Summary
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) fungerer som en dyremodell for multippel sklerose. Denne artikkelen beskriver en tilnærming for å score ryggmargsbetennelse, demyelinisering og aksonal skade i EAE. I tillegg presenteres en metode for å kvantifisere løselige nevrofilamentlysnivåer i musserumet, noe som letter vurderingen av aksonal skade hos levende mus.
Abstract
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en vanlig immunbasert modell for multippel sklerose (MS). Denne sykdommen kan induseres hos gnagere ved aktiv immunisering med proteinkomponenter i myelinskjeden og Complete Freunds adjuvans (CFA) eller ved overføring av myelinspesifikke T-effektorceller fra gnagere primet med myelinprotein/CFA til naive gnagere. Alvorlighetsgraden av EAE skåres vanligvis på en 5-punkts klinisk skala som måler graden av stigende lammelse, men denne skalaen er ikke optimal for å vurdere omfanget av utvinning fra EAE. For eksempel forblir kliniske score høy i noen EAE-modeller (f.eks. myelinoligodendrocyttglykoprotein [MOG] peptidindusert modell av EAE) til tross for opphør av betennelse. Det er derfor viktig å komplementere klinisk skåring med histologisk skåring av EAE, som også gir et middel til å studere de underliggende mekanismene for cellulær skade i sentralnervesystemet (CNS).
Her presenteres en enkel protokoll for å forberede og flekke ryggmargs- og hjerneseksjoner fra mus og for å score betennelse, demyelinisering og aksonal skade i ryggmargen. Metoden for å score leukocyttinfiltrasjon i ryggmargen kan også brukes til å score hjernebetennelse i EAE. En protokoll for måling av løselig nevrofilamentlys (sNF-L) i serum hos mus ved bruk av en SIMOA-analyse (Small Molecule Assay) er også beskrevet, som gir tilbakemelding på omfanget av total CNS-skade hos levende mus.
Introduction
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er den vanligste murinmodellen for den humane demyeliniserende sykdommen, multippel sklerose (MS)1. Klassisk MS-inflammatorisk patologi, inkludert infiltrasjon av IFN-γ (gamma) og IL-17-produserende T-hjelperceller2, infiltrasjon av inflammatoriske monocytter3, dannelse av perivaskulære og submeningeale inflammatoriske demyeliniserende lesjoner4 og forekomsten av aksonskade4 i sentralnervesystemet (CNS), observeres også i EAE 5,6,7,8,9. Likheten i immunmekanismer mellom EAE og MS har gjort EAE til en egnet preklinisk modell for testing av effekt og virkningsmekanismer av en rekke godkjente immunbaserte terapier for MS, inkludert natalizumab, fingolimod, dimetylfumarat og glatirameracetat (gjennomgått i 1,5). Visse EAE-regimer modellerer andre aspekter av progressiv MS-patologi utover aksonal skade, inkludert utvikling av submeningeal betennelse i hjernen, kronisk demyelinisering, ryggmargsatrofi, synapse og nevrontap 6,10,11,12. Dermed har EAE nytte for screening effekten av nevrobeskyttende terapier for MS.
EAE induseres hos gnagere på en rekke måter. Aktiv immunisering er den vanligste induksjonsmetoden og innebærer immunisering av gnagere med myelinantigener (enten hele proteiner eller peptider) emulgert i CFA supplert med varmedrept Mycobacterium tuberculosis13. Avhengig av musens belastning, administreres kikhostetoksin (PTX) også på dag 0 og dag 2 av immunisering for å øke penetransen av sykdom13. EAE kan også induseres ved adoptivoverføring av myelinspesifikke T-celler oppnådd fra myelin/CFA-primede mus til friske mus14 eller kan utvikle seg spontant hos mus som overuttrykker T-cellereseptorer som er spesifikke for de viktigste myelinantigenene5.
EAE sykdom alvorlighetsgrad og progresjon er vanligvis scoret ved hjelp av en diskret 5-punkts klinisk skala: 1 - hale limpness, 2 - baklem eller fot svakhet, 3 - fullstendig lammelse i en eller begge baklemmer, 4 - forbenet svakhet, 5 - døende eller død13. Dette kliniske skåringssystemet er godt for å dokumentere progresjonen av stigende lammelse som oppstår ved sykdomsdebut, men er mindre følsom for å fange omfanget av utvinning fra CNS-inflammatoriske angrep. For eksempel er både mus som ambulerer med vanskeligheter og mus som ambulerer lett, men viser fotgripende svakhet, tildelt en score på 2 på EAE-skalaen. Score kan forbli høy i den postakutte fasen av EAE på grunn av tilstedeværelsen av permanent aksonskade eller tap, selv til tross for oppløsningen av den inflammatoriske responsen9. Det har vært en rekke forsøk på å utvikle mer raffinerte scoring systemer, atferdstester, målinger av baklemmer og grep styrke, og infrarøde overvåkingssystemer for bedre å fange forskjeller i kliniske underskudd i EAE 9,16,17,18; Disse mer intrikate skåringsmålene skiller imidlertid ikke bidraget fra inflammasjon versus vevsskade til de underliggende nevrologiske utfallene. Dermed er gullstandardtilnærmingen for å score alvorlighetsgraden av EAE å utføre både klinisk og histologisk scoring.
Her beskrives en protokoll for hvordan man dissekerer og legger inn museryggmarg og hjerneprøver i parafin på en måte som fanger den stokastiske prosessen med lesjonsdannelse som oppstår i EAE. Det presenteres også en protokoll for hvordan man flekker seksjoner med Luxol fast blue (LFB), opprinnelig laget av Kluver og Barrera19, som oppdager myelin i CNS. Seksjoner er enten farget med LFB alene (for demyeliniseringsanalyse) eller er motfarget med hematoksylin og eosin (H &E) for å visualisere og score inflammatoriske lesjoner. Protokoller er også gitt for å kvantifisere tilstedeværelsen av totale leukocytter (CD45), tap av myelin, og antall skadede aksoner (SMI-32) i ryggmargen ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer, immunhistokjemiske (IHC) teknikker og offentlig tilgjengelig programvare. Protokollen som brukes til å kvantifisere leukocytter i ryggmargen, kan også brukes til å kvantifisere leukocytter i hjernen.
Histologisk evaluering av aksonalt tap og skade i hjernen er relativt vanskeligere enn i ryggmargen, siden hjernens hvite substanskanaler ikke løper parallelt med hverandre. Måling av serumnevrofilamentlys (sNF-L) har dukket opp som en lovende biomarkør for nevronskade i MS20,21. Nylige studier har utvidet denne teknologien til EAE 22,23,24. Her presenteres en metode for å måle serum nevrofilament lys (sNF-L) i levende mus ved hjelp av en Small Molecule Assay (SIMOA) analyse. Denne metoden krever bare en liten mengde serum og kan gjøres i levende mus på bare en halv dag, og gir rask tilbakemelding på hvordan en testet terapi påvirker den generelle CNS-skaden. Alle metodene beskrevet her kan brukes på mus av noe kjønn eller stamme.
Protocol
Alle eksperimenter utført med mus ble utført under dyrebruksprotokoller godkjent av Unity Health Toronto Animal Care Committee, etter retningslinjene fastsatt av Canadian Council on Animal Care. Sørg for å bruke laboratoriefrakk, vernehansker og briller gjennom laboratorieprosedyrene.
1. Høsting og fiksering av hjernen og ryggmargen
- Avlive musen i henhold til institusjonelle retningslinjer. Legg musen utsatt på et dissekeringsbord og halshugg med kirurgisk saks (kutt nedover).
- Bruk Adson-tang (i ikke-dominerende hånd), ta tak i huden på toppen av musens hode. Deretter gjør du et snitt på 2,5 cm i huden på toppen av hodet ved hjelp av kirurgisk saks.
