Summary
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の動物モデルとして機能します。この記事では、EAEにおける脊髄の炎症、脱髄、および軸索損傷をスコアリングするためのアプローチについて説明します。さらに、マウス血清中の可溶性ニューロフィラメント光レベルを定量化する方法が提示され、生きたマウスの軸索損傷の評価が容易になります。
Abstract
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の一般的な免疫ベースのモデルです。この疾患は、ミエリン鞘のタンパク質成分とコンプリートフロイントアジュバント(CFA)による積極的な免疫、またはミエリンタンパク質/ CFAでプライミングされたげっ歯類からナイーブげっ歯類へのミエリン特異的Tエフェクター細胞の移行によってげっ歯類に誘発される可能性があります。EAE の重症度は通常、上行麻痺の程度を測定する 5 段階の臨床スケールで採点されますが、このスケールは EAE からの回復の程度を評価するのには最適ではありません。例えば、炎症が解消したにもかかわらず、一部のEAEモデル(例、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質[MOG]ペプチド誘導モデル)では、臨床スコアは高いままです。したがって、中枢神経系(CNS)における細胞損傷の根本的なメカニズムを研究する手段も提供するEAEの組織学的スコアリングで臨床スコアリングを補完することが重要です。
ここでは、マウスの脊髄と脳の切片を調製して染色し、脊髄の炎症、脱髄、軸索損傷を記録するための簡単なプロトコルが提示されます。脊髄における白血球浸潤をスコアリングする方法は、EAEにおける脳の炎症のスコアリングにも適用できます。また、低分子アッセイ(SIMOA)アッセイを用いてマウスの血清中の可溶性ニューロフィラメント光(sNF-L)を測定するためのプロトコルも記載されており、生きたマウスにおける中枢神経系損傷の程度に関するフィードバックを提供しています。
Introduction
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト脱髄疾患である多発性硬化症(MS)1の最も一般的なマウスモデルです。IFN-γ(γ)およびIL-17産生ヘルパーT細胞の浸潤2、炎症性単球の浸潤3、血管周囲および髄膜下の炎症性脱髄病変の形成4、および中枢神経系(CNS)における軸索損傷4の発生を含む古典的なMS炎症性病理もEAEで観察されます5,6,7,8,9.EAEとMSの免疫メカニズムの類似性により、EAEは、ナタリズマブ、フィンゴリモド、フマル酸ジメチル、酢酸グラチラマーなど、MSに対する多くの承認された免疫ベースの治療法の有効性と作用機序をテストするための適切な前臨床モデルとなっています(1,5でレビュー)。特定のEAEレジメンは、脳内の髄膜下炎症の発症、慢性脱髄、脊髄萎縮、シナプス、およびニューロンの喪失など、軸索損傷以外の進行性MS病理学の他の側面をモデル化します6,10,11,12。したがって、EAEは、MSに対する神経保護療法の有効性をスクリーニングするための有用性を持っています。
EAEは、げっ歯類にさまざまな方法で誘導されます。能動免疫は最も一般的な誘導法であり、熱死結核菌を添加したCFAで乳化したミエリン抗原(全タンパク質またはペプチド)でげっ歯類を免疫する13。マウスの系統によっては、百日咳毒素(PTX)も免疫の0日目と2日目に投与され、疾患の浸透度が上昇します13。EAEは、ミエリン/CFAプライミングマウスから得られたミエリン特異的T細胞を健康なマウスに養子的に導入することによっても誘発され14、主要なミエリン抗原に特異的なT細胞受容体を過剰発現するマウスで自発的に発症することもあります5。
EAE疾患の重症度と進行は、通常、個別の5段階の臨床尺度を使用してスコアリングされます:1 – 尾のぐったり、2 –後肢または足の脱力感、3 –片方または両方の後肢の完全な麻痺、4 –前肢の脱力、5 –瀕死または死亡13。この臨床スコアリングシステムは、疾患発症時に発生する上行性麻痺の進行を記録するという点では健全ですが、CNS炎症発作からの回復の程度を捉える感度は低くなります。例えば、歩行が困難なマウスと、容易に歩行できるが足を掴むのが苦手なマウスの両方に、EAEスケールで2のスコアが割り当てられます。炎症反応の解消にもかかわらず、永久的な軸索損傷または喪失の存在により、EAEの急性期後のスコアは高いままである可能性があります9。EAE 9,16,17,18の臨床的欠損の違いをよりよく捉えるために、より洗練されたスコアリングシステム、行動テスト、後肢と握力の測定、および赤外線モニタリングシステムを開発するためのさまざまな試みがありました。しかし、これらのより複雑なスコアリング指標では、根本的な神経学的欠損に対する炎症と組織損傷の寄与を区別していません。したがって、EAEの重症度をスコアリングするためのゴールドスタンダードアプローチは、臨床的スコアリングと組織学的スコアリングの両方を実施することです。
ここでは、マウスの脊髄および脳標本を解剖し、パラフィンに埋め込む方法について、EAEで発生する病変形成の確率的過程を捉える方法について、プロトコルが説明されています。また、中枢神経系のミエリンを検出するKluverとBarrera19によって最初に作成されたLuxol fast blue(LFB)で切片を染色する方法のプロトコルも紹介されています。切片は、LFBのみで染色するか(脱髄解析用)、またはヘマトキシリンとエオシン(H&E)で対比染色して、炎症性病変の視覚化とスコアリングに役立てます。また、市販の抗体、免疫組織化化学(IHC)技術、および一般にアクセス可能なソフトウェアを使用して、脊髄における全白血球(CD45)、ミエリンの喪失、および損傷した軸索(SMI-32)の数を定量化するためのプロトコルも提供されています。脊髄の白血球を定量化するために使用されるプロトコルは、脳内の白血球の定量にも適用できます。
脳の軸索喪失と損傷の組織学的評価は、脳白質路が互いに平行に走っていないため、脊髄よりも比較的困難です。血清ニューロフィラメント光(sNF-L)の測定は、MS20,21における神経損傷の有望なバイオマーカーとして浮上しています。最近の研究では、この技術がEAE22,23,24に拡張されています。ここでは、低分子アッセイ(SIMOA)アッセイを用いて、生きたマウスの血清ニューロフィラメント光(sNF-L)を測定する方法を紹介します。この方法は、少量の血清しか必要とせず、生きたマウスでわずか半日で行うことができ、テストされた治療法が全体的なCNS損傷にどのように影響しているかについて迅速なフィードバックを提供します。ここに記載の方法の全ては、任意の性別または系統のマウスに適用することができる。
Protocol
マウスで行われたすべての実験は、カナダ動物管理評議会が定めたガイドラインに従って、Unity Health Toronto Animal Care Committeeによって承認された動物使用プロトコルの下で行われました。実験室の手順全体を通して、白衣、保護手袋、および眼鏡を必ず着用してください。
1.脳と脊髄の採取と固定
- 制度の方針に従ってマウスを安楽死させます。マウスを解剖台にうつ伏せに置き、外科用ハサミ(下向きに切断)を使用して首を切り落とします。
- アドソン鉗子(利き手ではない方の手)を使用して、マウスの頭のてっぺんの皮膚をつかみます。次に、外科用ハサミを使用して頭のてっぺんの皮膚を2.5cm切開します。
- 指を使って頭の皮膚を横方向に押し、下にある頭蓋骨を視覚化します。
- 標準のAdson鉗子で眼窩をつかんでマウスの頭を安定させます。
- 細いハサミ(利き手)を使用して、頸椎から嗅球までの正中線に沿って頭蓋骨に小さな切り込みを入れます。
注:下にある脳の損傷を避けるために、一度に頭蓋骨の下に数ミリメートルのハサミの先端だけを埋め込んでください。 - 歯付きのアドソン鉗子を使用して頭蓋骨を横方向に反射させ、下にある脳を明らかにします。
