों की उपस्थिति के लिए स्कोर.
    नोट: एक घाव की उपस्थिति के परिणामस्वरूप उस चतुर्थांश में 1 का स्कोर होता है, प्रति खंड कुल 4 संभावित बिंदुओं के लिए। 1 का स्कोर सौंपा जाता है, भले ही एक चतुर्थांश के भीतर कई घाव हों।
  3. प्रत्येक माउस के लिए सभी अंक जोड़ें और उप meningeal घावों के साथ quadrants के अंश प्राप्त करने के लिए नमूना quadrants की कुल संख्या से विभाजित.

11. रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ में एलएफबी-धुंधला के क्षेत्र अंश की गणना

नोट: यह विश्लेषण रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ के प्रतिशत क्षेत्र अंश को मापता है जो एलएफबी के साथ दाग हुआ है।

  1. फ़ाइल को ImageJ में खींचकर/छोड़ कर TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजे गए LFB-दाग वाले अनुभाग को खोलें।
  2. छवि पर क्लिक करें > ग्रे स्केल छवि बनाने के लिए > 8-बिट टाइप करें। Image > Adjust > Threshold पर क्लिक करें। नीचे स्लाइडर को समायोजित करें ताकि लाल ओवरले आंख से देखे गए सभी अंधेरे क्षेत्रों (माइलिन) को पकड़ ले (चित्र 2C-E)। अप्लाई पर क्लिक करें।
  3. ROI प्रबंधक खोलने के लिए Analyze > Tools > ROI Manager पर क्लिक करें।
  4. ImageJ टूल बार पर बहुभुज आरेखण उपकरण का चयन करें. यह ड्राइंग टूल कंप्यूटर माउस के साथ रीढ़ की हड्डी के एक क्षेत्र को रेखांकित करने की अनुमति देता है।
  5. रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय क्षेत्र को रेखांकित करें और कीबोर्ड पर t पर क्लिक करके आरओआई प्रबंधक में बहुभुज जोड़ें।
  6. रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ के पूर्वकाल-पार्श्व क्षेत्र को रेखांकित करें और आरओआई प्रबंधक में बहुभुज जोड़ें।
    नोट: अनुरेखण करते समय, बड़े रक्त वाहिकाओं, ऊतकों, कलाकृतियों और पृष्ठीय सींग (चित्रा 2ए, बी तीर) से सटे क्षेत्रों को छोड़कर, जो सामान्य रूप से कम माइलिनेटेड होते हैं। ट्रेसिंग करते समय जितना संभव हो उतना सटीक रहें क्योंकि बहुत अधिक सफेद पृष्ठभूमि शामिल करने से परिणाम तिरछे हो जाएंगे।
  7. Analyze > Set Measurements पर क्लिक करें और Area Fraction चुनें।
  8. ROI प्रबंधक में माप पर क्लिक करें। यह उल्लिखित क्षेत्र का अंश देगा जो एलएफबी के साथ दाग है।
  9. नए उत्पादित परिणाम बॉक्स से, एक्सेल में मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और छवि विंडो बंद करें। पृष्ठीय और वेंट्रो-पार्श्व क्षेत्रों के लिए सना हुआ औसत% अंश क्षेत्र की गणना करें। उस अनुभाग के लिए मूल्य प्राप्त करने के लिए इनका औसत निकालें।
  10. गर्भाशय ग्रीवा, वक्ष और काठ का वर्गों (एन = 3/स्तर/माउस) के लिए चरण 11.1-11.9 दोहराएं।
  11. प्रत्येक माउस के लिए सभी वर्गों के लिए औसत प्रतिशत माइलिन अंश की गणना करें। प्रतिशत demyelination % क्षेत्र धुंधला 100 से घटा कर अनुमान है.

12. CD45+ कोशिकाओं और SMI-32+ अक्षतंतु अंडाकार की संख्या का विश्लेषण

  1. CD45 या SMI-32 दाग वाली TIFF छवि को ImageJ में खींचें और छोड़ें। सभी छवियों में स्केल बार सेट करने के लिए Analyze > Set Scale > Global > Ok पर क्लिक करें। ध्यान दें कि यह केवल पहली छवि के लिए किया जाता है।
  2. बहुभुज आरेखण उपकरण का चयन करें और कंप्यूटर माउस का उपयोग करके ग्रे पदार्थ के चारों ओर ट्रेस करें। माप का विश्लेषण >करें पर क्लिक करें और एक्सेल में परिणामों को "ग्रे मैटर एरिया" के रूप में रिकॉर्ड करें।
  3. छवि पर अभी भी खींचे गए बहुभुज के साथ, डिलीट कुंजी (कीबोर्ड) पर क्लिक करके छवि से ग्रे पदार्थ को हटा दें। यह क्रिया केवल सफेद पदार्थ का विश्लेषण करने के लिए छोड़ देती है।
  4. बहुभुज ड्राइंग टूल का उपयोग करके पूरे रीढ़ की हड्डी अनुभाग को रेखांकित करें। ऊतक के किसी भी क्षेत्र को छोड़ दें जो लापता या क्षतिग्रस्त हैं।
  5. Analyze > Measure पर क्लिक करें और Excel फ़ाइल में परिणामों को "Total Tissue Area" के रूप में रिकॉर्ड करें।
  6. Image > Color > Colour Deconvolution पर क्लिक करें। वैक्टर ड्रॉप-डाउन विंडो से H DAB चुनें। तीन नई विंडो दिखाई देंगी - ब्राउन हाइड विंडो (डीएबी चैनल) रखें और अन्य इमेज विंडो हटाएं।
  7. Image > Adjust > Threshold पर क्लिक करें। छवि को थ्रेशोल्ड करने के लिए नीचे स्लाइडर को समायोजित करें ताकि लाल ओवरले आंख द्वारा पता लगाए गए भूरे रंग के धुंधला की समान मात्रा को कैप्चर करे। अप्लाई पर क्लिक करें।
  8. Process > Binary > Watershed पर क्लिक करें। इस चरण में मूल छवि और बाइनरी छवि की तुलना यह सुनिश्चित करने के लिए करें कि वे समझौते में हैं।
  9. Analyze > Analyze Pculs पर क्लिक करें। ओवरले दिखाएं चुनें और सेटिंग्स को संशोधित करें: आकार = 5 - 150 माइक्रोन2, परिपत्र = 0.4 - 1। ओके पर क्लिक करें।
    नोट: ये सेटिंग्स अलग-अलग कोशिकाओं और कोशिकाओं के छोटे समूहों के लिए अनुमति देती हैं जो विश्लेषण में बाहर किए जाने के विरोध में वाटरशेड फ़ंक्शन के साथ विभाजित नहीं थे।
  10. परिणाम विंडो में, Excel में सबसे बाईं ओर के कॉलम में अंतिम संख्या रिकॉर्ड करें, जो कुल कण गणना का प्रतिनिधित्व करता है। फिर, सफेद पदार्थ क्षेत्र (कुल ऊतक क्षेत्र - मिमी2 में ग्रे पदार्थ क्षेत्र) की गणना. सफेद पदार्थ क्षेत्र प्रति कुल कण गणना व्यक्त करें (गिनती/मिमी2)।
  11. प्रत्येक सहेजी गई RGB छवि के लिए चरणों को दोहराएं। एक बार सभी रीढ़ की हड्डी वर्गों एक माउस के लिए विश्लेषण किया गया है, उस माउस के लिएमिमी 2 ऊतक प्रति कण गिनती औसत.
    नोट: रीढ़ की हड्डी ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्कफ़्लो को मस्तिष्क क्षेत्रों पर भी लागू किया जा सकता है।