- Bruk fingrene til å skyve huden på hodet lateralt for å visualisere den underliggende skallen.
- Stabiliser musens hode ved å ta tak i øyehulene med standard Adson-tang.
- Bruk fin saks (dominerende hånd), lage små snips i skallen langs midtlinjen fra cervical ryggraden til olfaktoriske pærer.
MERK: Legg inn bare noen få millimeter saksespisser under skallen om gangen for å unngå å skade den underliggende hjernen. - Bruk Adson tang med tenner for å reflektere skallen lateralt for å avsløre den underliggende hjernen.
- Hold hodet med den ikke-dominerende hånden. Hold saks lukket (dominerende hånd), øs ryggmargen ut fra cervical ryggraden og forsiktig skyve hjernen ut fra skallen, snipping kranialnervene.
- Plasser hjernen i et konisk rør som inneholder 10 ml 10% nøytral bufret formalin som er merket med dyrets ID.
- Snitt pelsen langs midtlinjen av musens torso fra nakken til halen.
- Bruk fingrene til å skyve huden lateralt for å visualisere ryggraden.
- Bruk kirurgisk saks, kutt nedover gjennom ryggraden på det nivået der lårbenene festes til hoften.
- Bruk kirurgisk saks til å kutte kroppsveggen på hver side av ryggraden fra hoften til nakken. Trim bort eventuelle vedlagte organer.
- Plasser ryggraden som inneholder ryggmargen i samme rør av formalin som inneholder hjernen. La hjernen og ryggraden fikse seg i 5–7 dager.
MERK: Tidspunktet for fiksering er viktig. Noen antistoffer vil ikke fungere hvis vevet er overfiksert. Hvis vevet er underfiksert, er det vanskelig å ekstrudere ryggmargen fra ryggsøylen i trinn 2.
2. Inntjening og behandling av ryggmargen og hjernen
MERK: Følgende trinn foregår i en avtrekkshette. Før du starter, tilbered 2 x 10 cm rene petriskåler, en Erlenmeyer-kolbe utstyrt med en trakt foret med filterpapir, to skalpeller (en for kutting av bein og en for kutting av CNS-vev), linsepapir, blyant, embedding kassetter og prøveglass ferdigfylt med 10% formalin.
- Bruk en saks, klipp et lite stykke linsepapir (samme bredde, men dobbelt så lang som kassetten) og legg det i en petriskål.
- Merk en plastkassett med prøve-ID med blyant.
- Hell røret som inneholder den faste hjernen og ryggraden inn i trakten. Overfør ryggraden og hjernen til den tomme petriskålen.
MERK: Den brukte formalinen filtreres gjennom i Erlenmeyer-kolben og kan brukes på nytt i trinn 2.13. - Del hjernen grovt i seks koronale biter ved hjelp av en skalpell. Lag ett kutt caudalt til cerebellum, en i midten av cerebellum, en bare rostral til cerebellum, og to kutt i den gjenværende rostral hjernen, og skaper 3 ekstra koronale skiver med lik tykkelse.
- Bruk tang til å overføre hjerneprøver til den ene halvdelen av linsepapiret i petriskålen.
- Klipp ryggmargen i tre stykker ved hjelp av skalpellen: det første kuttet er laget på bunnen av ribbeholderen, og det andre kuttet er laget like under krumningen i livmoderhalsen.
- Bruk samme skalpell, trim det sakrale ryggstykket i den kaudale enden til ryggmargen kan visualiseres.
- Plukk opp thoracic ryggraden (ikke-dominerende hånd). Hold Adson tang med tennene tett lukket (dominerende hånd) og skyv enden av tangen forsiktig inn i den mindre åpningen av ryggsøylen ved hjelp av en forsiktig vridningsbevegelse. Ledningen skal komme ut fra den andre enden.
NOTATER: Ethvert rundt instrument som er på størrelse med ryggmargen, vil fungere for dette formålet. Hvis ryggmargen ikke spretter ut naturlig, må du ikke tvinge den. Bruk i stedet en fin saks til å klippe beinene langs siden av ryggraden og reflektere den åpen for å avsløre ryggmargen. Alternativt kan du fikse ryggmargen og hjernen i noen ekstra dager i formalin; Imidlertid bør samme fikseringstid brukes på alle prøver for å unngå å introdusere variasjon i antistofffarging. - Plukk opp standard Adson Tang (dominerende hånd). Hold fortsatt ryggmargsstykket med den mindre dominerende hånden, bruk tang for å forsiktig trekke den oppståtte ledningen ut av kolonnen. Legg ryggmargsstykket i petriskålen som inneholder linsepapiret.
- Gjenta denne prosessen for lumbal / sakral og cervical kolonne stykker.
- Del de tre ryggmargsstykkene (cervical, thoracic, lumbal / sacral) i mindre tverrsnittsstykker ved hjelp av en skalpell. Klipp minst 15 segmenter, som hver skal være mindre enn 2 mm tykk.
Kontroller at segmentene er kortere enn de er brede, noe som gjør at seksjonene faller lettere i tverrsnitt under innebyggingsprosessen i trinn 3. - Ordne ryggmargsbitene på samme halvdel av linsepapiret som inneholder hjernebiter. Brett linsepapiret over for å smøre silkebitene og legg dette i den merkede kassetten.
MERK: Linsepapiret forhindrer at små biter av vev slipper ut av kassetten under behandlingen. - Overfør kassetten til en prøvekrukke som inneholder resirkulert eller fersk formalin.
- Gjenta trinn 2.1–2.13 for gjenværende prøver.
- Etter 5-7 dager med fiksering, overfør kassetter fra prøvebeholderen til det første formalinbadet i den automatiske vevsprosessoren (se materialfortegnelse). Kjør vevsprosessoren over natten i henhold til programmet beskrevet i tilleggstabell 1. Prøver holdes i varm parafinvoks til embedding.
3. Embedding og kutting av hjerne- og ryggmargsseksjoner
- Overfør kassetter fra prosessoren til det varme holdekammeret til parafininnebyggingsstasjonen (se materialfortegnelse).
- Bygg ryggmargs- og hjernetverrsnitt fra hver mus i en enkelt parafinblokk som følger (figur 1):
- Hell først parafinvoks bare for å dekke bunnen av formen. Bruk fin tang til å plassere tverrsnittsbiter av hjernekoronal og ryggmarg i parafinen i bunnen av formen.
- Overfør muggsopp til kjøleoverflaten i flere sekunder for å feste hjerne- og ryggmargsbiter på plass. Flytt formen tilbake til den oppvarmede overflaten og fyll den til toppen med varm parafin.
- Plasser kassettlokket (som er merket med prøve-ID) på toppen av formen. Hell mer parafin på toppen av kassettlokket. Overfør formen til kjølestasjonen for å la voksen stivne (avkjøl i 30–60 min).
MERK: Embedding ryggmargen seksjoner krever praksis. For å forbedre suksess, bruk kortere lengder av ryggmargen (<2 mm), da disse er mer sannsynlig å falle i tverrsnitt. Kirurgiske øyeluper kan brukes for å skille om ryggmargsstykker er i tverrsnitt. - Monter parafinblokk på roterende mikrotom. Trim blokk til vev av interesse vises i parafinseksjon.
- Klipp 5 μM bånd av deler av hver blokk og overfør dem til et 42 °C vannbad.
- Samle seksjoner på lysbilder og plasser lysbilder i et lysbildestativ.
- Stek seksjoner ved 37 °C i tørr ovn over natten. Avkjøl lysbilder før du fortsetter til flekker.
4. De-paraffinisering og rehydrering av seksjoner som forberedelse til farging
MERK: Trinn utføres i en avtrekkshette. Før du starter, forberede bad av løsningsmidler. Forbered 5 L 1x PBS (1 L ddH2O, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4; pH = 7,4) med 0,05% Tween-20 (PBS-T) for alle vasketrinn.