- 利き手ではない方の手で頭を持ちます。ハサミを閉じ(利き手)、頸椎から脊髄をすくい取り、頭蓋骨から脳をそっと引き抜き、脳神経を切り取ります。
- 動物のIDでラベル付けされた10%中性緩衝ホルマリン10mLを含む円錐形のチューブに脳を入れます。
- 首から尾までのマウスの胴体の正中線に沿って毛皮を切開します。
- 指を使って皮膚を横方向に押し、背骨を視覚化します。
- 外科用ハサミを使用して、大腿骨が股関節に付着するレベルで脊椎を下向きに切断します。
- 手術用ハサミを使用して、腰から首までの脊椎の両側の体壁を切断します。付着している臓器をすべて切り取ります。
- 脊髄を含む脊椎を、脳を含むホルマリンのチューブと同じチューブに入れます。脳と脊柱を5〜7日間固定します。
注:固定のタイミングは重要です。一部の抗体は、組織が過剰に固定されていると機能しません。組織が固定不足の場合、ステップ2で脊柱から脊髄を押し出すことは困難です。
2.脊髄と脳の肉眼検査と処理
注意: 次の手順は、ドラフト内で行われます。開始する前に、2 x 10 cmの清潔なペトリ皿、濾紙で裏打ちされた漏斗を取り付けた三角フラスコ、2つのメス(1つは骨を切断し、もう1つはCNS組織を切断します)、レンズ紙、鉛筆、埋め込みカセット、および10%ホルマリンを事前に充填した標本瓶を準備します。
- ハサミを使って、レンズペーパーの小片(同じ幅でカセットの2倍の長さ)を切り取り、1つのシャーレに入れます。
- プラスチックカセットに鉛筆で標本IDをラベル付けします。
- 固定された脳と脊椎を含むチューブを漏斗に注ぎます。脊椎と脳を空のペトリ皿に移します。
注:使用済みのホルマリンは三角フラスコに浸透し、ステップ2.13で再利用できます。 - メスを使って脳を6つの冠状部分に大まかに分割します。小脳の尾側に1つ、小脳の真ん中に1つ、小脳の吻側に1つ、残りの吻側脳に2つの切り込みを入れ、同じ厚さの冠状スライスを3つ追加します。
- 鉗子を使用して、脳標本をペトリ皿のレンズ紙の半分に移します。
- メスを使って脊髄を3つに切ります:最初の切り込みは胸郭の底に、2番目の切り込みは頸椎の湾曲のすぐ下に行われます。
- 同じメスを使用して、脊髄が視覚化できるようになるまで、尾端の仙骨棘部分を切り取ります。
- 胸椎(利き手ではない方の手)を拾います。歯をしっかりと閉じた状態でアドソン鉗子を持ち(利き手)、穏やかなねじりの動きを使用して、鉗子の端を脊柱の小さな開口部にそっと押し込みます。.コードはもう一方の端から出てくるはずです。
注:脊髄のサイズの丸い端の器具は、この目的のために機能します。脊髄が自然に飛び出さない場合は、無理に押し出さないでください。代わりに、細いハサミを使用して脊椎の側面に沿って骨を切り取り、それを反射して開いて脊髄を露出させます。または、脊髄と脳をさらに数日間ホルマリンで固定します。ただし、抗体染色にばらつきが生じないように、すべての検体に同じ固定時間を適用する必要があります。 - 標準のAdson鉗子(利き手)を手に取ります。利き手の少ない方の手で脊髄片を持ったまま、鉗子を使用して、浮かび上がった脊髄を柱からそっと引き出します。脊髄片をレンズペーパーの入ったシャーレに入れます。
- 腰椎/仙骨と頸椎柱の部分について、このプロセスを繰り返します。
- 3つの脊髄片(頸部、胸部、腰椎/仙骨)をメスを使用してより小さな断面片に分割します。少なくとも15個のセグメントをカットし、それぞれの厚さは2mm未満にする必要があります。
注:セグメントが幅よりも短いことを確認すると、手順3の埋め込みプロセス中にセクションが断面に収まりやすくなります。 - 脳の破片が入ったレンズ紙の同じ半分に脊髄片を配置します。レンズペーパーを折りたたんでティッシュ片を挟み、ラベルの付いたカセットに入れます。
注意: レンズペーパーは、処理中にティッシュの小片がカセットから漏れるのを防ぎます。 - カセットをリサイクルホルマリンまたはフレッシュホルマリンが入った標本瓶に移します。
- 残りの試験片について、手順2.1〜2.13を繰り返します。
- 5〜7日間の固定後、カセットを検体容器から自動組織処理装置の最初のホルマリン浴に移します( 材料表を参照)。 付表1に記載のプログラムに従って、組織処理装置を一晩運転する。標本は、包埋されるまで温かいパラフィンワックスに保持されます。
3.脳と脊髄の切片の埋め込みと切断
- カセットをプロセッサーからパラフィン包埋ステーションの保温チャンバーに移します( 材料表を参照)。
- 各マウスの脊髄と脳の断面を次のように1つのパラフィンブロックに埋め込みます(図1)。
- まず、型の底を覆うようにパラフィンワックスを注ぎます。細かい鉗子を使用して、脳冠状動脈と脊髄の断面片を型の底にあるパラフィンに入れます。
- 金型を冷却面に数秒間移し、脳と脊髄の破片を所定の位置に固定します。金型を加熱面に戻し、上部にホットパラフィンを入れます。
- カセットの蓋(試験片IDが付いている)を金型の上に置きます。カセット蓋の上にさらにパラフィンを注ぎます。金型を冷却ステーションに移して、ワックスを固めます(30〜60分間冷却します)。
注:脊髄切片の埋め込みには練習が必要です。成功率を上げるには、断面積が落ちる可能性が高いため、脊髄の長さを短くします(<2 mm)。手術用アイルーペは、脊髄片が断面にあるかどうかを区別するために着用することができます。 - パラフィンブロックを回転式ミクロトームに取り付けます。目的の組織がパラフィン切片に現れるまでブロックをトリミングします。
- 各ブロックの切片を5 μMのリボンで切断し、42°Cのウォーターバスに移します。
- スライドに切片を集め、スライドをスライドガラスラックに置きます。
- 切片を37°Cのドライオーブンで一晩焼きます。染色に進む前にスライドを冷却します。
4. 染色準備のための切片の脱パラフィンと再水和
注意: 手順はドラフト内で実行されます。始める前に、溶剤の浴を準備します。すべての洗浄ステップで、5 Lの1x PBS(1 L ddH2O、8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4、pH = 7.4)を0.05% Tween-20(PBS-T)で調製します。
- ダイパラフィンは、キシレンまたは非キシレンベースの溶媒を2回連続して浴し、穏やかに撹拌しながらシェーカーにそれぞれ5分間入れて脱パラフィンします。
- 100%エタノール2個(各5分)、95%エタノール2個(各3分)、70%エタノール1個(3分))のエタノールの割合が下がる連続した浴にスライドを移し替えて組織を水分補給します。LFB染色では95%エタノールで保持し、70%エタノールに再水和し、免疫組織化学(IHC)ではPBS-Tで保持します。
5. H&EによるミエリンのLFB
- 0.1% LFB(0.2 g LFB、 材料表参照、95%エタノール200 mL、氷酢酸0.5 mL)の溶液を調製します。混合し、三角フラスコにろ過します。 使用するまで暗いボトルに保管してください。
- 切片を95%エタノールからスライドガラスラックに移し、LFBを含む染色皿に入れます。皿を覆い、蒸発を防ぐためにパラフィンフィルムで密封します。
- 切片を56°Cのオーブンで一晩(最大16時間)インキュベートします。
- 翌朝、スライドをddH2O浴に移し、保持します。
- その間、(1)新鮮な0.05%炭酸リチウム溶液(0.05gの炭酸リチウム、100mL ddH2O)を調製する。(2)エオシンY溶液(40mLのddH20に2gのエオシン塩を加え、溶解するまで混合した後、160mLの95%エタノールと混合する)。
- 1 x 炭酸リチウム、3 x 70%エタノール、3 x 95%エタノール、2 x 100%エタノール、3 x ddH20。浴槽は使用順に並べる( 付表2参照)。
- 付表2に概説されている手順に従ってください。
- スライドが乾いたら、顕微鏡で脱髄病変を視覚化します。
6. H&Eを含まないミエリンのLFB
- ミエリンの分析のためにこの染色手順を実行します。
