Summary
Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.
Abstract
De cellulaire functie hangt in belangrijke mate af van het metabolisme, en de functie van de onderliggende metabole netwerken kan worden bestudeerd door intermediairen met kleine moleculen te meten. Het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare metingen van het cellulaire metabolisme, met name in zeldzame celtypen zoals hematopoëtische stamcellen, vereist echter van oudsher het poolen van cellen van meerdere dieren. Een protocol stelt onderzoekers nu in staat om metabolieten in zeldzame celtypen te meten met slechts één muis per monster, terwijl ze meerdere replicaten genereren voor meer voorkomende celtypen. Dit vermindert het aantal dieren dat nodig is voor een bepaald project. Het hier gepresenteerde protocol omvat verschillende belangrijke verschillen ten opzichte van traditionele metabolomics-protocollen, zoals het gebruik van 5 g/L NaCl als omhulselvloeistof, het rechtstreeks sorteren in acetonitril en het gebruik van gerichte kwantificering met rigoureus gebruik van interne normen, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere metingen van het cellulaire metabolisme mogelijk zijn. Ondanks de tijd die nodig is voor het isoleren van afzonderlijke cellen, fluorescerende kleuring en sortering, kan het protocol de verschillen tussen celtypen en medicamenteuze behandelingen voor een groot deel behouden.
Introduction
Metabolisme is een essentieel biologisch proces dat in alle levende cellen voorkomt. Metabolische processen omvatten een uitgebreid netwerk van biochemische reacties die strak worden gereguleerd en met elkaar verbonden zijn, waardoor cellen energie kunnen produceren en essentiële biomoleculen kunnen synthetiseren. Om de functie van metabole netwerken te begrijpen, meten onderzoekers de niveaus van intermediairen van kleine moleculen in cellen. Deze tussenproducten dienen als belangrijke indicatoren van metabole activiteit en kunnen kritische inzichten in de cellulaire functie onthullen.
Massaspectrometrie (MS) is de meest populaire keuze voor de specifieke detectie van metabolieten in complexe monsters 1,2. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) heeft voordelen bij de absolute kwantificering van verbindingen en structuuropheldering, maar MS kan vaak meer componenten oplossen in complexe mengsels zoals biovloeistoffen of celextracten. Vaker wel dan niet, wordt MS gecombineerd met eerdere scheiding van de verbinding door capillaire elektroforese (CE), gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC)3. De keuze van het scheidingsplatform wordt meestal bepaald door het bereik van de doelmetabolieten en het type monster en, in de praktijk, door de beschikbaarheid van machines en expertise. Alle drie de scheidingsplatforms hebben een breed en overlappend scala aan geschikte metabolieten, maar verschillende beperkingen. Kortom, CE kan alleen geladen moleculen scheiden en vereist veel expertise om een robuuste analyse van een groot aantal monsters uit te voeren4. GC is beperkt tot moleculen die klein en apolair genoeg zijn om te verdampen voordat ze uiteenvallen3. Rekening houdend met alle in de handel verkrijgbare LC-kolommen, kunnen twee willekeurige metabolieten door deze technologie worden gescheiden5. Veel LC-methoden vertonen echter minder oplossend vermogen dan CE- of GC-methoden van vergelijkbare lengte.
De typische hoeveelheid uitgangsmateriaal voor metabolomics-metingen ligt meestal in het bereik van 5 x 105 tot 5 x 107 cellen per monster, 5-50 mg nat weefsel of 5-50 μL lichaamsvloeistof6. Het kan echter een uitdaging zijn om dergelijke hoeveelheden uitgangsmateriaal te verkrijgen bij het werken met primaire cellen van zeldzame celtypen, zoals bijvoorbeeld hematopoëtische stamcellen (HSC's) of circulerende tumorcellen. Deze cellen zijn vaak in zeer lage aantallen aanwezig en kunnen niet worden gekweekt zonder kritieke cellulaire kenmerken in gevaar te brengen.