- De-parafinisere ved å plassere lysbilder i to påfølgende bad av xylen eller et ikke-xylenbasert løsningsmiddel på en shaker i 5 minutter hver med mild omrøring.
- Rehydrer vev ved å overføre lysbilder gjennom suksessive bad med synkende prosentandeler etanol: 2 x 100% etanol (5 min hver), 2 x 95% etanol (3 min hver) og 1 x 70% etanol (3 min). Hold i 95% etanol for LFB-farging, og rehydrat til 70% etanol, og hold i PBS-T for immunhistokjemi (IHC).
5. LFB for myelin med H&E
- Lag en oppløsning på 0,1 % LFB (0,2 g LFB, se materialfortegnelse, 200 ml 95 % etanol, 0,5 ml iseddik). Bland og filtrer inn i en Erlenmeyer-kolbe. Oppbevares i en mørk flaske til bruk.
- Overfør seksjoner fra 95% etanol til et glassglasshylle som legges i en fargeskål som inneholder LFB. Dekk fatet og forsegl med parafinfilm for å forhindre fordampning.
- Inkuber seksjoner ved 56 °C ovn over natten (maks 16 timer).
- Neste morgen glir overføringen inn i et ddH2O bad og hold.
- I mellomtiden tilberede (1) fersk 0,05% litiumkarbonatoppløsning (0,05 g litiumkarbonat, 100 ml ddH2O); (2) Eosin Y-oppløsning (tilsett 2 g eosinsalt til 40 ml ddH20 og bland til det er oppløst og bland deretter med 160 ml 95% etanol).
- Forbered følgende bad: 1 x litiumkarbonat, 3 x 70% etanol, 3 x 95% etanol, 2 x 100% etanol, 3 x ddH20. Plasser badene i bruksrekkefølge (se tilleggstabell 2).
- Følg trinnene som beskrevet i tilleggstabell 2.
- Etter at lysbildene er tørre, visualiser demyeliniserende lesjoner under mikroskopet.
6. LFB for myelin uten H&E
- Utfør denne fargeprosedyren for analyse av myelin.
MERK: Prosedyren er identisk med trinn 5 (se supplemetær tabell 2), men har en forkortet arbeidsflyt. Etter trinn 4 fortsetter du med å starte på trinn 10.
7. Antigenuthenting og peroksidase-slukking for immunhistokjemiske (IHC) flekker
MERK: Før du starter, lag 100 ml hydrogenperoksid i metanol (1 del 30% hydrogenperoksidoppløsning i 9 deler 100% metanol, i en avtrekkshette). Forbered 1 L av 10 mM citratbuffer med Tween-20 (2,94 g trinatriumcitrat, oppløst i 1 liter ddH20 i et beger på rørplate, bring pH til 6,0 og tilsett 500 μl Tween-20). Forbered PBS-T (se trinn 4). Alle vasker gjøres i bad av PBS-T med mild omrøring (på en shaker) med mindre annet er angitt.
- Slukk endogen peroksidase ved å plassere lysbilder i 3% hydrogenperoksid i metanol i 15 minutter (i en avtrekkshette). Vask lysbildene to ganger i PBS-T (2 min hver).
- Overfør glidene til en metallglideholder og legg i 1 l citratbuffer i en trykkoker. Forsegl lokket og sett en gummipropp på toppen av dampventilen.
- Stek på høyt i mikrobølgeovnen til den gule tappen på trykkokeren spretter opp, noe som indikerer at maksimalt trykk er nådd. Stek i ytterligere 5 minutter ved maksimalt trykk, og fjern deretter trykkkokeren fra mikrobølgeovnen med vernehansker.
- Trykk under trykk ved å fjerne proppen. Fjern lokket og la lysbildene avkjøles i sitratbufferen i 20 min og fortsett deretter til ønsket fargemetode.
FORSIKTIG: Len deg tilbake når du slipper ut dampen, da det kan forårsake en skåldingsskade.
8. CD45 immunhistokjemi
MERK: Denne IHC-metoden brukes til å visualisere infiltrerende leukocytter. Avidin/biotin-blokkeringstrinnene kombineres med blokkerings- og primærantistoffinkubasjonstrinnene.
- Forbered blokkeringsbuffer (2% BSA, 2% kaninserum i 1x PBS).
- Overfør lysbilder til lysbildebrett i glass og vask to ganger med PBS-T (2 min hver). Klargjør avidin/blokkeringsoppløsning (4 dråper/ml avidin i 2 % BSA/2 % kaninserum i 1 x PBS, se materialfortegnelse).
- Tørk av overflødig PBS-T rundt vev ved hjelp av et laboratoriepapir. Bruk en hydrofob penn til å tegne en sirkel rundt vevet og plassere lysbildet i det fuktige kammeret.
- Påfør avidin/blokkeringsoppløsning på hver seksjon (400 μL/slide).
- Dekk fuktig kammer og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. I løpet av dette trinnet, klargjør anti-CD45 antistoff (tilleggstabell 3) i blokkerende buffer inneholdende biotin (4 dråper / ml biotin, 2% BSA / 2% kaninserum i 1x PBS).
- Trykk av blokkeringsløsningen fra lysbildet til en lofri laboratorieserviett. Dab rundt vev ved hjelp av en laboratorieserviett for å fjerne overflødig væske.
- Plasser lysbildet tilbake i et fuktig kammer. Tilsett 400 mikrol CD45 antistoffoppløsning (se Materialfortegnelse) i avsnittet. Inkuber over natten ved 4 °C i et tildekket fuktig kammer.
- Neste dag, tøm av primære antistoff og vask lysbilder 3 x i PBS-T (5 min hver).
- Tørt område rundt seksjonen ved hjelp av et lofritt laboratorium og tilsett deretter 400 μL sekundært antistoff (1:200 fortynning i blokkeringsbuffer) på hver seksjon. Inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- I mellomtiden forbereder ABC-reagens (se materialtabell) ved å tilsette 2 dråper reagens A til 5 ml 1x PBS og blande. Tilsett 2 dråper reagens B til samme løsning og bland (tilbered ~30 min før bruk).
- Vask lysbildene i 3 skift på 1x PBS-T (5 min hver) og plasser lysbildene i et fuktig kammer.
- Tilsett 400 μL ABC-reagens til seksjoner. Dekk fuktig kammer og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask lysbildene i 3 skift på 1x PBS-T (5 min hver). I mellomtiden klargjøres en passende mengde DAB-oppløsning i et foliedekket 15 ml sentrifugerør i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
- Ta ett lysbilde og fokuser på en ryggmargsseksjon under et mikroskop. Legg til 400 μL DAB i lysbildet og start labtimeren.
- Visualiser seksjonen mens den utvikler seg og stopp timeren når leukocytter er brune. Overfør lysbildet til et ddH20-bad for å stoppe reaksjonen. Hold i vann i 5 min. Samme utviklingstid brukes for de gjenværende lysbildene.
FORSIKTIG: DAB er kreftfremkallende. Kast DAB-avfall og post-DAB ddH2O som farlig avfall. - Motflekk lysbilder med Mayers hematoksylin i ~4-10 min (se tilleggstabell 2). Skyll sklier under rennende vann fra springen i 10 min.
- Dehydrer i 95% etanol (1 x 3 min), etterfulgt av absolutt 100% etanol (2 x 3 min hver).
- Flytt inn i en avtrekkshette, overfør lysbildene til xylen eller et xylen-erstatningsløsningsmiddel i 5 minutter. Dekkslipp med monteringsmedium, og la skliene tørke i 1-2 dager i avtrekksdekselet.