メモ: 手順はステップ 5 ( 補足表 2 を参照) と同じですが、ワークフローが省略されています。ステップ 4 の後、ステップ 10 から手順を続行します。
7. 免疫組織化学(IHC)染色に対する抗原賦活化とペルオキシダーゼ消光
注意: 開始する前に、メタノールに100 mLの過酸化水素を調製します(ドラフト内で、1部30%過酸化水素溶液9部に100%メタノール)。1 Lの10 mMクエン酸緩衝液をTween-20(クエン酸三ナトリウム2.94 g、1 LのddH20に溶解し、攪拌プレート上のビーカーでpHを6.0にし、500 μLのTween-20を加える)で調製する。PBS-Tを準備します(ステップ4を参照)。すべての洗浄は、特に明記されていない限り、PBS-Tの浴槽で穏やかに攪拌(シェーカーで)行われます。
- スライドをメタノール中の3%過酸化水素に15分間(ドラフト内で)入れて、内因性ペルオキシダーゼをクエンチします。PBS-Tでスライドを2回(各2分間)洗浄します。
- スライドを金属製のスライドホルダーに移し、1Lのクエン酸緩衝液を圧力鍋に入れます。蓋を密閉し、蒸気脱出ベントの上部にゴム製のストッパーを追加します。
- 圧力鍋の黄色いタブがポップアップし、最大圧力に達したことを示すまで、電子レンジで強火で調理します。最大圧力でさらに5分間調理してから、保護手袋を使用して圧力鍋を電子レンジから取り外します。
- ストッパーを外して減圧します。 蓋を外し、スライドをクエン酸緩衝液中で20分間冷ましてから、目的の染色法に進みます。
注意: 蒸気を放出するときは、やけどを負う可能性があるため、後ろに下がってください。
8. CD45免疫組織化学
注:このIHC法は、浸潤した白血球を可視化するために使用されます。アビジン/ビオチンブロッキングステップは、ブロッキングおよび一次抗体インキュベーションステップと組み合わされています。
- ブロッキングバッファー(2% BSA、2% ウサギ血清 1x PBS)を調製します。
- スライドをスライドガラストレイに移し、PBS-Tで2回(各2分)洗浄します。アビジン/ブロッキング溶液(アビジン4滴/mL、2%BSA/2%ウサギ血清、1 x PBS、 材料表を参照)を調製します。
- 実験用ティッシュペーパーを使用して、組織の周りの余分なPBS-Tを乾かします。疎水性ペンを使用して、組織の周りに円を描き、湿気のあるチャンバーにスライドを置きます。
- アビジン/ブロッキング溶液を各切片に塗布します(400 μL/スライド)。
- 湿潤チャンバーに蓋をし、室温で30分間インキュベートします。 このステップでは、ビオチンを含むブロッキングバッファー(4滴/mLビオチン、2%BSA/2%ウサギ血清、1x PBS溶液)で抗CD45抗体(補足表3)を調製します。
- ブロッキング溶液をスライドから糸くずの出ないラボ用ワイプに軽くたたきます。ラボ用ワイプを使用して組織の周りを軽くたたき、余分な液体を取り除きます。
- スライドを湿気の多いチャンバーに戻します。切片に400μLのCD45抗体溶液( 材料表を参照)を加えます。蓋付きの湿潤チャンバーで4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、一次抗体を排出し、スライドをPBS-Tで3回洗浄します(各5分)。
- 糸くずの出ないラボで切片の周囲を乾燥させ、各切片に400 μLの二次抗体(ブロッキングバッファーで1:200希釈)を添加します。室温で1時間インキュベートします。
- その間、1x PBS5 mLに試薬Aを2滴加えて混合し、ABC試薬( 材料表を参照)を調製します。同じ溶液に試薬Bを2滴加えて混合します(使用前に~30分前の準備)。
- 1x PBS-Tを3回に分けて洗浄し(各5分)、スライドを湿潤チャンバーに入れます。
- 400 μLのABC試薬を切片に加えます。湿潤チャンバーに蓋をし、室温で30分間インキュベートします。
- 1x PBS-Tを3回(各5分)交換してスライドを洗浄します。その間、製造元の指示に従って、ホイルで覆われた15 mL遠心チューブに適切な量のDAB溶液を調製します( 材料表を参照)。
- スライドを1枚取り、顕微鏡で脊髄切片に焦点を合わせます。400 μL の DAB をスライドに追加し、ラボタイマーを開始します。
- 発生中の切片を視覚化し、白血球が褐色になったらタイマーを停止します。スライドをddH20浴に移し、反応を止める。水に5分間入れます。残りのスライドには、同じ現像時間が使用されます。
注意: 軽打は発がん性物質です。DAB廃棄物とDAB後のddH2Oは有害廃棄物として処分してください。 - 対比染色は、Mayer's Hematoxylinで4~10分間スライドさせます( 補足表2を参照)。スライドを水道水で10分間すすぎます。
- 95%エタノール(1 x 3分)で脱水し、続いて絶対100%エタノール(各2 x 3分)で脱水します。
- ドラフトに移し、スライドをキシレンまたはキシレン代替溶媒に5分間移します。封入剤でカバーガラスを覆い、ドラフト内でスライドを1〜2日間乾燥させます。
注意: キシレンを使用する場合は、有毒で手袋を溶かす可能性があるため、カバーを滑らせるときにスライドを処理するために二重の手袋と鉗子を使用してください。 - キシレンを使用してスライドを洗浄し、スライドスキャナーを使用して20倍の倍率でスキャンします。
9. 軸索損傷に対するSMI-32 IHC
注:このプロトコルは、傷ついた軸索25に蓄積する可能性のある重い非リン酸化ニューロフィラメントに反応するマウスSMI-32抗体を使用します。この抗体はマウスで産生され、マウス抗原を検出するため、Mouse on Mouse(MOM)キットの使用が推奨されます。この手順では、アビジン/ビオチンブロッキングステップは、一次抗体のインキュベーションとは別のステップとして行われます。 このプロトコルを開始する前に、脱パラフィン化、再水和、内因性ペルオキシダーゼ活性の急冷、およびステップ4およびステップ7に記載されている抗原賦活化を行ってください。
- 2 x PBS-Tで切片を2回洗浄します(各2分)。実験室の組織を使用して切片の周りの余分な液体を取り除き、疎水性ペンを使用して組織の周りに円を描きます。
- 400 μLのブロッキングバッファー(1x PBS-T中の2%(w/v)ヤギ血清)とアビジン(4滴/mL)を切片に加えます。室温で15分間インキュベートします。
- スライドを1x PBS-Tに2回浸します。ビオチンを含むブロッキングバッファー400 μL(4滴/mL)をスライドに加え、室温で15分間インキュベートします。
- スライドを1 x PBS-Tバスで2分間洗浄します。その間、2.5 mL の 1x PBS に 2 滴の原液( 材料表を参照)を加えて、MOM ブロッキング試薬を調製します。
- 400 μLのMOM試薬を切片に加えます。室温で1時間インキュベートします。
- スライドを1x PBS-Tバスで2分間2回洗浄します。その間、300 μL のタンパク質濃縮原液を 3.75 mL の 1x PBS に添加して MOM 希釈液を調製します。
- 400 μL の MOM 希釈液を加え、室温で 5 分間インキュベートします。その間、SMI-32抗体( 材料表を参照)をMOM希釈液で希釈します。
- スライドから希釈液を取り出し、400 μLのSMI-32抗体溶液を切片に加えます。湿潤チャンバーに蓋をし、室温で30分間インキュベートします。
- 1x PBS-T槽でスライドを2回、それぞれ穏やかに攪拌しながら2分間洗浄します。その間、希釈液中の MOM 抗マウス IgG 作業試薬を希釈します(希釈液 2.5 mL 中に 10 μL のストック)。
- スライドごとに400 μLの抗マウスIgGワーキング試薬を添加します。10分間インキュベートします。
- スライドを1x PBS-T槽で2回ずつ2分間洗浄します。CD45染色プロトコル(ステップ8.11〜8.19)に概説されている手順に従って染色を続けます。
10.脱髄病変の存在に対するLFBおよびH&Eスコアリング