13. SIMOA परख का उपयोग करके sNF-L का मापन

  1. केशिका माइक्रोटेनर ट्यूबों का उपयोग करके या एक सिरिंज और 25 जी सुई (टर्मिनल प्रक्रिया) का उपयोग करके कार्डियक पंचर के माध्यम से सफ़ीन ब्लीड द्वारा जीवित चूहों से 100-200 माइक्रोन रक्त एकत्र करें। उत्तरार्द्ध के लिए, रक्त को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रक्त को थक्का बनने दें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 2660 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नमूने और ऊपरी अंश (सीरम) को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। उपयोग के लिए तैयार होने तक सीरम को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. तैयारी: उपयोग करने से पहले 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए कैलिब्रेटर और नियंत्रण (एनएफ-प्रकाश परख किट, सामग्री की तालिकादेखें) की अनुमति दें।  रेफ्रिजरेटर से बाहर एंजाइम सब्सट्रेट (आरजीपी) ले लो और कम से कम 30 मिनट के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस waterbath में जगह, भंवर हर 10 मिनट.
  5. बर्फ पर सीरम के नमूनों को पिघलाएं। एक बार पिघल जाने के बाद, धीरे भंवर नमूने और अपकेंद्रित्र किसी भी मलबे को गोली मारने के लिए 5 मिन के लिए 10000 x ग्राम पर।
  6. प्लेट लोड करें: भंवर अंशशोधक और नियंत्रण। डुप्लिकेट में कैलिब्रेटर लोड करें, डुप्लिकेट में नियंत्रण, और किट के साथ प्रदान की गई 96-अच्छी प्लेट पर डुप्लिकेट में सीरम नमूने। सीरम नमूनों को किट में प्रदान किए गए मंदक के साथ 1: 3 अनुपात में पतला किया जाता है।  प्लेट को सील करें।
  7. कंप्यूटर, प्रोग्राम और फिर मशीन के क्रम में SIMOA मशीन ( सामग्री की तालिकादेखें) चालू करें। मशीन को प्रारंभ करने और दिन के रखरखाव की शुरुआत को चलाने की अनुमति दें।
  8. भंवर 30 s के लिए चुंबकीय मोती.
  9. स्क्रीन पर लोड अभिकर्मकों टैब, रैक स्थिति जहां अभिकर्मक बोतल रखा जा रहा है डबल क्लिक, और फिर बोतल के बारकोड स्कैनिंग.
  10. रैक पर मिलाते हुए स्थिति में चुंबकीय मोती रखें (स्थिति 1-3)।
  11. जारी रखें, मशीन में डिटेक्टर, एसबीजी अभिकर्मक और आरजीपी अभिकर्मक लोड करना।
  12. सॉफ्टवेयर पर सेटिंग पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि नमूना मोड प्लेट पर है। सेटअप रन टैब में, प्रयोग को नाम दें.
  13. अंशशोधकों के लिए प्लेट पर कुएं निम्नानुसार असाइन करें: कुएं पर क्लिक करें, फिर परख का चयन करें। कैलिब्रेट A का चयन करें और फिर आरोही पर क्लिक करें। कुओं A1-8 हाइलाइट करें फिर क्लिक करें प्रतिकृति (2) कैलिब्रेटर को डुप्लिकेट में चलाने के लिए निर्देशांक असाइन करने के लिए। स्वच्छ प्रोटोकॉल का उपयोग करके चलाएं।
    नोट: प्रत्येक विशेष लॉट नंबर के लिए प्रत्येक कैलिब्रेटर की सांद्रता प्राप्त करने के लिए विश्लेषण प्रमाणपत्र (निर्माता वेबसाइट) देखें। एक बार कुओं को सौंपे जाने के बाद, काम खोए बिना इस स्क्रीन से दूर नेविगेट करना संभव नहीं है, जब तक कि प्लेट जगह में बंद न हो जाए।
  14. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके नमूने असाइन करें:
    1. स्क्रीन के नीचे दाईं ओर से, नमूने असाइन करने के लिए बटन पर क्लिक करें। कुओं को हाइलाइट करें जहां नमूने स्थित हैं।
    2. सूची से चलाए जाने वाले परख की जाँच करें, प्रतिकृतियों की संख्या चुनें, और 4x के ऑनबोर्ड कमजोर पड़ने को निर्दिष्ट करें।
    3. कुओं अभी भी प्रकाश डाला के साथ, नमूना आईडी और प्रारंभिक संख्या के लिए एक उपसर्ग दर्ज करें और फिर नमूने के लिए अनुक्रमिक आईडी का उत्पादन करने के लिए उत्पन्न पर क्लिक करें. नियंत्रण नमूनों के लिए चरणों को दोहराएं।
  15. प्लेट होल्डर में प्लेट लोड करें (A1 से A12)।
  16. स्क्रीन इंटरफ़ेस पर, किए गए प्रोग्रामिंग नमूनों पर क्लिक करें और सिस्टम संसाधन टैब पर आगे बढ़ें। जांचें कि सभी अभिकर्मक कंटेनर भरे हुए हैं और अपशिष्ट कंटेनर खाली हैं।
  17. रन पर क्लिक करें।
  18. रन पूरा हो गया है, परख और प्लेट नाम का चयन करके "डेटा में कमी" टैब के तहत अंशांकन वक्र की जाँच करें.
  19. "रन हिस्ट्री" पर जाएं और सबसे हाल ही में रन खोजने के लिए फ़िल्टर का उपयोग करें। रन और फिर सभी परिणाम चुनें। निर्यात पर क्लिक करें, और .csv फ़ाइल को सहेजें। रिपोर्ट पर क्लिक करें और फिर बैच अंशांकन रिपोर्ट का चयन करें और हाल ही में रन का चयन करें। रिपोर्ट का पूर्वावलोकन करें और उसे निर्यात करें.
  20. निर्माता द्वारा अनुशंसित दिन के अंत में रखरखाव चलाएं। प्रोग्राम, मशीन और फिर कंप्यूटर बंद करें।