FORSIKTIG: Hvis du bruker xylen, bruk doble hansker og tang for å håndtere lysbilder når dekselet glir, siden det er giftig og kan oppløse hansker. - Rengjør lysbildene med xylen og skann med en lysbildeskanner ved 20 x forstørrelse.
9. SMI-32 IHC for aksonal skade
MERK: Denne protokollen bruker et mus SMI-32 antistoff, som reagerer mot ikke-fosforylert nevrofilament tung, som kan akkumuleres i skadede aksoner25. Siden dette antistoffet har blitt hevet i mus og oppdager et museantigen, anbefales det at et mus på mus (MOM) -sett brukes. I denne prosedyren gjøres avidin / biotinblokkeringstrinnet som et separat trinn fra den primære antistoffinkubasjonen. Før du starter denne protokollen, må du deparafinisere, rehydrere, slukke endogen peroksidaseaktivitet og utføre antigenuthenting som beskrevet i trinn 4 og trinn 7.
- Vask seksjonene to ganger med 2 x PBS-T (2 min hver). Fjern ekstra væske rundt seksjoner ved hjelp av et laboratorievev og tegne en sirkel rundt vev ved hjelp av en hydrofob penn.
- Legg 400 μL blokkeringsbuffer (2% (w / v) geiteserum i 1x PBS-T) med avidin (4 dråper / ml) til seksjonene. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Dypp lysbildene to ganger i 1x PBS-T. Tilsett 400 μL blokkeringsbuffer med biotin (4 dråper / ml) til lysbildet og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Vask lysbildene i et 1 x PBS-T-bad i 2 minutter. I mellomtiden forbereder du MOM-blokkeringsreagens ved å tilsette 2 dråper stamløsning (se materialtabell) til 2,5 ml 1x PBS.
- Tilsett 400 μL MOM-reagens på seksjonen. Inkubere i 1 time ved romtemperatur.
- Vask lysbildene to ganger i et 1x PBS-T-bad i 2 minutter. I mellomtiden forbereder du MOM-fortynningsmiddel ved å tilsette 300 μL proteinkonsentratløsning til 3,75 ml 1x PBS.
- Tilsett 400 μL MOM-fortynningsmiddel og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden fortynne SMI-32 antistoff (se tabell over materialer) i MOM fortynningsmiddel.
- Trykk av fortynningsmiddelet fra lysbilder og legg til 400 μL SMI-32 antistoffløsning på seksjonen. Dekk det fuktige kammeret og rug i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask lysbildene to ganger i et 1x PBS-T-bad i 2 minutter, hver med mild omrøring. I mellomtiden, fortynn MOM anti-mus IgG arbeidsreagens i fortynningsmiddelet (10 μL av lager i 2,5 ml fortynningsmiddel).
- Tilsett 400 μL anti-mus IgG arbeidsreagens per lysbilde. Inkuber i 10 min.
- Vask lysbildene to ganger i et 1x PBS-T bad i 2 min hver. Fortsett å fargelegge ved å følge trinnene som er beskrevet i CD45-fargeprotokollen (trinn 8.11 – 8.19).
10. LFB og H&E scoring for tilstedeværelse av demyeliniserende lesjoner
MERK: Følgende er en analysemetode som kan brukes til å få rask innsikt i alvorlighetsgraden av inflammatorisk demyelinisering. Denne analysen utføres i deler av navlesnoren som prøves på forskjellige nivåer (cervikal, thorax og lumbal, minst 3 seksjoner per / nivå). Se Allen Brain Atlas for Mouse ryggmarg26 for å identifisere det anatomiske nivået i ryggmargen. Denne analysen krever TIFF-filer. Hvis skannede bilder er i .czi-format, følger du instruksjonene i tilleggstabell 4 for å konvertere czi-filer til TIFF-filer.
- Åpne TIFF-bildet av delen som skal analyseres ved å dra og slippe filen i ImageJ. Observer ryggmargsseksjonen i 4 kvadranter: dorsal, venstre lateral, høyre lateral og anterior (figur 2A,B).
- Skår for tilstedeværelse av demyeliniserende lesjoner i hver kvadrant som vist i figur 2.
MERK: Tilstedeværelsen av en lesjon resulterer i en score på 1 i den kvadranten, for totalt 4 mulige poeng per seksjon. En score på 1 tildeles selv om det er flere lesjoner i en kvadrant. - Legg opp alle punkter for hver mus og del med det totale antall kvadranter samplet for å oppnå brøkdelen av kvadranter med sub-meningeal lesjoner.
11. Beregning av arealfraksjonen av LFB-farging i ryggmargen hvit substans
MERK: Denne analysen måler prosentandelen av ryggmargen hvit substans som er farget med LFB.
- Åpne en LFB-farget seksjon lagret som en TIFF-fil ved å dra / slippe filen i ImageJ.
- Klikk på Bilde > Skriv inn > 8-bit for å produsere et gråtonebilde. Klikk på bildet > juster terskelen >. Juster den nederste glidebryteren slik at det røde overlappet fanger opp alle de mørke områdene (myelin) som øye ser (figur 2C–E). Klikk på Bruk.
- Klikk på Analyser > verktøy > ROI Manager for å åpne ROI Manager.
- Velg mangekanttegningsverktøyet på verktøylinjen i ImageJ. Dette tegneverktøyet gjør det mulig å skissere et område av ryggmargen med datamusen.
- Skissere ryggregionen i ryggmargen og legg polygonen til ROI Manager ved å klikke t på tastaturet.
- Skissere den fremre-laterale regionen av ryggmargen hvit substans og legg polygonen til avkastningsbehandleren.
MERK: Ved sporing utelukkes store blodkar, rifter i vev, artefakter og områder ved siden av dorsalhornet (figur 2A,B-pil), som normalt er mindre myeliniserte. Vær så nøyaktig som mulig når du sporer, siden det å inkludere for mye hvit bakgrunn vil forskyve resultatene. - Klikk på Analyser > Angi målinger og velg Arealbrøk.
- Klikk på Mål i ROI Manager. Dette vil gi brøkdelen av det skisserte området som er farget med LFB.
- Kopier verdiene til Excel fra boksen nylig produserte resultater, og lukk bildevinduet. Beregn gjennomsnittlig % fraksjonsareal farget for dorsale og ventro-laterale regioner. Beregne gjennomsnittet av disse for å få en verdi for den delen.
- Gjenta trinn 11,1–11,9 for cervikale, thorax og lumbale snitt (N = 3/nivå/mus).
- Beregn gjennomsnittlig prosent myelinfraksjon for alle seksjoner for hver mus. Prosent demyelinisering estimeres ved å trekke % arealfarging fra 100.
12. Analyse av antall CD45+ celler og SMI-32+ aksonovoider
- Dra og slipp et CD45- eller SMI-32-farget TIFF-bilde til ImageJ. Klikk på Analyser > Angi skala > Global > Ok for å stille skalalinjen over alle bilder. Merk at dette bare gjøres for det første bildet.
- Velg polygontegneverktøyet og spor rundt den grå substansen ved hjelp av datamusen. Klikk på Analyser > Mål og registrer resultatene i Excel som "Gråstoffområde".
- Med den tegnede polygonen fortsatt på bildet, fjern den grå saken fra bildet ved å klikke på Delete-tasten (tastaturet). Denne handlingen etterlater bare den hvite substansen som skal analyseres.
- Skisser hele ryggmargsseksjonen ved hjelp av polygontegneverktøyet . Ekskluder eventuelle områder av vev som mangler eller er skadet.
- Klikk på Analyser > Mål og registrer resultatene som "Totalt vevsareal" i Excel-filen.
- Klikk på bilde > farge > fargedekonvolusjon. Fra rullegardinvinduet vektorer velger du H DAB. Tre nye vinduer vil dukke opp – behold det brunfargede vinduet (DAB-kanalen) og slett andre bildevinduer.