注:以下は、炎症性脱髄の重症度に関する迅速な洞察を得るために適用できる分析アプローチです。この分析は、さまざまなレベル(頸部、胸部、腰椎、レベルごとに少なくとも3つのセクション)でサンプリングされた臍帯のセクションで実施されます。マウス脊髄26 のためのアレンの頭脳の地図書を脊髄の解剖学レベルを識別するのを助けるために参照して下さい。この解析には TIFF ファイルが必要です。スキャンした画像が.czi形式の場合は、 補足表4 の手順に従って、cziファイルをTIFFファイルに変換してください。
11. 脊髄白質におけるLFB染色の面積率の算出
注:この分析は、LFBで染色された脊髄白質の面積の割合を測定します。
- TIFF ファイルとして保存された LFB 染色された切片を ImageJ にドラッグ&ドロップして開きます。
- [画像] > [8 ビット>入力] をクリックして、グレースケール画像を生成します。[画像] をクリックして [> しきい値>調整します。赤いオーバーレイが目から見えるすべての暗い領域(ミエリン)を捉えるように、下部のスライダーを調整します(図2C–E)。[適用]をクリックします。
- ROI 管理r>>ツールの分析をクリックして、ROIマネージャーを開きます。
- ImageJツールバーの 多角形 描画ツールを選択します。この描画ツールを使用すると、コンピューターのマウスで脊髄の領域の輪郭を描くことができます。
- 脊髄の背側領域の輪郭を描き、キーボードの t をクリックして多角形を ROI マネージャーに追加します。
- 脊髄白質の前外側領域の輪郭を描き、多角形をROIマネージャーに追加します。
注:トレースするときは、通常は有髄が少ない大きな血管、組織の裂け目、アーチファクト、および背角に隣接する領域(図2A、B 矢印)を除外します。トレースするときは、白い背景を含めると結果が歪むため、できるだけ正確にしてください。 - [ Analyze > Set Measurements ]をクリックし、[ Area Fraction]を選択します。
- ROIマネージャーの 測定 をクリックします。これにより、LFBで染色された輪郭領域の割合が得られます。
- 新しく生成された結果ボックスから、値を Excel にコピーし、画像ウィンドウを閉じます。背側および腹側外側領域について染色された平均%分率面積を計算します。これらを平均して、そのセクションの値を取得します。
- 頸部、胸部、腰部について手順11.1〜11.9を繰り返します(N = 3 /レベル/マウス)。
- 各マウスのすべての切片の平均ミエリン分画の割合を計算します。脱髄率は、100から染色面積%を差し引いて推定されます。
12. CD45+ 細胞とSMI-32+ 軸索卵子の数の解析
- CD45 または SMI-32 で染色された TIFF 画像を ImageJ にドラッグ&ドロップします。[Analyze] > [Set Scale > Global > Ok ] をクリックして、すべての画像に縮尺記号を設定します。これは、最初の画像に対してのみ行われることに注意してください。
- 多角形描画ツールを選択し、コンピューターのマウスを使用して灰白質の周りをトレースします。[分析>測定]をクリックし、結果を「灰白質領域」としてExcelに記録します。
- 描画されたポリゴンを画像上に残したまま、 Delete キー(キーボード)をクリックして画像から灰白質を削除します。このアクションにより、白質のみが分析対象になります。
- 多角形描画ツールを使用して脊髄セクション全体の輪郭を描きます。欠損または損傷している組織の領域を除外します。
- [ 分析>測定 ]をクリックし、結果をExcelファイルに「Total Tissue Area」として記録します。
- [画像] > [カラー] > [カラー デコンボリューション] をクリックします。vectorsドロップダウンウィンドウからH DABを選択します。3つの新しいウィンドウが表示されます–茶色の色合いのウィンドウ(DABチャネル)を保持し、他の画像ウィンドウを削除します。
- [画像] をクリックして [> しきい値>調整します。下部のスライダーを調整して画像のしきい値を調整し、赤のオーバーレイが目で検出されたのと同じ量の茶色の染色をキャプチャするようにします。[適用]をクリックします。
- [ Process > Binary > Watershed] をクリックします。このステップでは、元のイメージとバイナリ イメージを比較して、それらが一致していることを確認します。
- [ Analyze] > [Analyze Particles] をクリックします。 [ オーバーレイを表示 ]を選択し、サイズ = 5 - 150 μm2、真円度 = 0.4 – 1 の設定を変更します。[ OK]をクリックします。
注: これらの設定により、[流域]関数で分割されなかった個々のセルおよびセルの小さなグループを、解析から除外するのではなく、含めることができます。 - 結果ウィンドウで、Excel の左端の列の最後の数値 (合計粒子数を表す) を記録します。次に、白質面積(総組織面積–灰白質面積(mm2))を計算します。白質面積あたりの総粒子数(数/mm2)を表します。
- 保存したRGB画像ごとに手順を繰り返します。1匹のマウスについてすべての脊髄切片を解析したら、そのマウスのmm2 組織あたりの粒子数を平均します。
注:脊髄白血球の分析に使用されるワークフローは、脳領域にも適用できます。
13. SIMOAアッセイを用いたsNF-Lの測定
- 生きたマウスから100〜200μLの血液を採取し、毛細血管マイクロテーナーチューブを使用した伏在出血、または注射器と25G針を使用した心臓穿刺(終末手順) を行います 。後者の場合、血液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- 室温で30〜60分間血液を凝固させます。
- サンプルを 2660 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離し、上部画分(血清)を新しい微量遠心チューブにピペットで移します。使用する準備ができるまで、血清を-80°Cで保管してください。
- 準備:キャリブレーターとコントロール(NFライトアッセイキット、 材料表を参照)を使用してから、使用前に室温で1時間温めます。 酵素基質(RGP)を冷蔵庫から取り出し、30°Cのウォーターバスに30分以上入れ、10分ごとにボルテックスします。
- 血清サンプルを氷上で解凍します。解凍したら、サンプルを静かにボルテックスし、10000 x g で5分間遠心分離して、破片をペレット化します。
- プレートをロードする:キャリブレーターとコントロールをボルテックスします。キャリブレーターを複製し、コントロールを複製し、血清サンプルを複製して、キットに付属の96ウェルプレートにロードします。血清サンプルは、キットに付属の希釈液で1:3の比率で希釈されます。 プレートを密封します。
- SIMOAマシン( 材料表を参照)をコンピューター、プログラム、マシンの順にオンにします。マシンを初期化し、 Start of Day メンテナンスを実行できるようにします。
- 磁気ビーズを30秒間ボルテックスします。
- [試薬のロード]タブをクリックし、試薬ボトルを配置するラック位置をダブルクリックし、ボトルのバーコードをスキャンします。
- 磁気ビーズをラックの振とう位置(位置1〜3)に置きます。
- 検出器、SBG試薬、RGP試薬を機械にロードして続行します。
- ソフトウェア の設定 をクリックします。サンプルモードがプレート上にあることを確認します。[セットアップの実行] タブで、実験に名前を付けます。
- キャリブレーターのプレート上のウェルを次のように割り当てます。 ウェルをクリックし、アッセイを選択します。 キャリブレーションA を選択し、 昇順をクリックします。ウェル A1-8 をハイライト表示し、 replicates (2) をクリックして、重複して実行するキャリブレーターの座標を割り当てます。きちんとしたプロトコルを使用して実行します。