Representative Results

चित्रा 3 प्रतिनिधि आईएचसी और हिस्टोकेमिकल धुंधला दिखाता है, दोनों तीव्र (बाएं) और पुराने ईएई घावों (दाएं) के उदाहरण के साथ। हेमेटोक्सिलिन काउंटरस्टेनिंग के साथ प्रतिनिधि सीडी 45 धुंधला हो जाना चित्रा 3 ए, बी में दिखाया गया है।  चित्रा 3 सी-एफ एलएफबी धुंधला के उदाहरण दिखाते हैं (चित्रा 3 सी, डी) या बिना (चित्रा 3ई, एफ) एच एंड ई काउंटरस्टेन। हालांकि हेमेटोक्सिलिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के नाभिक अधिक अंधेरे से दाग देते हैं और सीएनएस निवासी कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। चित्रा 3 जी, एच एसएमआई -32 + अक्षतंतु के प्रतिनिधि धुंधला हो जाना, hematoxylin के साथ counterstained. पुराने ईएई घावों में इस दाग की बढ़ी हुई उपस्थिति पर ध्यान दें।

माइलिनेटेड पटरियों का नुकसान सक्रिय murine EAE में रीढ़ की हड्डी में सबसे अधिक प्रचलित है और यहइस बीमारी 7,9 में पक्षाघात का मुख्य चालक है. इस प्रकार, रीढ़ की हड्डी में सूजन और ऊतक क्षति की उपस्थिति के लिए स्कोरिंग को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण में प्राथमिकता दी जाती है। ईएई घाव छिटपुट रूप से विभिन्न क्षेत्रों (पूर्वकाल, पार्श्व या पृष्ठीय) (चित्रा 2 ए, बी) और रीढ़ की हड्डी के विभिन्न स्तरों (त्रिक, काठ, वक्ष, ग्रीवा) पर होते हैं। वर्णित एम्बेडिंग विधि पूरे कॉर्ड में घावों का अच्छा नमूना सुनिश्चित करती है। विश्लेषण की तुलना में अधिक अनुभाग एम्बेडेड हैं, क्योंकि कुछ अनुभाग प्रसंस्करण या सेक्शनिंग प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। प्रतिनिधि नमूनाकरण सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक माउस के लिए रीढ़ की हड्डी के ग्रीवा, वक्ष और काठ का स्तर पर न्यूनतम 3 प्रतिनिधि वर्गों का विश्लेषण किया जाता है। प्रत्येक नमूने की पहचान को अंधा कर दिया जाता है ताकि विश्लेषण करने वाला व्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि वर्गों का चयन करते समय पक्षपाती न हो।

ईएई की हिस्टोलॉजिकल गंभीरता में अंतर में त्वरित अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, चयनित वर्गों (चित्रा 2ए, बी) में रीढ़ की हड्डी के चतुर्थांशों में उप-मेनिंगियल डिमाइलेटिंग घावों की उपस्थिति के लिए स्कोर कर सकते हैं। यह एक तेज़ विधि है जिसे स्कैन की गई छवियों पर या प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है। यह विश्लेषण समूहों के बीच हिस्टोलॉजिकल ईएई गंभीरता में अंतर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है जब ईएई एक समूह में गंभीर है और दूसरे में हल्का है। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 में प्रयोग में, EAE MOG p35-55/CFA प्लस PTX का उपयोग कर OGR1 (OGR1 KO) में एक विलोपन के साथ महिला जंगली प्रकार (WT) और चूहों में प्रेरित किया गया था. डब्ल्यूटी समूह में चूहों ने पूर्ण पक्षाघात के साथ गंभीर ईएई विकसित किया, जबकि ओजीआर 1 नॉकआउट समूह ने हल्के रोग विकसित किए। नैदानिक स्कोर में यह अंतर चतुर्भुजों के अंश में अंतर के अनुरूप था जिसमें उप-मेनिंगियल घाव(चित्रा 4सी)था।

ऑटोइम्यून हमले के दौरान माइलिन और/या माइलिनेटेड अक्षतंतु के नुकसान की सीमा को पकड़ने के लिए माइलिन धुंधला के प्रतिशत क्षेत्र अंश के साथ डिमाइलेटिंग घावों के स्कोरिंग को पूरक करना महत्वपूर्ण है। चित्रा 4 में उदाहरण में, प्रतिशत माइलिन अंश भी ओजीआर 1 और डब्ल्यूटी चूहों (चित्रा 4 डी) के बीच स्पष्ट रूप से भिन्न था। प्रतिशत माइलिन अंश भी ईएई(चित्रा 4ई)के साथ चूहों में संचयी ईएई स्कोर के साथ काफी सहसंबंधित है और इसलिए इस बीमारी में समग्र ऊतक क्षति का एक अच्छा उपाय के रूप में कार्य करता है। ध्यान दें कि यह प्रोटोकॉल माइलिन दाग की तीव्रता को अलग नहीं करता है। यदि यह वांछित परिणाम है, तो किसी को प्रोटीओलिपिड प्रोटीन या माइलिन मूल प्रोटीन जैसे माइलिन प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना चाहिए और इस धुंधला की तीव्रता को मापना चाहिए।

ऐसे मामले में जहां ईएई दोनों तुलनित्र समूहों में गंभीर है, रीढ़ की हड्डी के चतुर्थांश के एक उच्च अंश में भड़काऊ / इस मामले में, सूजन स्कोर करने के लिए एक अधिक संवेदनशील दृष्टिकोण सीडी 45 + ल्यूकोसाइट्स प्रति मिमी2 सफेद पदार्थ की संख्या की गणना करना है ( चित्रा 3 ए में प्रतिनिधि धुंधला देखें)। यहां वर्णित सीडी 45 एंटीबॉडी क्लोन सभी घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स का पता लगाता है, और केवल कभी-कभी माइक्रोग्लिया को दाग देता है जो ईएई में सीडी 45 अभिव्यक्ति को अपग्रेड करता है ( चित्रा 3 बी में खुला तीर देखें) और इसलिए परिधीय प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ पर कब्जा करने में उपयोगी है।