- Klikk på bildet > juster terskelen >. Juster den nederste glidebryteren for å terskelere bildet slik at det røde overlegget fanger opp samme mengde brun farging som oppdages av øyet. Klikk på Bruk.
- Klikk på Process > Binary > Watershed. På dette trinnet sammenligner du det opprinnelige bildet og det binære bildet for å sikre at de er enige.
- Klikk på Analyser > analyser partikler. Velg Vis overlegg og endre innstillingene: Størrelse = 5 - 150 μm2, Sirkularitet = 0,4 - 1. Klikk på OK.
Disse innstillingene tillater at individuelle celler og små grupper av celler som ikke ble delt med vannskillefunksjonen, inkluderes i motsetning til å bli ekskludert i analysen. - I resultatvinduet registrerer du det siste tallet i kolonnen lengst til venstre i Excel, som representerer det totale partikkelantallet. Deretter beregner du arealet av hvit substans (totalt vevsareal – grå materieareal i mm2). Ekspress totalt partikkelantall per areal av hvit substans (telling/mm2).
- Gjenta trinnene for hvert lagrede RGB-bilde. Når alle ryggmargsseksjoner er analysert for en mus, gjennomsnittlig partikkelantall per mm2 vev for den musen.
MERK: Arbeidsflyten som brukes til å analysere ryggmargsleukocytter kan også brukes på hjernegrupper.
13. Måling av sNF-L ved hjelp av en SIMOA-analyse
- Samle 100-200 μL blod fra levende mus ved saphenøs blødning ved hjelp av kapillære mikrotainerrør eller via hjertepunksjon ved hjelp av en sprøyte og 25 G nål (terminal prosedyre). For sistnevnte, overfør blod til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- La blodet koagulere ved romtemperatur i 30–60 min.
- Sentrifugeprøver ved 2660 x g i 5 minutter ved 4 °C og pipett øvre fraksjon (serum) inn i et nytt mikrosentrifugerør. Oppbevar serumet ved -80 °C til det er klart til bruk.
- Klargjøring: La kalibratorer og kontroller (NF-lysanalysesett, se materialfortegnelse) varmes opp til romtemperatur i 1 time før bruk. Ta enzymsubstratet (RGP) ut av kjøleskapet og oppbevar det i et vannbad på 30 °C i minst 30 minutter, virvel hvert 10. minutt.
- Tine serumprøvene på is. Når den er tint, tar du forsiktig virvelprøver og sentrifuge ved 10000 x g i 5 minutter for å pelletere eventuelle rusk.
- Legg i platen: Vortex kalibratorene og kontrollene. Legg kalibratorene i duplikat, kontroller i duplikater og serumprøver i duplikat på 96-brønnplaten som følger med settet. Serumprøver fortynnes i forholdet 1:3 med fortynningsmiddel i settet. Forsegl platen.
- Slå på SIMOA-maskinen (se Materialfortegnelse) i rekkefølgen datamaskin, program og deretter maskin. La maskinen initialisere og kjøre vedlikehold på startdagen .
- Vortex de magnetiske perlene i 30 s.
- Legg inn reagensfliker på skjermen, dobbeltklikk på stativposisjonen der reagensflasken skal plasseres, og skann deretter strekkoden til flasken.
- Plasser magnetiske perler i risteposisjon på stativet (posisjon 1–3).
- Fortsett å laste detektoren, SBG-reagenset og RGP-reagenset inn i maskinen.
- Klikk på innstillingen på programvaren. Forsikre deg om at prøvemodus er på platen. I kategorien Installasjonskjøring gir du eksperimentet et navn.
- Tilordne brønner på platen til kalibratorene på følgende måte: Klikk på brønnen, og velg deretter analysen. Velg kalibrer A og klikk deretter på stigende. Merk brønnene A1-8, og klikk deretter replikater (2) for å tilordne koordinatene for kalibratorene som skal kjøres i duplikat. Kjør ved hjelp av den pene protokollen.
MERK: Se analysesertifikatet (produsentens nettsted) for å få konsentrasjonene til hver kalibrator for hvert enkelt partinummer. Når brønner er tildelt, er det ikke mulig å navigere bort fra denne skjermen uten å miste arbeidet, før platen er låst på plass. - Tilordne eksemplene ved å følge trinnene nedenfor:
- Nederst til høyre på skjermen klikker du på knappen for å tilordne prøvene. brønner der prøvene skal ligge.
- Merk av analysen som skal kjøres fra listen, velg antall replikater, og spesifiser den innebygde fortynningen på 4x.
- Med brønnene fortsatt uthevet, skriv inn et prefiks for prøve-ID og startnummer, og klikk deretter på generer for å produsere sekvensielle IDer for prøvene. Gjenta trinnene for kontrolleksempler.
- Legg platen inn i plateholderen (A1 til A12).
- På skjermgrensesnittet klikker du på ferdige programmeringsprøver og fortsetter til kategorien systemressurser. Kontroller at alle reagensbeholdere er fulle og avfallsbeholderne er tomme.
- Klikk på Kjør.
- Når kjøringen er fullført, kontrollerer du kalibreringskurven under fanen "Datareduksjon" ved å velge analysen og platenavnet.
- Gå til "Run History" og bruk filtrene for å finne den siste kjøringen. Velg kjør og deretter alle resultater. Klikk på eksporter, og lagre .csv filen. Klikk på rapporten , og velg deretter batchkalibreringsrapport og velg den siste kjøringen. Forhåndsvis rapporten og eksporter den.
- Kjør slutten av dagen vedlikehold anbefalt av produsenten. Slå av programmet, maskinen og deretter datamaskinen.
Representative Results
Figur 3 viser representativ IHC og histokjemisk farging, med eksempler på både akutte (venstre) og eldre EAE-lesjoner (høyre). Representativ CD45-farging med hematoksylinmotfarging er vist i figur 3A,B. Figur 3C–F viser eksempler på LFB-farging med (figur 3C,D) eller uten (figur 3E,F) H&E-motflekken. Selv om hematoksylin ikke er spesifikt for immunceller, flekker kjernene i immuncellene mørkere og kan skilles fra CNS-bosatte celler. Figur 3G,H viser representativ farging av SMI-32+ aksoner, motfarget med hematoksylin. Legg merke til det økte utseendet på denne flekken i eldre EAE-lesjoner.
Skade på myeliniserte spor er mest utbredt i ryggmargen i aktiv murine EAE, og dette er hoveddriveren for lammelse i denne sykdommen 7,9. Skåring for tilstedeværelse av inflammasjon og vevsskade i ryggmargen prioriteres derfor i histologiske analyser. EAE-lesjoner forekommer sporadisk i forskjellige regioner (anterior, lateral eller dorsal) (figur 2A,B) og i forskjellige nivåer (sakral, lumbal, thorax, cervikal) i ryggmargen. Den beskrevne innebyggingsmetoden sikrer god prøvetaking av lesjoner gjennom hele ledningen. Flere deler bygges inn enn analyseres, siden enkelte deler kan bli skadet under behandlings- eller inndelingsprosessen. For å sikre representativ prøvetaking analyseres minst 3 representative seksjoner på livmorhals-, thorax- og lumbalnivå i ryggmargen for hver mus. Identiteten til hvert eksemplar er blindet slik at personen som utfører analysen ikke er partisk når han velger representative seksjoner for analyse.