注:分析証明書(メーカーのWebサイト)を参照して、特定のロット番号ごとに各キャリブレーターの濃度を取得してください。ウェルが割り当てられると、プレートが所定の位置にロックされるまで、作業を失うことなくこの画面から移動することはできません。 - 以下の手順に従ってサンプルを割り当てます。
- 画面右下の ボタンをクリックして 、サンプルを割り当てます。サンプルを配置するウェルをハイライトします。
- 実行するアッセイをリストからチェックし、繰り返し回数を選択し、オンボード希釈率を 4 倍に指定します。
- ウェルが強調表示されたままの状態で、サンプル ID の接頭辞と開始番号を入力し、[ 生成 ] をクリックしてサンプルの連続した ID を生成します。コントロールサンプルについても同じ手順を繰り返します。
- プレートをプレートホルダー(A1〜A12)にロードします。
- 画面インターフェイスで、[ 完了したプログラミングサンプル ]をクリックして、[システムリソース]タブに進みます。すべての試薬容器が満杯で、廃液容器が空であることを確認してください。
- [ 実行]をクリックします。
- 分析が完了したら、「Data Reduction」タブでアッセイとプレート名を選択して検量線を確認します。
- 「実行履歴」に移動し、フィルターを使用して最新の実行を見つけます。 [実行 ] を選択し、 次に [すべての結果] を選択します。 エクスポートをクリックし、.csvファイルを保存します。[レポート ] をクリックし、[ バッチ キャリブレーション レポート ] を選択して、最近の実行を選択します。レポートをプレビューしてエクスポートします。
- メーカーが推奨する終業メンテナンスを実行します。プログラム、マシン、コンピューターの電源を切ります。
Representative Results
図3 は、代表的なIHCおよび組織化学的染色と、急性(左)と古いEAE病変(右)の両方の例を示しています。ヘマトキシリン対比染色による代表的なCD45染色を 図3A、Bに示します。 図3C–F は、H&E対比染色(図3C、D)またはなし(図3E、F)のLFB染色の例です。ヘマトキシリンは免疫細胞に特異的ではありませんが、免疫細胞の核はより暗く染色され、中枢神経系常在細胞と区別できます。 図3G、H は、ヘマトキシリンで対比染色したSMI-32+ 軸索の代表的な染色を示しています。古いEAE病変でこの染色が増加していることに注目してください。
有髄痕の損傷は、活動性マウスEAEの脊髄に最も多く見られ、これがこの疾患の麻痺の主な要因です7,9。したがって、脊髄の炎症および組織損傷の存在のスコアリングは、組織学的分析において優先される。EAE病変は、脊髄のさまざまな領域(前部、外側、または背側)で散発的に発生し(図2A、B)、およびさまざまなレベル(仙骨、腰椎、胸部、頸部)で発生します。記載されている包埋方法は、臍帯全体の病変の良好なサンプリングを保証します。一部のセクションは処理またはセクショニングプロセスで損傷する可能性があるため、分析されるよりも多くのセクションが埋め込まれます。代表的なサンプリングを確実にするために、各マウスの脊髄の頸部、胸部、および腰部レベルで少なくとも3つの代表切片を分析します。各標本の同一性は、分析を行う人が分析のために代表的な切片を選択する際に偏りがないように盲検化されています。
EAEの組織学的重症度の違いを迅速に把握するために、選択した切片の脊髄象限における髄膜下脱髄病変の存在をスコアリングすることができます(図2A、B)。これは、スキャンした画像に対して、または光学顕微鏡を使用して実行できる迅速な方法です。この分析は、EAEが1つのグループで重度であり、別のグループで軽度である場合に、グループ間の組織学的EAE重症度の違いを検出するのに十分な感度があります。例えば、 図4の実験では、MOG p35-55/CFAとPTXを併用して、OGR1欠失(OGR1 KO)を有する雌の野生型(WT)とマウスにEAEを誘導しました。WT群のマウスは完全な麻痺を伴う重度のEAEを発症したが、OGR1ノックアウト群は軽度の疾患を発症した。この臨床スコアの差は、髄膜下病変を有する象限の割合の差に対応していた(図4C)。
自己免疫攻撃中のミエリンおよび/または有髄軸索の喪失の程度を把握するために、ミエリン染色のパーセント面積分率で脱髄病変のスコアリングを補完することが重要です。 図4の例では、ミエリンの割合もOGR1マウスとWTマウスの間で有意に異なっていました(図4D)。また、ミエリンの割合は、EAEマウスの累積EAEスコアと有意に相関しており(図4E)、この疾患における組織全体の損傷の優れた尺度となります。このプロトコルはミエリンの汚れの強度を区別しないことに注意して下さい。これが望ましい結果であるならば、プロテオ脂質タンパク質やミエリン塩基性タンパク質などのミエリンタンパク質の免疫蛍光染色を行い、この染色の強度を測定する必要があります。
EAEが両方のコンパレータ群で重度である場合、脊髄象限のより高い割合に炎症性/脱髄性病変が含まれます。この場合、炎症をスコアリングするためのより感度の高いアプローチは、白質mm2あたりのCD45+白血球の数をカウントすることです(図3Aの代表的な染色を参照)。ここで説明するCD45抗体クローンは、浸潤しているすべての白血球を検出し、EAEにおけるCD45発現をアップレギュレートするミクログリアのみを染色するため(図3Bの開いた矢印を参照)、末梢免疫細胞の浸潤を捕捉するのに有用です。
長期のEAE研究(>20日)では、軸索損傷の分析も行うことをお勧めします。脊髄切片のSMI-32染色は、損傷した軸索を検出するための高感度な方法です。脊髄の炎症は時間とともに治まり、温存された軸索は再髄鞘化する可能性がありますが、生き残った軸索は残存損傷の 程度に差があります9(図3G、H)。例えば、C57BL6/JマウスにおけるEAEのMOG p35-55誘導モデルでは、軸索の損傷と喪失の程度は、炎症過程が治まった後の臨床スコアの要因である9。 図5 は、雄と雌のマウス、WTマウス、および骨髄区画のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ(PPAR-デルタ)と呼ばれる遺伝子を欠損したマウス(LysMCre:Ppardfl/fl)を用いたEAE実験の一例です。雄では、WTマウスは後肢機能を取り戻したが、雄の LysMCre:Ppardfl/fl 群では臨床スコアが高かった。対照的に、女性での実験では、両方の実験群が全体を通して高いスコアを示しました。一見したところ、この結果は、PPAR-δがEAEに性特異的な効果をもたらすことを示唆しています。しかし、脊髄の病理学的スコアリングにより、 LysMCre:Ppardfl/fl 群の雌雄のマウスは、WTのマウスと比較して軸索損傷が増加していることが明らかになりました(図5B)。WT雌マウスは軸索損傷の増加を示す傾向があり、慢性的な神経学的欠損に現れるため、臨床スコアに対する遺伝子型の影響は雌では観察されなかった可能性が高い。
この同じ実験で、雌の LysMCre:Ppardfl/fl 雌マウスは、小脳でより広範なT細胞浸潤を有することが発見され、脳の炎症のスコアリングがEAEにどのように役立つかを示す例が提供されました。EAEでは、脳の炎症は主に小脳と脳幹(図6A、D、G)に見られますが、髄膜( 図6Cの海馬の下)、心室の近く(図6F)、視神経や体腸を含む他の白質路(図6B、E)にも見られます。脳の炎症のスコアリングは、脊髄プロトコルで概説されているのと同じ方法論を使用して、mm2 組織領域あたりの CD45 細胞の数をカウントすることにより、特定の脳領域 (小脳白質など) で行われます。ここで概説したグロッシング法では、小脳の中央に切り込みがあり、 図6Aに示すように小脳と脳幹の遠近法を提供します。