लंबी अवधि के ईएई अध्ययन (>20 दिन) में, यह अनुशंसा की जाती है कि कोई अक्षतंतु की चोट का विश्लेषण भी करे। रीढ़ की हड्डी के वर्गों में एसएमआई -32 धुंधला क्षतिग्रस्त अक्षतंतु का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका है। हालांकि रीढ़ की हड्डी में सूजन समय के साथ कम हो जाती है और बख्शे गए अक्षतंतु फिर से माइलिनेट कर सकते हैं, जीवित अक्षतंतु अवशिष्ट चोट9(चित्रा 3जी,एच)की एक अंतर सीमा प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, C57BL6/J चूहों में EAE के MOG p35-55-प्रेरित मॉडल में, भड़काऊ प्रक्रिया 9कम होने के बाद अक्षीय चोट और हानि की सीमा नैदानिक स्कोर का चालक है। चित्रा 5 नर और मादा चूहों डब्ल्यूटी चूहों और चूहों में ईएई प्रयोग में इसका एक उदाहरण दिखाता है जो माइलॉयड डिब्बे (लिस्मक्रे: पर्डएफएल / एफएल) में पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़रेटर-सक्रिय रिसेप्टर-डेल्टा (पीपीएआर-डेल्टा) नामक जीन में कमी है। पुरुषों में, डब्ल्यूटी चूहों ने हिंडलिंब फ़ंक्शन को पुनः प्राप्त किया, फिर भी पुरुष लिस्मक्रे: पर्डएफएल / एफएल समूह में नैदानिक स्कोर उच्च रहे। इसके विपरीत, महिलाओं में प्रयोग में, दोनों प्रयोगात्मक समूहों में उच्च स्कोर थे। पहली नज़र में, इस परिणाम ने सुझाव दिया कि ईएई में पीपीएआर-डेल्टा का सेक्स-विशिष्ट प्रभाव था; हालांकि, रीढ़ की हड्डी के पैथोलॉजिकल स्कोरिंग से पता चला कि लिस्म क्रे में दोनों लिंगों के चूहों: पर्डएफएल / एफएल समूह ने डब्ल्यूटी समकक्षों (चित्रा 5बी) की तुलना में एक्सोनल चोट में वृद्धि की थी। नैदानिक स्कोर पर एक जीनोटाइप प्रभाव संभवतः महिलाओं में नहीं देखा गया था क्योंकि डब्ल्यूटी मादा चूहों ने एक्सोनल चोट में वृद्धि का प्रदर्शन किया था, जो पुरानी न्यूरोलॉजिकल घाटे में प्रकट हुआ था।

इसी प्रयोग में, महिला LysMCre: Ppardfl / fl मादा चूहों को सेरिबैलम में अधिक व्यापक टी सेल घुसपैठ पाया गया, जो ईएई में मस्तिष्क की सूजन को कैसे उपयोगी बना सकता है, इसका एक उदाहरण प्रदान करता है। ईएई में, मस्तिष्क में सूजन मुख्य रूप से सेरिबैलम और मस्तिष्क स्टेम(चित्रा 6ए,डी,जी)में पाई जाती है, लेकिन निलय (चित्रा 6एफ)के पास, मेनिन्जेस (चित्रा 6सी) में हिप्पोकैम्पस के तहत देखी गई, और ऑप्टिक तंत्रिका और कॉर्पस कोलोसम(चित्रा 6बी,ई)सहित अन्य सफेद पदार्थ ट्रैक्ट में भी पाया जा सकता है। स्कोरिंग मस्तिष्क की सूजन एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र (जैसे, अनुमस्तिष्क सफेद पदार्थ) में रीढ़ की हड्डी प्रोटोकॉल के लिए उल्लिखित एक ही पद्धति का उपयोग करके मिमी2 ऊतक क्षेत्र प्रति सीडी 45 कोशिकाओं की संख्या की गणना करके किया जाता है। यहां उल्लिखित ग्रॉसिंग विधि में, सेरिबैलम के बीच में एक कट होता है, जो सेरिबैलम और मस्तिष्क स्टेम के परिप्रेक्ष्य को प्रदान करता है जैसा कि चित्रा 6 ए में दिखाया गया है।