For å få rask innsikt i forskjeller i histologisk alvorlighetsgrad av EAE, kan man skåre for tilstedeværelse av submeningeale demyeliniserende lesjoner i ryggmargskvadranter i utvalgte snitt (figur 2A,B). Dette er en rask metode som kan utføres på skannede bilder eller ved hjelp av et lysmikroskop. Denne analysen er følsom nok til å oppdage forskjeller i histologisk EAE-alvorlighetsgrad mellom grupper når EAE er alvorlig i en gruppe og mild i en annen. For eksempel, i eksperimentet i figur 4, ble EAE indusert i kvinnelig villtype (WT) og mus med delesjon i OGR1 (OGR1 KO) ved bruk av MOG p35-55 / CFA pluss PTX. Mus i WT-gruppen utviklet alvorlig EAE med fullstendig lammelse, mens OGR1 knockoutgruppen utviklet mild sykdom. Denne forskjellen i klinisk skår tilsvarte en forskjell i andelen kvadranter som hadde submeningeale lesjoner (figur 4C).
Det er viktig å komplementere skåringen av demyeliniserende lesjoner med prosentvis arealfraksjon av myelinfarging for å fange opp omfanget av tap av myelin- og/eller myeliniserte aksoner under det autoimmune angrepet. I eksempelet i figur 4 var myelinfraksjonen i prosent også signifikant forskjellig mellom OGR1- og WT-musene (figur 4D). Den prosentvise myelinfraksjonen korrelerer også signifikant med den kumulative EAE-skåren hos mus med EAE (figur 4E) og fungerer derfor som et godt mål på total vevsskade i denne sykdommen. Merk at denne protokollen ikke skiller intensiteten av myelinflekken. Hvis dette er det ønskede resultatet, bør man utføre immunfluorescensfarging for myelinproteiner som proteolipidprotein eller myelinbasisk protein og måle intensiteten av denne fargingen.
I tilfeller der EAE er alvorlig i begge komparatorgrupper, vil en høyere andel av ryggmargskvadranter inneholde inflammatoriske/demyeliniserende lesjoner. I dette tilfellet er en mer sensitiv tilnærming til skårinflammasjon å telle antall CD45+ leukocytter per mm2 hvit substans (se representativ farging i figur 3A). CD45-antistoffklonen beskrevet her oppdager alle infiltrerende leukocytter, og flekker bare sporadisk mikroglia som oppregulerer CD45-uttrykk i EAE (se åpen pil i figur 3B) og er derfor nyttig for å fange perifer immuncelleinfiltrasjon.
I lengre EAE-studier (>20 dager) anbefales det at man også gjennomfører en analyse av aksonskade. SMI-32-farging i ryggmargsseksjoner er en sensitiv metode for å oppdage skadede aksoner. Selv om betennelse i ryggmargen avtar med tiden og sparte aksoner kan re-myelinisere, viser overlevende aksoner en ulik grad av restskade9 (figur 3G,H). For eksempel, i MOG p35-55-indusert modell av EAE i C57BL6 / J-mus, er omfanget av aksonal skade og tap en driver for kliniske score etter at den inflammatoriske prosessen har avtatt9. Figur 5 viser et eksempel på dette i et EAE-eksperiment hos hann- og hunnmus WT-mus og mus som mangler et gen kalt peroksisomproliferatoraktivert reseptor-delta (PPAR-delta) i myeloidrommet (LysMCre: Ppardfl/fl). Hos hannene gjenvant WT-musene bakekstremitetsfunksjonen, men de kliniske skårene forble høye hos hannens LysMCre: Ppardfl/fl-gruppe. Derimot, i forsøket hos hunnene, hadde begge eksperimentelle gruppene høy score gjennom hele. Ved første øyekast antydet dette resultatet at PPAR-delta hadde en kjønnsspesifikk effekt i EAE; Patologisk skåring av ryggmargen viste imidlertid at mus av begge kjønn i LysMCre: Ppardfl/fl-gruppen hadde økt aksonal skade sammenlignet med WT-kolleger (figur 5B). En genotypeeffekt på kliniske resultater ble sannsynligvis ikke observert hos kvinner fordi WT-hunnmus hadde en tendens til å vise økt aksonal skade, noe som manifesterte seg i kroniske nevrologiske utfall.
I det samme eksperimentet ble kvinnelige LysMCre: Ppardfl / fl kvinnelige mus funnet å ha mer omfattende T-celleinfiltrasjon i lillehjernen, noe som gir et eksempel på hvordan scoring hjernebetennelse kan være nyttig i EAE. Ved EAE finnes inflammasjon i hjernen hovedsakelig i lillehjernen og hjernestammen (figur 6A,D,G), men kan også finnes i hjernehinnene (sett under hippocampus i figur 6C), nær ventriklene (figur 6F) og andre kanaler i hvit substans, inkludert synsnerven og corpus collosum (figur 6B,E). Scoring hjernebetennelse gjøres i en bestemt hjernegruppe (f.eks. Cerebellar hvit substans) ved å telle antall CD45-celler per mm2 vevsområde ved hjelp av samme metode som beskrevet for ryggmargsprotokollen. I den innbringende metoden som er skissert her, er et kutt midt i lillehjernen, som gir perspektivet til lillehjernen og hjernestammen som vist i figur 6A.
Måling av sNF-L ved hjelp av en SIMOA-analyse har blitt en nyttig biomarkør for å vurdere pågående aksonal skade og respons på terapi ved attakkpreget MS 20,21,27,28. Det samme SIMOA-analysesettet som brukes til å måle sNF-L-mennesker, kan brukes til å måle musens sNFL 22,23,24. For å undersøke hvor godt denne analysen utfører, oppdager aksonal skade i EAE, ble sNF-L målt i kvinnelige C57BL6 / J-mus ved sluttpunktet av et EAE-eksperiment, og nivåene ble sammenlignet med de i kjønnsmatchede friske kontrollmus som ikke hadde EAE. Det ble funnet at mus med EAE hadde mye høyere nivåer av sNF-L enn hos friske mus (figur 7A), og disse nivåene korrelerte med tettheten av SMI-32+ aksoner i ryggmargen (figur 7B). Sammenlignet med histologisk skåring av aksonal skade, er SIMOA-analysen raskere (fra blødende mus til resultater kan oppnås på litt over en halv dag) og gir derfor rask tilbakemelding på hvordan en behandling virker i levende mus. Denne analysen har også den fordelen at den reflekterer aksonal skade i både ryggmargen og hjernen.