HSC's en multipotente voorlopercellen (MPP's) zijn de minst gedifferentieerde cellen van het hematopoëtische systeem en produceren gedurende het hele leven van een organisme voortdurend nieuwe bloedcellen. De regulatie van hematopoëse is van klinisch belang bij aandoeningen zoals leukemie en bloedarmoede. Ondanks hun belang behoren HSC's en MPP's tot de zeldzaamste cellen binnen het hematopoëtische systeem. Van een enkele muis kunnen doorgaans ongeveer 5000 HSC's worden geïsoleerd 7,8,9. Omdat traditionele metabolomics-methoden meer inputmateriaal vereisen, was het vaak nodig om cellen van meerdere muizen te bundelen om zeldzame celtypen te analyseren10,11.
Hier wilden we een protocol ontwikkelen dat het mogelijk maakt om metabolieten te meten in slechts 5000 cellen per monster om het genereren van metabolomics-gegevens van de HSC's van een enkele muis mogelijk te maken12. Tegelijkertijd maakt deze methode het mogelijk om meerdere replicaten uit een enkele muis te genereren voor meer voorkomende celtypen zoals lymfocyten. Deze aanpak vermindert het aantal dieren dat nodig is voor een bepaald project en draagt zo bij aan de "3R" (vermindering, vervanging, verfijning) van dierproeven.
Metabolieten in cellen kunnen een zeer hoge omloopsnelheid hebben, vaak in de orde van seconden13. Het voorbereiden van monsters voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan echter uren duren, en FACS-sortering zelf kan minuten tot uren duren, wat leidt tot mogelijke veranderingen in het metaboloom als gevolg van niet-fysiologische omstandigheden. Sommige van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt (zoals ammoniumchloride-kalium [ACK] lysisbuffer) kunnen vergelijkbare effecten hebben. Deze omstandigheden kunnen cellulaire stress veroorzaken en de niveaus en verhoudingen van metabolieten in cellen beïnvloeden, wat leidt tot onnauwkeurige of bevooroordeelde metingen van het cellulaire metabolisme 14,15,16. De metabolische veranderingen als gevolg van monstervoorbereiding worden soms sorteerartefacten genoemd. Lange spijsverteringsprotocollen en agressieve reagentia die nodig kunnen zijn om eencellige suspensies te produceren uit harde of taaie weefsels, kunnen dit probleem verergeren. Welke veranderingen kunnen optreden, hangt waarschijnlijk af van het celtype en de verwerkingsconditie. De precieze aard van de veranderingen blijft onbekend, omdat de metabolische toestand van de ongestoorde cellen in het levende weefsel niet kan worden gemeten.
Het hier gepresenteerde protocol omvat een aantal belangrijke verschillen ten opzichte van traditionele methoden, namelijk het gebruik van 5 g/L NaCl als omhulselvloeistof, het rechtstreeks sorteren in de extractiebuffer, het injecteren van grote monstervolumes op hydrofiele interactievloeistofchromatografie-massaspectrometrie (HILIC-MS), en het gebruik van gerichte kwantificering, rigoureus gebruik van interne normen en achtergrondcontroles (Figuur 1). Dit protocol heeft de potentie om verschillen tussen celtypen en tussen medicamenteuze behandeling en mediumcontrole voor een groot deel in stand te houden. Zelfs voor gekweekte cellen steekt het gunstig af bij alternatieve benaderingen, zoals de meer gevestigde centrifugatie en handmatige verwijdering van supernatant. Omdat er echter nog steeds sorteerartefacten kunnen optreden, moeten gegevens met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Ondanks deze beperking betekent het protocol een aanzienlijke verbetering op het gebied van metabole profilering, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere metingen van het cellulaire metabolisme in zeldzame primaire cellen mogelijk zijn.