SIMOA परख का उपयोग करके sNF-L को मापना चल रही axonal चोट का आकलन करने और MS20,21,27,28 को पुनरावर्तन-प्रेषण में चिकित्सा के प्रति प्रतिक्रियाओं के लिए एक उपयोगी बायोमार्कर बन गया है। sNF-L मनुष्यों को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही SIMOA परख किट को माउस sNFL22,23,24 को मापने के लिए लागू किया जा सकता है। यह पता लगाने के लिए कि यह परख ईएई में अक्षीय चोट का पता लगा रहा है, एसएफएन-एल को ईएई प्रयोग के अंत-बिंदु पर महिला सी 57 बीएल 6 / जे चूहों में मापा गया था और स्तरों की तुलना सेक्स-मिलान वाले स्वस्थ नियंत्रण चूहों में की गई थी जिनके पास ईएई नहीं था। यह पाया गया कि ईएई के साथ चूहों में स्वस्थ चूहों (चित्रा 7 ए) की तुलना में एसएफएन-एल का स्तर बहुत अधिक था और ये स्तर रीढ़ की हड्डी(चित्रा 7बी)में एसएमआई-32+ अक्षतंतु के घनत्व के साथ सहसंबद्ध थे। एक्सोनल चोट के हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग की तुलना में, सिमोआ परख तेज है (रक्तस्राव चूहों से परिणाम केवल आधे दिन में प्राप्त किया जा सकता है) और इसलिए जीवित चूहों में उपचार कैसे काम कर रहा है, इसकी तेजी से प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इस परख का यह भी फायदा है कि यह रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क दोनों में अक्षीय चोट को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी वर्गों के प्रतिनिधि पैराफिन ब्लॉक। 5 कोरोनल मस्तिष्क खंड और रीढ़ की हड्डी के क्रॉस सेक्शन (1.5-2 मिमी मोटे) एक ही ब्लॉक में एम्बेडेड हैं ताकि उन्हें एक खंड में काटा जा सके। रीढ़ की हड्डी के कम से कम 15 वर्गों एम्बेडेड किया जाना चाहिए, विश्लेषण के लिए वर्गों के पर्याप्त चयन के लिए अनुमति देता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वक्ष रीढ़ की हड्डी के स्तर पर मेनिंगियल सूजन और प्रतिशत माइलिन क्षेत्र स्कोरिंग। (ए, बी) एक महिला C57BL6/J माउस से वक्षीय रीढ़ की हड्डी की छवियों को MOG p35-55-प्रेरित EAE के साथ LFB/H&E के साथ दाग के साथ दिखाते हैं। दिखाया गया दृष्टिकोण है जिसका उपयोग चतुर्भुजों और डिमाइलेटिंग घावों के उदाहरणों (बिंदीदार रेखा में पता लगाया गया) की कल्पना करने के लिए किया जाता है। ए में माउस में 4 के 4 चतुर्थांश हैं जिनमें संगम डिमाइलेटिंग घाव हैं, जबकि बी में माउस में 4 चतुर्थांश प्रभावित होते हैं। बी में माउस अन्य quadrants में कुछ सूजन है, लेकिन यह एक संगम घाव में प्रकट नहीं हुआ है और इसलिए स्कोर नहीं किया है. (सी-ई) LFB छवि का उदाहरण, और imageJ में ग्रेस्केल और थ्रेशोल्ड छवि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रीढ़ की हड्डी के खंड सीडी 45, एलएफबी एच एंड ई, एलएफबी और एसएमआई -32 के साथ दाग गए। सीडी 45 एंटीबॉडी (ए, बी), एलएफबी / एच एंड ई (सी, डी), अकेले एलएफबी (ई, एफ), और एसएमआई -32 एंटीबॉडी (जी, एच) के लिए रीढ़ की हड्डी में एक प्रारंभिक (ए, सी, ई, जी) और देर से (बी, डी, एफ, एच) उप-मेनिंगियल घाव के उदाहरण। काले तीर प्रत्येक संबंधित एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं के उदाहरण दिखाते हैं। सफेद तीर ख्यात माइक्रोग्लिया दिखाते हैं जिन्हें सीडी 45+ के रूप में दाग दिया गया है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा ईएई के दौरान एक महिला C57BL6/J माउस की रीढ़ की हड्डी में घावों के प्रतिनिधि धुंधला को दर्शाता है और इस बात पर प्रकाश डालता है कि विभिन्न रीढ़ की हड्डी के वर्गों में पैथोलॉजी कैसे भिन्न हो सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईएई में घावों और प्रतिशत demyelination के लिए स्कोरिंग का आवेदन। दिखाया गया एक ईएई प्रयोग का एक उदाहरण है जहां सी 57 बीएल 6 / जे पृष्ठभूमि पर डिम्बग्रंथि के कैंसर जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 1 (ओजीआर 1) जीन में कमी वाली महिला चूहों ने वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) महिला सी 57 बीएल 6 / जे चूहों की तुलना में कम गंभीर नैदानिक ईएई विकसित किया। ईएई को एमओजी पी 35-55 / सीएफए प्लस पीटीएक्स के साथ टीकाकरण द्वारा प्रेरित किया गया था और चूहों को निम्नलिखित नैदानिक पैमाने के अनुसार स्कोर किया गया था: 1 = पूंछ पक्षाघात। 2 = हिंडलिंब और पैर की कमजोरी, 3 = हिंदलिंब पक्षाघात, 4 = अग्रभाग कमजोरी, 5 = मरणासन्न। (ए) मीन + एसईएम समय के साथ चूहों के नैदानिक स्कोर। (बी) दिखाया गया उदर रीढ़ की हड्डी में एलएफबी/एच&ई धुंधला होने का एक उदाहरण है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (सी) माध्य + एसईएम प्रतिशत चतुर्थांश जिसमें डिमाइलेटिंग घाव होते हैं। (D) प्रत्येक समूह में माध्य + SEM प्रतिशत विघटन। (ई) सी 57 बीएल 6 / जे चूहों में एमओजी पी 35-55-प्रेरित ईएई में एक और प्रयोग से परिणाम दिखाता है जहां व्यक्तिगत चूहों के ईएई स्कोर को 30 दिनों के अवलोकन में अभिव्यक्त किया गया था और रीढ़ की हड्डी में प्रतिशत विघटन के साथ सहसंबद्ध किया गया था। सहसंबंध एक स्पीयरमैन परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। (ए-डी) में पैनल सूजा सी एट अल.29से अनुकूलित हैं। (ई) में डेटा मूल डेटा हैं। *पी<0.05, **पी<0.01, ***पी<0.001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नैदानिक ईएई फेनोटाइप पर जीनोटाइप के प्रभाव को समझने के लिए एसएमआई -32 धुंधला हो जाना का अनुप्रयोग। यह आंकड़ा एक ईएई प्रयोग का एक उदाहरण दिखाता है जहां नर और मादा वाइल्डटाइप ( पर्ड के फ्लॉक्स्ड एलील ले जाते हैं) और सी 57 बीएल 6/जे पृष्ठभूमि पर माइलॉयड विशिष्ट पर्ड उत्परिवर्ती चूहों (लिस्मक्रे: पर्डएफएल / एफएल) को एमओजी पी 35-55 / सीएफए और पीटीएक्स के साथ प्रतिरक्षित किया गया था और 45 दिनों के लिए पीछा किया गया था। (ए) चूहों के माध्य + एसईएम नैदानिक स्कोर दिखाता है। (बी) रीढ़ की हड्डी में एसएमआई -32 + अक्षतंतु की संख्या के हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग के माध्य + एसईएम परिणाम दिखाता है, सबमेनिंगियल घावों के साथ% चतुर्थांश, पेरिवास्कुलर कफ के साथ प्रतिशत चतुर्थांश, और सेरिबैलम प्रति मिमी2 ऊतक में #CD3 घाव। इस प्रयोग ने एसएमआई -32 धुंधला पर एक जीनोटाइप प्रभाव दिखाया। यह आंकड़ा ड्रोहोमिरेकी से अनुकूलित है। एट अल।15. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: महिला सी 45 बीएल 55/जे चूहों में एमओजी पी 35-55-प्रेरित ईएई में मस्तिष्क कोरोनल वर्गों में सीडी 6 + / हेमेटोक्सिलिन धुंधला होने के उदाहरण। CD45+ घावों को भूरे रंग में दिखाया गया है। (ए) कोरोनल वर्गों के मस्तिष्क स्टेम में सीडी 45+ घाव। स्केल बार = 150 माइक्रोन। (बी-जी) ऑप्टिक नसों (बी) में सीडी 45+ घावों के उदाहरण, हिप्पोकैम्पस (सी), मस्तिष्क स्टेम (डी), कॉर्पस कोलोसम (ई), वेंट्रिकल (एफ) के पास औसत दर्जे का हैबेनुला और सेरिबैलम (जी)।  स्केल बार: (बी-जी) = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एमओजी पी 35-55-प्रेरित ईएई में सीरम में एसएफएन-एल स्तर। (ए) सीरम एनएफएल स्तर एक प्रयोग के अंत बिंदु पर महिला नियंत्रण और ईएई चूहों से एकत्र किया गया। दो-पूंछ वाले मान व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। (**** पी मान < 0.0001)। (बी) रीढ़ की हड्डी वर्गों अंत बिंदु पर काटा और एसएमआई 32 के साथ दाग रहे थे. सफेद पदार्थ ऊतक क्षेत्र प्रति सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित की गई थी और एक स्पीयरमैन परीक्षण का उपयोग करके समापन बिंदु पर सीरम एनएफ-एल के साथ सहसंबद्ध थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: ऊतक प्रसंस्करण में उपयोग किए जाने वाले स्नान का विवरण। कैसेट स्वचालित रूप से एक स्वचालित प्रोसेसर का उपयोग करके स्नान की इन श्रृंखलाओं के माध्यम से स्थानांतरित हो जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: Luxol फास्ट ब्लू और Hematoxylin और Eosin धुंधला में कदम. यह तालिका Luxol Fast Blue और Hematoxylin और Eosin धुंधला प्रोटोकॉल में चरणों के क्रम को रेखांकित करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 3: इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी। वर्णित एंटीबॉडी हैं जो इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाते हैं और साथ ही जिनका उपयोग सूजन, माइक्रोग्लियोसिस और एस्ट्रोग्लिओसिस का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 4: .czi को TIFF फ़ाइलों में कनवर्ट करने के लिए कैसे। ध्यान दें कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि का उपयोग करना इष्टतम है, लेकिन मध्यम-रिज़ॉल्यूशन छवियों को इसके बजाय सहेजा जा सकता है यदि कंप्यूटर की कार्यशील मेमोरी सीमित है। विश्लेषण में एक ही संकल्प की छवियों का उपयोग करना अनिवार्य है। साथ ही, ध्यान दें कि श्रृंखला की अंतिम छवि स्लाइड लेबल है। यह सुनिश्चित करने के लिए लेबल को पढ़ने से बचें कि विश्लेषण अंधा हो गया है। 30,31 कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