Figur 1 Representativ parafinblokk i hjerne- og ryggmargssnitt. De 5 koronale hjerneseksjonene og ryggmargstverrsnittene (1,5-2 mm tykke) er innebygd i samme blokk slik at de kan kuttes i en seksjon. Minst 15 seksjoner av ryggmargen bør bygges inn, noe som muliggjør tilstrekkelig utvalg av seksjoner for analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Skåring av meningeal inflammasjon og prosentandel myelinareal i thoracal ryggmargsnivå. (A,B) viser bilder av thoracal ryggmarg fra en kvinnelig C57BL6/J-mus med MOG p35-55-indusert EAE farget med LFB/H&E. Vist er tilnærmingen som brukes til å visualisere kvadranter og eksempler på demyeliniserende lesjoner (sporet i stiplet linje). Musen i A har 4 av 4 kvadranter med konfluente demyeliniserende lesjoner, mens musen i B har 1 av 4 kvadranter berørt. Musen i B har noe betennelse i andre kvadranter, men dette har ikke manifestert seg i en konfluent lesjon og er derfor ikke scoret. (C–E) Eksempel på LFB-bilde og gråtone- og terskelbilde i imageJ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Ryggmargssnitt farget med CD45, LFB H&E, LFB og SMI-32. Eksempler på en tidlig (A,C,E,G) og sen (B,D,F,H) submeningeal lesjon i ryggmargen farget for CD45-antistoff (A,B), LFB/H&E (C,D), LFB alene (E,F) og SMI-32 antistoff (G,H). Svarte piler viser eksempler på celler farget med hvert respektive antistoff. Hvite piler viser antatt mikroglia som har blitt farget som CD45+. Skala bar = 50 μm. Denne figuren viser representativ farging av lesjoner i ryggmargen til en kvinnelig C57BL6 / J-mus under EAE og fremhever hvordan patologi kan være forskjellig på tvers av forskjellige ryggmargsseksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Anvendelse av skåring for lesjoner og prosentvis demyelinisering i EAE. Vist er et eksempel på et EAE-eksperiment hvor hunnmus med mangel på eggstokkreft G-proteinkoblet reseptor 1 (OGR1)-genet på C57BL6/J-bakgrunnen utviklet mindre alvorlig klinisk EAE enn villtype (WT) hunnmus C57BL6/J. EAE ble indusert av immunisering med MOG p35-55/CFA pluss PTX og mus ble skåret i henhold til følgende kliniske skala: 1 = halelammelse. 2 = svakhet i bakben og fot, 3 = lammelse i bakbenet, 4 = svakhet i forbenet, 5 = døende. (A) Gjennomsnittlig + SEM klinisk score på mus over tid. (B) Vist er et eksempel på LFB / H &E farging i ventral ryggmargen. Skala bar = 50 μm. (C) Gjennomsnittlig + SEM prosent kvadranter som inneholdt demyeliniserende lesjoner. (D) Gjennomsnittlig + SEM-prosent demyelinisering i hver gruppe. (E) viser resultat fra et annet eksperiment i MOG p35-55-indusert EAE i C57BL6/J-mus hvor EAE-score for individuelle mus ble summert over 30 dager med observasjon og var korrelert med prosentvis demyelinisering i ryggmargen. Korrelasjoner ble utført ved hjelp av en Spearman-test. Paneler i (A-D) er tilpasset fra Souza C et al.29. Data i (E) er originale data. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Anvendelse av SMI-32-farging for å forstå effekten av en genotype på klinisk EAE-fenotype. Denne figuren viser et eksempel på et EAE-eksperiment hvor mannlig og kvinnelig villtype (bære floxed allel av Ppard) og myeloide spesifikke Ppard mutante mus (LysMCre: Ppardfl / fl) på C57BL6 / J bakgrunnen ble immunisert med MOG p35-55 / CFA og PTX og ble fulgt i 45 dager. (A) viser gjennomsnittlig + SEM klinisk score for mus. (B) viser gjennomsnitt + SEM-resultater av histologisk skåring av antall SMI-32+ aksoner i ryggmargen, %kvadranter med submeningeale lesjoner, prosentkvadranter med perivaskulære mansjetter og #CD3 lesjoner i lillehjernen per mm2 vev. Dette eksperimentet viste en genotypeeffekt på SMI-32-farging. Denne figuren er tilpasset fra Drohomyrecky. m.fl.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på CD45+/hematoksylinfarging i hjernekoronale seksjoner i MOG p35-55-indusert EAE hos hunnmus C57BL6/J. CD45+ lesjoner er vist i brunt. (A) CD45+ -lesjoner i hjernestammen i koronale seksjoner. Skala bar = 150 μm. (B–G) Eksempler på CD45+ -lesjoner i synsnervene (B), meningeal ekstensjoner under hippocampus (C), hjernestammen (D), corpus collosum (E), mediale habenula nær ventrikkelen (F) og lillehjernen (G). Skalastang: (B–G) = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: sNF-L-nivåer i serum i MOG p35-55-indusert EAE. (A) Serum NFL-nivåer samlet fra kvinnelig kontroll og EAE-mus ved sluttpunktet i ett eksperiment. Data ble analysert ved hjelp av en tosidig Mann Whitney-test. (****p verdi < 0,0001). (B) Ryggmargsseksjoner ble høstet på endepunktet og farget med SMI-32. Antall positive celler per vevsareal i hvit substans ble bestemt og korrelert med serum NF-L ved endepunkt ved hjelp av en Spearman-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Beskrivelse av bad brukt i vevsbehandling. Kassetter flyttes automatisk gjennom disse badseriene ved hjelp av en automatisert prosessor. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 2: Trinn i Luxol Fast Blue og Hematoxylin og Eosin farging. Denne tabellen beskriver rekkefølgen på trinnene i fargeprotokollen Luxol Fast Blue og Hematoxylin og Eosin. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 3: Antistoffer brukt til immunhistokjemisk farging. Beskrevet er antistoffene som brukes i denne protokollen, så vel som de som kan brukes til å utforske betennelse, mikrogliose og astrogliose. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 4: Slik konverterer du .czi til TIFF-filer. Merk at det er optimalt å bruke et høyoppløselig bilde, men bilder med middels oppløsning kan lagres i stedet hvis datamaskinens arbeidsminne er begrensende. Det er viktig å bruke bilder med samme oppløsning på tvers av analyser. Vær også oppmerksom på at det siste bildet i serien er lysbildeetiketten. Unngå å lese etiketten for å sikre at analysen er blindet. 30,31 Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Histologisk farging av ryggmargen er et viktig verktøy for å vurdere alvorlighetsgraden av EAE-sykdommen, spesielt i tilfeller der det er forskjeller mellom behandlingsgruppene i graden av sykdomsbedring i den postakutte sykdomsfasen. Farging for immuncelleinfiltrasjon (CD45), myelin (LFB) og aksonal skade (SMI-32) bidrar til å karakterisere den underliggende årsaken til de endrede kliniske resultatene hos mus. Den histologiske fargeprotokollen beskrevet her gir et perspektiv på inflammasjon samt omfanget av myelin- og aksonal skade. Videre viste resultatene validere sNF-L-måling som en metode for å vurdere omfanget av total nevronskade i EAE.
De kritiske parametrene for denne analysen er å sikre at etterforskerne er blindet for identiteten til seksjonene og at det er tilsvarende prøvetaking på hvert nivå av ryggmargen over de forskjellige musene. Dette skyldes at alvorlighetsgraden av betennelse kan være større ved lavere nivåer av ledningen. En annen kritisk parameter er størrelsen på eksperimentelle grupper. Ryggmarg og hjerne høstes typisk fra 6–8 mus per gruppe ved endepunktet for å se signifikante forskjeller mellom grupper med behandlinger eller genotyper med beskjedne effektstørrelser. Det er også viktig å sikre at utvalgte mus, når de er gjennomsnittet, har representative gjennomsnittlige score for hele gruppen. Når det gjelder feilsøking, er et vanlig problem som oppstår av de som er uerfarne med protokollen, at ryggmargen er fast i utilstrekkelig lang tid, og det er ikke lett ekstrudert fra ryggraden. Hvis dette er tilfelle, kan ryggmargen manuelt dissekeres fra kolonnen ved å klippe langs de spinøse prosessene ved hjelp av fin saks og åpne kolonnen for å avsløre ryggmargen. Alternativt kan vev fikses i noen ekstra dager uten å forstyrre suksessen med antistofffarging. Antistoffklonene som er beskrevet her virker i vev festet opptil 2 uker i formalin.
Embedding ryggmargen stykker krever dyktighet og praksis. Det anbefales at øyeluper brukes og en lampe rettes over innebyggingsstasjonen for bedre å visualisere om seksjonene faller i tverrsnitt eller i langsgående seksjon. Å holde lengdene på ryggmargsbitene på mindre enn 2 mm under inntjening vil hjelpe dem å falle i tverrsnitt. Et annet vanlig problem som oppstår for mindre erfarne brukere er at LFB fordamper under inkubasjonen over natten, og etterlater halvparten av lysbildet farget og halvparten ufarget. For å unngå fordampning, bør glassfatet forsegles med termoplastfilm og deretter plastfolie. Hvis fordampning oppstår og seksjoner er ujevnt farget, anbefales det å fjerne lysbildene helt med litiumkarbonat og flekke dem igjen i LFB over natten. Et annet vanlig problem er at brukerne ikke helt de-blå den grå substansen etter LFB. Det er viktig å undersøke individuelle seksjoner under mikroskopet for å sikre at en tilstrekkelig mengde de-bluing er nådd før du fortsetter med andre trinn i protokollen. I tillegg, selv om CD45 og SMI-32 IHC-flekkene fungerer robust, er det fortsatt viktig å feilsøke antistoffkonsentrasjoner i innledende eksperimenter for hvert nytt antistoffparti mottatt. Dette kan gjøres ved å teste en rekke konsentrasjoner av antistoffet på en positiv kontrollseksjon (EAE ryggmarg). Førstegangsfarging bør også inkludere en negativ kontroll som består av sekundært antistoff alene uten tilsatt primærantistoff. Til slutt er det kritisk i bildeanalysen å terskelere enkeltbilder, da farging kan være ujevn på tvers av lysbilder eller seksjoner.