De mogelijkheid om brede metabole profielen in zeldzame primaire cellen robuust te meten, opent de deur naar nieuwe experimenten in biomedisch onderzoek met deze cellen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat metabolisch gemedieerde regulatie in HSC's van invloed is op het zelfvernieuwingsvermogen van de rustperiode, met implicaties voor bloedarmoede en leukemie11,17. In van de patiënt afkomstige circulerende tumorcellen zijn verschillen in de expressie van metabole genen tussen tumor en aangrenzende cellen aangetoond18,19. Dit protocol stelt onderzoekers nu in staat om deze verschillen systematisch te bestuderen op een metabolisch niveau, dat over het algemeen wordt beschouwd als dichter bij het cellulaire fenotype dan bij genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het fokken en houden van alle muizen die voor dit protocol werden gebruikt, werd uitgevoerd in een conventionele dierenfaciliteit in het Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica (MPI-IE) volgens de voorschriften van de lokale autoriteiten (Regierungspräsidium Freiburg). Muizen werden geëuthanaseerd met CO2 en cervicale dislocatie door FELASA B-opgeleid personeel volgens richtlijnen en voorschriften die zijn goedgekeurd door de dierenwelzijnscommissie van de MPI-IE en de lokale autoriteiten. Er werden geen dierproeven uitgevoerd en muizen hadden geen last van hun gezondheid.
OPMERKING: Zeer gevoelige analysemethoden, zoals de LC-MS-methode die in dit protocol wordt gebruikt, hebben het potentieel om zelfs zeer kleine verontreinigingen in het monster te detecteren. Daarom is het van het grootste belang om dergelijke besmettingen tot een minimum te beperken. De allerbelangrijkste maatregel is om schone handschoenen te dragen wanneer u iets aanraakt dat in contact komt met de monsters. Dit omvat bijvoorbeeld de bereiding van buffers en mantelvloeistof, het labelen van monsterbuisjes en het reinigen van laboratoriumapparatuur. Bovendien moet waar mogelijk gebruik worden gemaakt van laboratoriumartikelen voor eenmalig gebruik. Glaswerk moet voor gebruik worden gespoeld met oplosmiddelen van LC-MS-kwaliteit. Een schone werkomgeving helpt verder om verontreinigingen te verminderen.
1. Algemene voorbereidingen
- Bereid interne standaardvoorraadoplossing: Bereid 6 mg/ml chloorfenylalanine (CLF) en 6 mg/ml aminotereftaalzuur (ATA) in 30% v/v 2-propanol in ultrapuur water.
- Bereid FACS-resuspensiebuffer voor: Voeg 0,9 g NaCl, 99,5 ml ultrapuur water en 0,5 ml interne standaardvoorraadoplossing toe. Koel af tot 4 °C.
- Bereid omhulselvloeistof voor: Los in een omhulselvloeistoftank 30 g NaCl op in 6 L gedeïoniseerd water en sluit het aan op een celsorteerder.
OPMERKING: De concentratie van NaCl in de mantelvloeistof is geoptimaliseerd om afbuiging van druppels in de sorteerder mogelijk te maken die net zo robuust is als bij gebruik van PBS als omhulsvloeistof en tegelijkertijd om negatieve effecten op de detectie van metabolieten door LC-MS12 te minimaliseren. Lagere concentraties NaCl zijn voordelig voor de detectie van metabolieten, maar belemmeren de robuuste sortering van cellen.
2. Isolatie van B- en T-cellen uit de milt
- Koel 90 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per muis voor in de koelkast of op ijs tot 4 °C. Koel een centrifuge voor op 4 °C.
- Isolatie van milten
OPMERKING: Het is van het grootste belang om snel, op ijs en met koude (4 °C) buffers te werken tijdens celisolatie en de volgende kleuringsstappen. Anders kan het metabolische profiel van cellen aanzienlijk veranderen.- Bereid 1,5 ml PBS in een reactiebuisje van 2 ml op ijs.
- Euthanaseer een C57BL6/J-muis volgens de richtlijnen en methoden die zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten.
- Steriliseer bont met 70% ethanol.
- Open de buik met een schaar en verwijder de milt met een fijne pincet zonder het orgaan te scheuren. Plaats de milt onmiddellijk in koude PBS (4 °C).