रीढ़ की हड्डी का हिस्टोलॉजिकल धुंधला हो जाना ईएई रोग की गंभीरता का आकलन करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, खासकर ऐसे उदाहरणों में जहां रोग के बाद के तीव्र चरण में रोग की वसूली की सीमा में उपचार समूहों के बीच मतभेद हैं। प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ (सीडी 45), माइलिन (एलएफबी) और अक्षीय चोट (एसएमआई -32) के लिए धुंधला चूहों में परिवर्तित नैदानिक स्कोर के अंतर्निहित कारण को चिह्नित करने में मदद करता है। यहाँ वर्णित हिस्टोलॉजिकल धुंधला प्रोटोकॉल सूजन के साथ-साथ माइलिन और एक्सोनल चोट की सीमा का एक परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है। इसके अलावा, दिखाए गए परिणाम ईएई में समग्र न्यूरोनल क्षति की सीमा का आकलन करने के लिए एक विधि के रूप में एसएफएन-एल माप को मान्य करते हैं।

इस विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों जांचकर्ताओं वर्गों की पहचान करने के लिए अंधा कर रहे हैं और विभिन्न चूहों भर में रीढ़ की हड्डी के प्रत्येक स्तर पर बराबर नमूना है कि सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं. ऐसा इसलिए है क्योंकि कॉर्ड के निचले स्तर पर सूजन की गंभीरता अधिक हो सकती है। एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रयोगात्मक समूहों का आकार है। रीढ़ की हड्डी और दिमाग आमतौर पर समापन बिंदु पर प्रति समूह 6-8 चूहों से काटा जाता है ताकि मामूली प्रभाव आकार वाले उपचार या जीनोटाइप वाले समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर देखा जा सके। यह भी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चयनित चूहों, जब औसत, पूरे समूह के प्रतिनिधि मतलब स्कोर है. समस्या शूटिंग के बारे में, प्रोटोकॉल के साथ अनुभवहीन लोगों द्वारा सामना की जाने वाली एक आम समस्या यह है कि रीढ़ की हड्डी को अपर्याप्त लंबाई के लिए तय किया जाता है और इसे रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से आसानी से बाहर नहीं निकाला जाता है। यदि यह मामला है, तो रीढ़ की हड्डी को ठीक कैंची का उपयोग करके स्पिनस प्रक्रियाओं के साथ क्लिपिंग करके और रीढ़ की हड्डी को प्रकट करने के लिए स्तंभ खोलकर कॉलम से मैन्युअल रूप से विच्छेदित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ऊतकों एंटीबॉडी धुंधला हो जाना की सफलता के साथ हस्तक्षेप के बिना कुछ अतिरिक्त दिनों के लिए तय किया जा सकता है. यहां वर्णित एंटीबॉडी क्लोन फॉर्मेलिन में 2 सप्ताह तक तय किए गए ऊतक में काम करते हैं।

रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों को एम्बेड करने के लिए कौशल और अभ्यास की आवश्यकता होती है। यह अनुशंसा की जाती है कि आंखों के लूप पहने जाएं और एम्बेडिंग स्टेशन पर एक दीपक को निर्देशित किया जाए ताकि बेहतर कल्पना की जा सके कि क्या अनुभाग क्रॉस-सेक्शन में या अनुदैर्ध्य खंड में गिर रहे हैं। ग्रॉसिंग के दौरान रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों की लंबाई 2 मिमी से कम रखने से उन्हें क्रॉस-सेक्शन में गिरने में मदद मिलेगी। कम अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए एक और आम समस्या यह है कि एलएफबी रात भर के इनक्यूबेशन के दौरान वाष्पित हो जाता है, जिससे स्लाइड का आधा हिस्सा दाग जाता है और आधा बेदाग रह जाता है। वाष्पीकरण से बचने के लिए, ग्लास धुंधला पकवान थर्माप्लास्टिक फिल्म और फिर प्लास्टिक की चादर के साथ सील किया जाना चाहिए। यदि वाष्पीकरण होता है और वर्गों असमान दाग रहे हैं, यह पूरी तरह से लिथियम कार्बोनेट के साथ स्लाइड डी-ब्लू और रात भर LFB में उन्हें फिर से दाग करने के लिए सिफारिश की है. एक और आम समस्या यह है कि उपयोगकर्ता LFB के बाद ग्रे मैटर को पूरी तरह से डी-ब्लू नहीं करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत अलग-अलग वर्गों की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल में अन्य चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले पर्याप्त मात्रा में डी-ब्ल्यूइंग पहुंच गया है। इसके अलावा, हालांकि CD45 और SMI-32 IHC दाग मजबूती से प्रदर्शन करते हैं, फिर भी प्राप्त प्रत्येक नए एंटीबॉडी लॉट के लिए प्रारंभिक प्रयोगों में एंटीबॉडी सांद्रता को शूट करना महत्वपूर्ण है। यह एक सकारात्मक नियंत्रण अनुभाग (ईएई रीढ़ की हड्डी) पर एंटीबॉडी की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके किया जा सकता है। पहली बार धुंधला भी एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल होना चाहिए जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी शामिल हैं। अंत में, छवि विश्लेषण में अलग-अलग छवियों को थ्रेसहोल्ड करना महत्वपूर्ण है क्योंकि धुंधला स्लाइड या अनुभागों में असमान हो सकता है।

यह प्रोटोकॉल स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है। यदि किसी के पास प्रोसेसर, एम्बेडर या माइक्रोटोम तक पहुंच नहीं है, तो इन चरणों को अस्पताल-आधारित पैथोलॉजी कोर से प्राप्त किया जा सकता है जो इन सेवाओं की पेशकश करता है। इसके अलावा, अगर किसी के पास स्लाइड स्कैनर तक पहुंच नहीं है, तो कोई एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सकता है जो रीढ़ की हड्डी या मस्तिष्क क्षेत्रों की टीआईएफएफ छवियों को बचाने के लिए एक वीडियो कैमरा के साथ फिट है। माइक्रोस्कोप-आधारित वर्कफ़्लो के लिए, कम शक्ति (40x आवर्धन) पर LFB या LFB/H&E अनुभागों को कैप्चर करें और CD45 और SMI-32 धुंधला हो जाना के लिए, कम से कम चार विंडो जो उदर, पृष्ठीय और रीढ़ की हड्डी के पार्श्व भागों में केंद्रित हैं (CD45 के लिए 200x आवर्धन और SMI-32 के लिए 400x आवर्धन)। छवि विश्लेषण इन छवियों पर किया जा सकता है के रूप में वर्णित तरीके से एक समान तरीके से मात्रा निर्धारित करने के लिए.