Denne protokollen bruker fritt tilgjengelig programvare. Hvis man ikke har tilgang til en prosessor, en embedder eller mikrotom, kan disse trinnene hentes til en sykehusbasert patologikjerne som tilbyr disse tjenestene. Også, hvis man ikke har tilgang til en lysbildeskanner, kan man bruke et lysmikroskop som er utstyrt med et videokamera for å lagre TIFF-bilder av ryggmargen eller hjerneregionene. For en mikroskopbasert arbeidsflyt, ta LFB- eller LFB / H&E-seksjoner ved lav effekt (40x forstørrelse) og for CD45- og SMI-32-farging, avbilde minst fire vinduer som er sentrert i ventrale, dorsale og laterale deler av ryggmargen (200x forstørrelse for CD45 og 400x forstørrelse for SMI-32). Bildeanalyse kan utføres på disse bildene for å kvantifisere farging på en lignende måte som beskrevet.
Beslutningen om hvilken histologisk tilnærming som skal tas for å skåre EAE er avhengig av hvor mye de kliniske skårene varierer mellom gruppene. For eksempel, hvis det er drastiske forskjeller i EAE klinisk score (en gruppe fikk EAE og en ikke), er dette vanligvis relatert til forskjeller i perifer mediert inflammasjon. I dette tilfellet er skåring for tilstedeværelse av demyeliniserende lesjoner på LFB/H&E-fargede seksjoner tilstrekkelig og vil avsløre forskjeller mellom grupper. Hvis gruppene er likere i klinisk skår ved debut, og det i stedet er forskjeller i graden av klinisk bedring (f.eks. eksperiment i figur 5A), er det best å bruke hele den histologiske arbeidsflyten som er skissert her, inkludert skåring av hjernebetennelse i hjernestammen og lillehjernen, for å skille om forskjellene i sykdomskronisitet er relatert til forskjeller i inflammasjon eller vevsskade. Hvis forskjeller i inflammasjon blir funnet vurdert ved CD45-telling, kan ytterligere IHC-studier gjøres for å farge for T-celler (anti-CD3), infiltrerende monocytt/makrofager (Mac3) og mikroglia (Iba-1/TMEM119) (anbefalte antistoffkloner finnes i tilleggstabell 3). Aktivering av mikroglia reflekteres av en økning i intensiteten av Iba-1-farging på dobbeltmerket Iba-1+TMEM-19+ mikroglia og en økt tilbaketrekning av mikrogliaprosesser som kan vurderes ved Sholl analyse på seksjon32. Videre kan teknikker som flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekvensering brukes til å gjennomføre en dypere karakterisering av frekvensen og fenotypen av immunpopulasjoner i hjernen og ryggmargen.
Telling av SMI-32+ aksoner er en sensitiv metode for å oppdage aksonskade i EAE32,33 og i MS34. SMI-32, som oppdager den ikke-fosforylerte formen av nevrofilament tung eller middels, akkumuleres i endepærer av transekterte nevroner. Et alternativ til å oppdage skadede aksoner er å farge med amyloidforløperprotein (APP) som kan akkumuleres i aksoner som følge av forstyrret aksontransport33. Mønsteret av farging for SMI-32 og APP, selv om begge begge reflekterer aksonskade, overlapper vanligvis ikke, noe som indikerer at de oppdager forskjellige patologier33. Man kan også komplementere histologiske mål på aksonskade ved å måle sNF-L, som er et raskt og sensitivt mål på pågående aksonal skade i både ryggmargen og hjernen. Det gir fordelen at det kan gjøres på en halv dag i levende mus. En ulempe med denne metoden er at settene er dyre og maskinen er svært spesialisert. Selskapet som selger sNF-L-settet tilbyr et gebyr for service for de som ikke har tilgang til en SIMOA-maskin. Et alternativ til å vurdere aksonskade er å skåre for aksontap ved enten å telle aksoner i toluidinblåfargede seksjoner av ryggmargen12 eller telle nevrofilamentbunter påvist av SMI-31 i områder av ryggmargens hvit substans32. Begge disse er mer arbeidskrevende tilnærminger enn SMI-32 eller sNF-L-måling.
Hvis EAEs kliniske skår varierer mellom gruppene, men skår for inflammasjon, demyelinisering og aksonal skade ikke viser forskjeller mellom gruppene, kan det være nyttig å flekke for astrocytaktivering ved bruk av GFAP (se tilleggstabell 3 for anbefalt antistoffklon). Astrocytaktivering er assosiert med en økning i GFAP-farging, og dette har vist seg å korrelere med EAE-progresjon i noen EAE-modeller, inkludert kronisk EAE i DA-rotte35.
Avslutningsvis beskriver denne protokollen metoder og gir en analysearbeidsflyt for å utføre histologisk scoring av EAE.
Disclosures
Shannon Dunn konsulterer for FSD Lucid Psycheceuticals.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Raymond Sobel (Stanford University) for å vise oss sin metode for innbringende og fikse hjerne- og ryggmargsseksjoner. Vi takker Kyle Roberton og Milan Ganguly fra Toronto Centre for Phenogenomics for å lære innebyggingsmetoden og for å kutte så mange av våre hjerne- og ryggmargsseksjoner. Vi takker Dr. Matthew Cussick og Dr. Robert Fujinami (University of Utah) for å dele sine protokoller for å score submeningeal og perivaskulær betennelse i ryggmargen. Vi takker Shalina Ousman for å dele klonen av CD45 antistoff. Vi takker Xiofang Lu for opplæring på vevsprosessoren og vevsinnbyggingsstasjonen og vedlikehold av dette utstyret ved Keenan Research Center of Biomedical Research ved St. Michael's Hospital. Dette arbeidet ble støttet av et biomedisinsk stipend fra MS Canada (til SED). Carmen Ucciferri støttes av et studentskap fra Canadas regjering. Nuria Alvarez-Sanchez støttes av et postdoktorstipend fra Keenan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
| 1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
| 15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
| 500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
| 92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
| 95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
| ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
| Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
| Biosafety Cabinet | Any | ||
| Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
| DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
| ddH2O | - | - | |
| Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
| DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
| Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
| Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
| Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
| Fumehood | Any | ||
| Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
| Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
| Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
| Light microscope | Any | ||
| Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
| Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
| M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
| Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
| Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
| Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
| Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
| Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
| NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
| Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
| Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
| Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
| OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
| p1000 Pipette and Tips | various | ||
| p200 Pipette and Tips | various | ||
| Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
| pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
| Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
| Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
| Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
| Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
| Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
| Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
| Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
| Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
| SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
| Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
| Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
| Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
| Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
| Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
| Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
| Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
| X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
| Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
| Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
| Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
| Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
| Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408--129 | Used to store mouse serum samples |
| Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
| Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |
References
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
- Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144 (2022).
- Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
- Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
- Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836 (2022).
- Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866 (2022).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194 (2019).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
- Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
- Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
- Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431 (2021).
- Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864 (2020).
- Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419 (2021).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
- Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
- Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
- D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439 (2016).
- Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
- Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
- Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425 (2021).
- Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
- Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).