- Genereren van een eencellige suspensie
- Plaats een celzeef van 70 μm op een centrifugebuis van 50 ml en bevochtig deze met PBS. Haal de milt door het gaas met behulp van de duimsteun van een zuiger van de spuit en 30 ml koude PBS (4 °C)
- Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml ACK lysisbuffer en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT; 20 °C).
- Voeg 50 ml koude PBS (4 °C) toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg.
- FACS-kleuring
- Bereid de antilichaamcocktail in 500 μL koude PBS (4 °C) per muis: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Resuspendeer de celpellet in de antilichaamcocktail. Breng over naar een FACS-buis van 5 ml. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 3 ml koude PBS (4 °C) toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml koude FACS-resuspensiebuffer (4 °C). Filtreer de cellen door een FACS-buis met filterdop. Cellen zijn klaar voor sortering op basis van flowcytometrie.
3. Isolatie van HSC's en MPP's uit het beenmerg
- Ontleed en isoleer het beenmerg.
OPMERKING: Het is van het grootste belang om snel te werken en geïsoleerde botten en de cellen koud (4 °C) te houden tijdens de hele procedure om nauwkeurige resultaten mogelijk te maken. Om achtergrondsignalen tot een minimum te beperken, moet u bovendien werken en een schone ruimte en laboratoriumapparatuur gebruiken.- Euthanaseer muizen volgens richtlijnen en methoden die zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten.
- Spuit 70% ethanol op het onderste deel van de muizen.
- Ontleed de benen en de stekels met een schaar. Maak een incisie op de rug en verleng de snee rond naar de buik. Schil de huid van de achterpoten.
- Scheur of snijd de achterpoten eraf en zorg ervoor dat de benen het scheenbeen, het dijbeen en het heupgewricht bevatten.
- Pak de schaar en knip ze dicht langs de ruggengraat totdat ze volledig zijn verwijderd.
- Verdeel de poten en stekels over borden met 6 putjes die koude PBS (4 °C) bevatten en bewaar de platen op ijs.
- Reinig het dijbeen, het scheenbeen, het heupgewricht en de wervels van zacht weefsel met een scalpel en een schaar.
- Plet de schoongemaakte botten met een vijzel en stamper in 5 ml koude PBS (4 °C).
- Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 40 μm in een buisje van 50 ml.
- Herhaal stap 3.1.8-3.1.9 totdat de botten helemaal wit lijken.
- Lysis van erytrocyten:
- Centrifugeer de geoogste celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml koude ACK-buffer (4 °C). Incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Voeg koude PBS (4 °C) toe om de reactie te stoppen (optioneel).
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Uitputting van de afstamming:
OPMERKING: Ter verrijking van afstammingsnegatieve (Lin-) cellen werd een negatieve selectiekit voor CD4-cellen gebruikt.- Bereid de magnetische kralen voor:
- Voeg 500 μL parels toe aan microcentrifugebuisjes van 2 ml. Plaats de buizen op een magneet en gooi het supernatant weg.
- Was de korrels met 1 ml koud PBS (4 °C) en gooi het supernatant weg.
- Voeg 500 μL koude PBS (4 °C) toe en houd de parels koud (4 °C).
- Incubeer de cellen met 500 μL afstammingscocktail (50 μL antilichaam geleverd door de kit + 450 μL PBS) gedurende 25 minuten (schudden, 4 °C) in het donker.
- Was de cellen met koud PBS (4 °C).
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de cellen in 1000 μL koude PBS (4 °C) en breng de celsuspensie over in de pareloplossing.
- Incubeer gedurende 15 minuten op een roterend wiel bij 4 °C.
- Plaats de buisjes op een magneet en wacht tot de oplossing helder is. Breng het supernatans over in een verse FACS-buis.
- Was de kralen met 500 μL PBS.
- Plaats de buisjes op een magneet en wacht tot de oplossing helder is.
- Breng het supernatans over in de verse FACS-buis.
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Bereid de magnetische kralen voor:
- Kleuring voor FACS
- Bereid 300 μl antilichaammix per muis in koude PBS (4 °C).