SIMOAアッセイを使用したsNF-Lの測定は、再発寛解型MSにおける進行中の軸索損傷および治療への反応を評価するための有用なバイオマーカーとなっています20,21,27,28。sNF-Lヒトの測定に使用したのと同じSIMOAアッセイキットを、マウスsNFL22,23,24の測定にも適用できます。このアッセイがEAEの軸索損傷を検出するために、EAE実験のエンドポイントで雌のC57BL6 / JマウスでsNF-Lを測定し、EAEを持たない性別一致の健康な対照マウスのレベルと比較しました。EAEのマウスは、健康なマウスよりもはるかに高いレベルのsNF-Lを示し(図7A)、これらのレベルは脊髄のSMI-32+軸索の密度と相関していることがわかりました(図7B)。軸索損傷の組織学的スコアリングと比較して、SIMOAアッセイはより高速であり(マウスの出血から結果まで半日強で達成できます)、したがって、生きているマウスで治療がどのように機能しているかの迅速なフィードバックを提供します。このアッセイには、脊髄と脳の両方の軸索損傷を反映するという利点もあります。
図1:脳と脊髄切片の代表的なパラフィンブロック。5つの冠状脳切片と脊髄断面(厚さ1.5〜2mm)は、1つの切片に切断できるように、同じブロックに埋め込まれています。脊髄の少なくとも15の切片を埋め込む必要があり、分析のための切片を適切に選択できるようにする必要があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2: 胸部脊髄レベルでの髄膜炎症とミエリン面積の割合のスコアリング。(A,B)は、LFB/H&Eで染色したMOG p35-55誘導EAEを有する雌のC57BL6/Jマウスの胸部脊髄の画像を示す。Aのマウスは4象限のうち4象限に合流性脱髄病変があり、Bのマウスは4象限のうち1つが罹患しています。Bのマウスは、他の象限にいくらかの炎症があるが、これは合流病変には現れていないため、スコアリングされていない。(C-E)LFB 画像の例、および imageJ のグレースケール画像としきい値画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:CD45、LFB H&E、LFB、およびSMI-32で染色された脊髄切片。CD45抗体(A、B)、LFB / H&E (C、D)、LFB単独(E、F)、およびSMI-32抗体(G、H)について染色された脊髄の早期(A、C、E、G)および後期(B、D、F、H)の髄膜下病変の例。黒矢印は、それぞれの抗体で染色した細胞の例を示す。白い矢印は、CD45+として染色された推定ミクログリアを示しています。スケールバー = 50 μm。この図は、EAE中の雌のC57BL6/Jマウスの脊髄の病変の代表的な染色を示しており、病理学が異なる脊髄切片間でどのように異なるかを強調しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:EAEにおける病変と脱髄率のスコアリングの適用。 C57BL6/Jバックグラウンドの卵巣がんGタンパク質共役受容体1(OGR1)遺伝子を欠損した雌マウスが、野生型(WT)の雌のC57BL6/Jマウスよりも重症度の低い臨床的EAEを発症したEAE実験の例です。EAEは、MOG p35-55 / CFAとPTXによる免疫によって誘発され、マウスは次の臨床スケールに従ってスコアリングされました:1 =尾部麻痺。2 = 後肢と足の脱力感、3 = 後肢の麻痺、4 = 前肢の脱力感、5 = 瀕死の状態。(A)経時的なマウスの平均+SEM臨床スコア。(B)腹側脊髄におけるLFB/H&E染色の例を示す。スケールバー = 50 μm。 (C) 脱髄病変を含む平均 + SEM パーセント象限。(D)各グループの平均+ SEM脱髄率。(E)は、C57BL6/JマウスのMOG p35-55誘導EAEを用いた別の実験の結果を示しており、30日間の観察で個々のマウスのEAEスコアを合計し、脊髄の脱髄率と相関させた。相関はスピアマン検定を用いて行った。(A–D)のパネルは、Souza C et al.29から引用したものである。(E)のデータは元データです。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:臨床EAE表現型に対する遺伝子型の影響を理解するためのSMI-32染色の適用。この図は、C57BL6/Jバックグラウンドの雌雄の野生型(Ppardのアレルを運ぶ)と骨髄特異的なPpard変異マウス(LysMCre:Ppardfl/fl)にMOG p35-55/CFAおよびPTXを免疫し、45日間追跡したEAE実験の一例を示しています。(A)は、マウスの平均+SEM臨床スコアを示す。(B)は、脊髄のSMI-32+軸索の数、髄膜下病変を有する割合象限、血管周囲カフを有する割合象限、およびmm2組織あたりの小脳の #CD3 病変の組織学的スコアリングの平均+ SEM結果を示しています。この実験では、SMI-32染色に対する遺伝子型の影響が示されました。この図はDrohomyreckyから採用されています。ら15. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:雌のC57BL6/JマウスにおけるMOG p35-55誘導EAEにおける脳冠状切片におけるCD45+/ヘマトキシリン染色の例。CD45+病変は褐色で示されている。(A)冠状切片の脳幹のCD45+病変。 スケールバー = 150 μm。(B-G) 視神経のCD45+病変(B)、海馬下の髄膜拡張(C)、脳幹(D)、結腸体(E)、心室付近の内側手綱核(F)、小脳(G)の例。 スケールバー:(B–G)= 50μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:MOG p35-55誘導EAEにおける血清中のsNF-Lレベル。(A)1つの実験のエンドポイントで雌の対照マウスとEAEマウスから収集された血清NFLレベル。データは両側マン・ホイットニー検定を用いて解析した。(****p 値<0.0001)。(B)終点で脊髄切片を採取し、SMI-32で染色した。白質組織領域あたりの陽性細胞数を決定し、スピアマンテストを使用してエンドポイントで血清NF-Lと相関しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足表1:組織処理に使用される浴の説明。 カセットは、自動プロセッサを使用して、これらの一連の浴槽内を自動的に移動します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:ルクソールファストブルーおよびヘマトキシリンおよびエオシン染色のステップ。 この表は、Luxol Fast Blueおよびヘマトキシリンおよびエオシン染色プロトコルのステップの順序を概説しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
付表3:免疫組織化学的染色に用いる抗体。 このプロトコルで使用される抗体と、炎症、ミクログリオーシス、および星状膠症をさらに調査するために使用できる抗体について説明します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表4:.cziをTIFFファイルに変換する方法。高解像度の画像を使用するのが最適ですが、コンピューターの作業メモリが限られている場合は、代わりに中解像度の画像を保存できることに注意してください。分析全体で同じ解像度の画像を使用することが不可欠です。また、系列の最後の画像はスライドラベルです。分析が盲検化されていることを確認するために、ラベルを読まないでください。30,31 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
脊髄の組織学的染色は、EAE疾患の重症度を評価する上で重要なツールであり、特に疾患の急性期後の疾患回復の程度に治療群間で差がある場合に有用である。免疫細胞浸潤(CD45)、ミエリン(LFB)、軸索損傷(SMI-32)の染色は、マウスの臨床スコアの変化の根本的な原因を特徴づけるのに役立ちます。ここで説明する組織学的染色プロトコルは、炎症の視点と、ミエリンと軸索損傷の程度を提供します。さらに、示された結果は、EAEにおける全体的な神経損傷の程度を評価する方法としてsNF-L測定を検証しています。