ईएई स्कोर करने के लिए क्या हिस्टोलॉजिकल दृष्टिकोण लेने का निर्णय इस बात पर निर्भर करता है कि समूहों के बीच नैदानिक स्कोर कितना भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, यदि ईएई नैदानिक स्कोर में भारी अंतर हैं (एक समूह को ईएई मिला और एक को नहीं), तो यह आमतौर पर परिधीय-मध्यस्थता सूजन में अंतर से संबंधित है। इस मामले में, एलएफबी/एच&ई-दाग वाले वर्गों पर डिमाइलेटिंग घावों की उपस्थिति के लिए स्कोरिंग पर्याप्त है और समूहों के बीच अंतर प्रकट करेगा। यदि समूह शुरुआत में नैदानिक स्कोर में अधिक समान होते हैं और नैदानिक वसूली (जैसे चित्रा 5 ए में प्रयोग) की सीमा में अंतर होते हैं, तो मस्तिष्क स्टेम और सेरिबैलम में मस्तिष्क की सूजन के स्कोरिंग सहित यहां उल्लिखित पूर्ण हिस्टोलॉजिकल वर्कफ़्लो को लागू करना सबसे अच्छा है, यह भेद करने के लिए कि क्या रोग जीर्णता के अंतर सूजन या ऊतक क्षति में अंतर से संबंधित हैं।  यदि सीडी 45 गिनती द्वारा मूल्यांकन के रूप में सूजन में अंतर पाया जाता है, तो टी कोशिकाओं (एंटी-सीडी 3), घुसपैठ मोनोसाइट / मैक्रोफेज (मैक 3) और माइक्रोग्लिया (आईबीए -1 / TMEM119) (अनुशंसित एंटीबॉडी क्लोन पूरक तालिका 3 में हैं) के लिए दाग के लिए आगे आईएचसी अध्ययन किया जा सकता है। माइक्रोग्लिया सक्रियण डबल-लेबल वाले इबा-1 + टीएमईएम -19 + माइक्रोग्लिया पर आईबीए -1 धुंधला की तीव्रता में वृद्धि और माइक्रोग्लिया प्रक्रियाओं की वृद्धि हुई वापसी से परिलक्षित होता है जिसका मूल्यांकन धारा32 पर शॉल विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री या एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण जैसी तकनीकों को मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा आबादी की आवृत्ति और फेनोटाइप के गहन लक्षण वर्णन का संचालन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

SMI-32+ अक्षतंतु की गिनती EAE 32,33 और MS34 में अक्षतंतु की चोट का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील विधि है। एसएमआई -32, जो भारी या मध्यम न्यूरोफिलामेंट के गैर-फॉस्फोराइलेटेड रूप का पता लगाता है, ट्रांसेक्ट न्यूरॉन्स के अंत-बल्बों में जमा होता है। घायल अक्षतंतु का पता लगाने के लिए एक विकल्प अमाइलॉइड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) के साथ दाग है जो बाधित अक्षतंतु परिवहन33 के परिणामस्वरूप अक्षतंतु में जमा हो सकता है। एसएमआई -32 और एपीपी के लिए धुंधला होने का पैटर्न हालांकि दोनों अक्षतंतु की चोट के चिंतनशील हैं, आम तौर पर ओवरलैप नहीं करते हैं, यह दर्शाता है कि वे विभिन्न विकृति33 का पता लगा रहे हैं। एक एसएएनएफ-एल को मापकर अक्षतंतु की चोट के हिस्टोलॉजिकल उपायों को भी पूरक कर सकता है, जो रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क दोनों में चल रही अक्षीय चोट का एक तेज़ और संवेदनशील उपाय है। यह लाभ प्रदान करता है कि यह जीवित चूहों में आधे दिन में किया जा सकता है। इस पद्धति का एक दोष यह है कि किट महंगे हैं और मशीन अत्यधिक विशिष्ट है। एसएफएन-एल किट बेचने वाली कंपनी उन लोगों के लिए सेवा के लिए शुल्क की पेशकश करती है जिनके पास सिमोआ मशीन तक पहुंच नहीं है। अक्षतंतु की चोट का आकलन करने का एक विकल्प रीढ़ की हड्डी12 के टोलुइडीन ब्लू-दाग वाले वर्गों में अक्षतंतु की गिनती करके या रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ32 के क्षेत्रों में एसएमआई -31 द्वारा पता लगाए गए न्यूरोफिलामेंट बंडलों की गिनती करके अक्षतंतु हानि के लिए स्कोर करना है। ये दोनों एसएमआई -32 या एसएफएन-एल माप की तुलना में अधिक श्रमसाध्य दृष्टिकोण हैं।

यदि ईएई नैदानिक स्कोर समूहों के बीच भिन्न होते हैं, लेकिन सूजन, डिमाइलिनेशन और एक्सोनल चोट के लिए स्कोरिंग समूहों के बीच अंतर प्रकट नहीं करता है, तो जीएफएपी का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट सक्रियण के लिए दाग उपयोगी हो सकता है (अनुशंसित एंटीबॉडी क्लोन के लिए पूरक तालिका 3 देखें)। एस्ट्रोसाइट सक्रियण जीएफएपी धुंधला में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और इसे डीए चूहे35 में क्रोनिक ईएई सहित कुछ ईएई मॉडल में ईएई प्रगति के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल तरीकों का वर्णन करता है और ईएई के हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग का संचालन करने के लिए एक विश्लेषण वर्कफ़्लो प्रदान करता है।