この分析の重要なパラメータは、研究者が切片の同一性を知らされていないこと、および異なるマウスの脊髄の各レベルで同等のサンプリングがあることを確認することです。これは、炎症の重症度が臍帯のレベルが低いほど大きくなる可能性があるためです。もう一つの重要なパラメータは、実験グループのサイズです。脊髄と脳は、通常、エンドポイントでグループごとに6〜8匹のマウスから採取され、治療または遺伝子型が適度な効果サイズを持つグループ間で有意差が見られます。また、選択したマウスを平均したときに、グループ全体の代表的な平均スコアを持っていることを確認することも重要です。トラブルシューティングに関して、プロトコルの経験が浅い人が遭遇する一般的な問題は、脊髄が不十分な時間固定され、脊柱から簡単に押し出されないことです。この場合、細いハサミを使用して棘突起に沿って切り取り、柱を開いて脊髄を明らかにすることにより、脊髄を柱から手動で解剖することができます。あるいは、抗体染色の成功を妨げることなく、さらに数日間組織を固定することもできます。ここで説明する抗体クローンは、ホルマリンで最大2週間固定された組織で機能します。
脊髄の破片を埋め込むには、スキルと練習が必要です。アイルーペを着用し、ランプを埋め込みステーションに向け、断面が断面に落ちているのか縦断面にあるのかをよりよく視覚化することをお勧めします。グロッシング中に脊髄片の長さを2mm未満に保つと、断面が落ちるのを助けます。経験の浅いユーザーが遭遇するもう一つの一般的な問題は、一晩のインキュベーション中にLFBが蒸発し、スライドの半分が染色され、半分が染色されないことです。蒸発を防ぐために、ガラス染色皿は熱可塑性フィルムで密封してからラップで密封する必要があります。蒸発が起こり、切片が不均一に染色される場合は、炭酸リチウムでスライドを完全に青色除去し、LFBで一晩再染色することをお勧めします。もう1つの一般的な問題は、LFB後にユーザーが灰白質を完全に除去しないことです。プロトコルの他のステップに進む前に、個々の切片を顕微鏡で検査し、十分な量のブルーイング除去が達成されていることを確認することが重要です。さらに、CD45およびSMI-32 IHC染色は頑健に機能しますが、新しい抗体ロットごとに予備実験で抗体濃度をトラブルシューティングすることが重要です。これは、ポジティブコントロールセクション(EAE脊髄)でさまざまな濃度の抗体をテストすることによって行うことができます。初回染色には、一次抗体を添加せずに二次抗体のみで構成されるネガティブコントロールも含める必要があります。最後に、画像解析では、スライドや切片間で染色が不均一になる可能性があるため、個々の画像をしきい値にすることが重要です。
このプロトコルは、無料で入手できるソフトウェアを使用します。プロセッサー、包埋装置、またはミクロトームにアクセスできない場合、これらのステップは、これらのサービスを提供する病院ベースの病理学コアに供給できます。また、スライドスキャナーにアクセスできない場合は、ビデオカメラを備えた光学顕微鏡を使用して、脊髄または脳領域のTIFF画像を保存できます。顕微鏡ベースのワークフローでは、LFBまたはLFB/H&E切片を低倍率(倍率40倍)で撮影し、CD45およびSMI-32染色では、脊髄の腹側、背側、外側の中央にある少なくとも4つの窓を画像化します(CD45の場合は200倍、SMI-32の場合は400倍の倍率)。これらの画像に対して画像解析を行い、記載と同様の方法で染色を定量化することができる。
EAEをスコアリングするためにどのような組織学的アプローチを取るかの決定は、臨床スコアがグループ間でどの程度異なるかによって異なります。例えば、EAEの臨床スコアに著しい差がある場合(1つのグループがEAEを取得し、1つのグループがEAEを取得しなかった場合)、これは通常、末梢介性炎症の違いに関連しています。この場合、LFB / H&E染色切片の脱髄病変の存在をスコアリングするだけで十分であり、グループ間の違いが明らかになります。発症時の臨床スコアが類似しており、代わりに臨床的回復の程度に差がある場合(例: 図5Aの実験)、脳幹と小脳の脳炎症のスコアリングを含む、ここで概説されている完全な組織学的ワークフローを適用して、疾患の慢性の違いが炎症または組織損傷の違いに関連しているかどうかを区別するのが最善です。 CD45カウントによって評価された炎症の違いが見つかった場合は、T細胞(抗CD3)、浸潤単球/マクロファージ(Mac3)、およびミクログリア(Iba-1 / TMEM119)を染色するために、さらにIHC研究を行うことができます(推奨抗体クローンは 補足表3にあります)。ミクログリアの活性化は、二重標識Iba-1+TMEM-19+ ミクログリアにおけるIba-1染色の強度の増加と、セクション32のSholl分析によって評価できるミクログリア突起の収縮の増加によって反映されます。さらに、フローサイトメトリーやシングルセルRNAシーケンシングなどの技術を適用して、脳や脊髄の免疫集団の頻度と表現型をより深く特徴付けることができます。
SMI-32+軸索のカウントは、EAE32,33およびMS34の軸索損傷を検出するための高感度な方法です。SMI-32は、トランセクトされたニューロンの末端球に蓄積する重または中程度のニューロフィラメントの非リン酸化型を検出します。損傷した軸索を検出するための代替法は、軸索輸送の破壊の結果として軸索に蓄積する可能性のあるアミロイド前駆体タンパク質(APP)で染色することである33。SMI-32とAPPの染色パターンは、どちらも軸索損傷を反映しているが、通常は重なり合っておらず、異なる病状を検出していることを示している33。また、脊髄と脳の両方で進行中の軸索損傷の迅速かつ高感度な測定であるsNF-Lを測定することにより、軸索損傷の組織学的測定を補完することもできます。生きているネズミでは半日でできるという利点があります。この方法の欠点は、キットが高価であり、機械が非常に専門化されていることです。sNF-Lキットを販売する会社は、SIMOAマシンにアクセスできない人のためにサービス料金を提供しています。軸索損傷を評価する代替法は、脊髄のトルイジン青色染色切片の軸索を数えるか、または脊髄白質32の領域でSMI-31によって検出されたニューロフィラメント束を数えることによって軸索喪失をスコアリングすることである。これらはどちらも、SMI-32やsNF-L測定よりも手間のかかるアプローチです。
EAEの臨床スコアは群間で異なるが、炎症、脱髄、軸索損傷のスコアリングで群間の差が明らかにならない場合は、GFAPを用いてアストロサイトの活性化を染色することが有用である可能性がある(推奨抗体クローンについては 補足表3 を参照のこと)。アストロサイトの活性化はGFAP染色の増加と関連しており、これはDAラットの慢性EAEを含むいくつかのEAEモデルでEAEの進行と相関することが示されています35。
結論として、このプロトコルは、EAEの組織学的スコアリングを実施するための方法を説明し、分析ワークフローを提供します。
Disclosures
Shannon Dunn は、FSD Lucid Psycheceuticals のコンサルタントを務めています。
Acknowledgments
Dr. Raymond Sobel (Stanford University)には、脳と脊髄の切片をグロスで固定する方法を教えていただき、感謝します。トロント・センター・フォー・フェノゲノミクスのカイル・ロバートン氏とミラン・ガングリー氏には、埋め込み法を学び、脳と脊髄の切片の多くを切断してくれたことに感謝します。Matthew Cussick 博士と Robert Fujinami 博士 (ユタ大学) が、脊髄の髄膜下および血管周囲の炎症をスコアリングするためのプロトコルを共有してくれたことに感謝します。CD45抗体のクローンを共有してくださったShalina Ousmanに感謝します。聖ミカエル病院のKeenan Research Centre of Biomedical Researchで、ティッシュプロセッサーと組織包埋ステーションのトレーニングとこの機器のメンテナンスをしてくれたXiofang Luに感謝します。この研究は、MS Canada(SEDへの)生物医学助成金によって支援されました。カルメン・ウッチフェッリは、カナダ政府からの学生支援を受けています。ヌリア・アルバレス・サンチェスは、キーナンのポスドクフェローシップの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
| 1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
| 15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
| 500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
| 92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
| 95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
| ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
| Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
| Biosafety Cabinet | Any | ||
| Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
| DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
| ddH2O | - | - | |
| Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
| Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
| Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
| Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
| Fumehood | Any | ||
| Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
| Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
| Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
| Light microscope | Any | ||
| Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
| Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
| M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
| Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
| Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
| Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
| Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
| Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
| NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
| Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
| Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
| Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
| OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
| p1000 Pipette and Tips | various | ||
| p200 Pipette and Tips | various | ||
| Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
| pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
| Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
| Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
| Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
| Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
| Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
| Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
| Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
| Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
| SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
| Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
| Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
| Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
| Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
| Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
| Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
| Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
| X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
| Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
| Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
| Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
| Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
| Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408--129 | Used to store mouse serum samples |
| Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
| Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |
References
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