Disclosures

शैनन डन एफएसडी ल्यूसिड साइकेस्यूटिकल्स के लिए परामर्श करता है।

Acknowledgments

रेमंड सोबेल (स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी) को हमें मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के वर्गों को सकल करने और ठीक करने की अपनी विधि दिखाने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम काइल रॉबर्टन और मिलान गांगुली को टोरंटो सेंटर फॉर फेनोजेनोमिक्स से एम्बेडिंग विधि सीखने और हमारे मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के कई हिस्सों को काटने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम रीढ़ की हड्डी में सबमेनिंगियल और पेरिवास्कुलर सूजन स्कोर करने के लिए अपने प्रोटोकॉल साझा करने के लिए डॉ मैथ्यू कुसिक और डॉ रॉबर्ट फुजिनामी (यूटा विश्वविद्यालय) का धन्यवाद करते हैं। हम सीडी 45 एंटीबॉडी के क्लोन को साझा करने के लिए शालिना उस्मान को धन्यवाद देते हैं। हम ऊतक प्रोसेसर और ऊतक एम्बेडिंग स्टेशन पर प्रशिक्षण और सेंट माइकल अस्पताल में बायोमेडिकल रिसर्च के कीनन रिसर्च सेंटर में इस उपकरण को बनाए रखने के लिए Xiofang लू धन्यवाद. इस काम को एमएस कनाडा (एसईडी के लिए) से बायोमेडिकल अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। कारमेन Ucciferri कनाडा सरकार से एक छात्र द्वारा समर्थित है। नूरिया Alvarez-सांचेज़ एक कीनन के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Used to fix spinal cord and brain specimens
1000 mL Glass Beaker Pyrex 1000
15 mL Falcon Tube Starstedt 62.554.100 Fixing and storing spinal cord and brain
250 mL Erlenmeyer Flask Pyrex 4980
500 mL Glass Beaker Pyrex 1003
92 mm x 16 mm Petri Dishes Starstedt 82-1473-001 Used in the tissue grossing procedure
95% Ethyl Alcohol Commercial Alcohols P016EA95 Dehydration and rehydration steps
ABC Elite Kit Vector Labratories PK6100 Used for immunohistochemistry labeling
Aqua Hold 2 PAP Pen Cole Parmer UZ-75955-53 Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector Labratories SP-2001
Biosafety Cabinet Any
Biotinylated rabbit anti-rat IgG Vector Labratories BA-4000 Used for CD45 staining
C57BL6/J Mice Jackson Laboratory Stock # 664 These mice were used in experiments shown in paper.
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Sorvall ST Plus
CitriSolv Fisher Scientific 04-355-121 Used for de-waxing. Is an alternative to xylene
DAB Kit Vector Labratories SK-4100 Used for developing in immunohistochemistry
ddH2O - -
Disposable Scalpel Magna M92-10 Used for grossing spinal cord and brain
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish Cole Parmer UZ-48585-60 Used for histochemical staining and washes
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack Cole Parmer 10061392 Used for immunohistochemistry and histochemistry
Eosin Y Bioshop 173772-87-1 Stains cytoplasm
Feather Microtome Blades Fisher Scientific 12-634-1C Used for sectioning paraffin
Filter Paper Whatman 1001110 Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue
Fine Surgical Scissors Fine Science Tools 14160-10 Used to snip brain and the skull
Fumehood Any
Gibco DPBS Fisher Scientific 14190944
Glacial Acetic Acid BioShop ACE333.4 Used in the luxol fast blue staining procedure
Histoplex Histology Containers Starplex Scientific 565-060-26 Fixing spinal cord and brain
Hydrogen Peroxide Fisher Chemicals H325-500 Used to remove endogenous peroxidase in the tissue
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Kimtech Science Kimwipes Kimberly Clark Professional 34155 Used for immunohistochemistry
Lens paper VWR 52846-001 Used for trapping spinal cord species in cassette during processing
Light microscope Any
Lithium carbonate Sigma Aldrich 554-13-3 De-blueing after luxol fast blue staining
Luxol blue Sigma Aldrich 1328-51-4 Stains CNS myelin
M.O.M Immunodetection Kit Vector Labratories BMK-2202 Used to stain SMI-32
Methanol Fisher Chemicals A454.2 Used for fixation
Mayer's Hematoxylin Electron Microscopy Sciences 26381-02 Stains nuclei
Micro-Adson Forceps with Teeth Fine Science Tools 11027-12 Used for reflecting the skull during dissections
Microcentrifuge  Eppendorf Model 5417R
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z Starstedt 16.440.100 Used for blood collection
Micrscope Cover Glass Fisher Scientific 12545A Used for coverslipping
Mini Shaker VWR 12620-938 Used for making buffers
NF light kit Quanterix 103186 This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum
Nitrile Gloves VWR 76307-462 Safety
Normal Goat Serum Vector Labratories S-1000 Blocking reagent
Normal Rabbit Serum Vector Labratories S-5000 Blocking reagent
OmniSette Tissue Cassettes Fisher Scientific M4935FS Used for embedding spinal cord and brain
p1000 Pipette and Tips various
p200 Pipette and Tips various
Paraffin Embedding station Leica Biosystems Model EG1160
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium Leica Biosystems 39601006 Used for embedding spinal cord and brain
Permount Mounting Medium Fisher Chemicals SP15-100 Used for mounting coverslips on slides
pH meter Fisher Scientific 13636AB315B Used for pHing buffers
Plastic Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-20 Used for pHing buffers
Potassium Chloride BioShop 7447-40-7 Used for making PBS
Potassium Phosphate Monobasic BioShop 7778-77-0 Used for making PBS
Pressure Cooker Nordic Ware Tender Cooker
Purified rat anti-mouse CD45 Vector Labratories 553076 Detects leukocytes
Reagent grade alcohol 100% VWR 89370-084 Dehydration and rehydration steps
Reagent grade alcohol 70% VWR 64-17-5 Dehydration and rehydration steps
Rotary Microtome Leica Biosystems Model RM2235
Simoa Machine Quanterix HD-X
Slide Scanner Zeiss AxioScan.Z1
SMI-32 mouse IgG1 antibody Biolegend 801701 Detects damaged axons
Sodium Chloride BioShop 7647-14-5 Used for making PBS
Sodium Phosphate Dibasic  Bioshop 7558-79-4 Used for making PBS
Standard Adson Forceps Fine Science Tools 11150-10 Used for dissection steps
Superfrost Plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Used to collect sections
Surgical Tough Cuts Fine Science Tools 14110-15 Used to cut through the spine, body wall, and skin
Tissue Processor Leica Biosystems Model TP1020
Tri-soldium citrate Thermo Fisher Scientific 03-04-6132 Used for antigen retrieval
Tween-20 BioBasic 9005-64-5 Used for washing sections
X-P Pierce XP-100 plate seal Excel Scientific 12-140 Used for the sNF-L Assay
Xylene Fisher Chemicals 1330-20-7 Used for de-waxing and clearing sections
Funnel Cole Parmer RK-63100-64 Used to filter formalin before grossing tissue
Stir Plate Any Used to make solutions
Oven Any Used to bake tissue sections after cutting
Parafilm Bemis 13-374-10 Used to seal LFB staining dish
Microwave Any Timing may vary depending on the microwave model
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich 9048-46-8 Used to make blocking buffer
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408--129 Used to store mouse serum samples
Vortex Any Used to prepare samples for sNF-L assay
Waterbath Any Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay

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References

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Ucciferri, C. C., Gower, A., Alvarez-Sanchez, N., Whetstone, H., Ramaglia, V., Gommerman, J. L., Brand-Arzamendi, K., Schneider, R., Dunn, S. E. Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (204), e65738, doi:10.3791/65738 (2024).

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