- Antilichaammix voor stam-/voorlopercellen: HSC's: CD4 (1:1000) / CD8a (1:1000) / B220 (1:1000) / Ter119 (1:500) / Gr-1 (1:1000) / CD11b - PeCy7 (1:1000), c-Kit - PE (1:1000), Sca1 - APC-Cy7 (1:500), CD48 - BV421 (1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
- Incubeer de cellen gedurende 40 minuten in het donker bij 4 °C.
- Wassen met 1 ml koud PBS (4 °C). Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml FACS-resuspensiebuffer en filtreer de cellen door een FACS-buis met filterdop.
4. FACS-sortering
- Stel de celsorteerder in.
- Plaats de mondstukpunt van 70 μm. Activeer lasers van 405 nm, 488 nm, 561 nm en 633 nm.
- Stel de sorteermodus in op 4-weg Zuiverheid: opbrengstmasker 0, zuiverheidsmasker 32, fasemasker 0
- Stel de valfrequentie in op 90.400 Hz en pas de amplitude en druppelvertraging aan volgens de instructies van de fabrikant. Stel de plaatspanning in op 5000 V.
- Definieer sorteerpoorten volgens de instructies van de fabrikant.
- Selecteer voor alle celtypen eerst afzonderlijke cellen op basis van voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing, gevolgd door selectie op basis van celtypespecifieke kleuring.
- Selecteer voor B-cellen de AF647-positieve, PE-negatieve populatie.
- Selecteer voor T-cellen de PE-positieve, AF647-negatieve populatie.
- Selecteer voor HSC's de PE-Cy7-lage, PE-positieve, APC-Cy7-positieve, BV605-positieve, BV421-negatieve populatie.
- Selecteer voor MPP's de PE-Cy7-lage, PE-positieve, APC-Cy7-positieve, BV421-positieve, BV605-negatieve, populatie.
- Selecteer voor puinmonsters gebeurtenissen die te klein zijn om intacte cellen weer te geven op basis van voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing. Typische FACS-plots die deze poortstrategieën laten zien, worden weergegeven in figuur 2 en figuur 3.
- Pas het debiet aan om minder dan 15.000 gebeurtenissen/s te verkrijgen.
- Opvangplaat voorbereiden
- Bereid gistextractbouillonoplossing voor: Resuspendeer 1 aliquot van 13C gistextract in 7,5 ml ultrazuivere H2O en 2,5 ml methanol.
- Bereid de extractiebuffer voor: Voeg 10 μL 13C gistextractoplossing toe aan 10 ml acetonitril en meng.
- Verzamelplaat voorbereiden: Voeg 25 μL van de extractiebuffer toe aan elk putje van een PCR-plaat met 96 putjes die zal worden gebruikt om het monster te verzamelen. Om verdamping tot een minimum te beperken, bedek je de putjes met PCR-deksels (strepen die in singlets zijn gesneden).
- Voer de celsortering uit.
- Open de opvangputten indien nodig om gesorteerde cellen te verzamelen en sluit ze zo snel mogelijk om verdamping tot een minimum te beperken.
- Als de monsters niet onmiddellijk kunnen worden gemeten, bewaar ze dan enkele dagen in afgesloten containers bij -80 °C. Soneer de monsters na het ontdooien gedurende 5 minuten om volledige resuspensie van metabolieten te garanderen.
5. LC-QQQ-MS-meting
- Bereid LC-oplosmiddelen voor
- Bereid medroninezuurbouillonoplossing (100 mM): Los 17,6 mg medroninezuur op in 1 ml ultrapuur H2O.
- Buffer A bereiden: Los 1,92 g ammoniumcarbonaat op in 1 l ultrazuivere H2O en voeg 50 μl medroninezuurbouillonoplossing toe.
- Buffer B voorbereiden: Meng 50 ml buffer met 450 ml acetonitril.
- Bereid LC-testmix voor: Meng elk 1 ppm leucine, isoleucine, AMP, ADP en ATP in 80:20 acetonitril: ultrapuur H2O.
OPMERKING: Medroninezuurbouillon kan enkele maanden bij -20 °C worden bewaard; andere buffers kunnen 2 dagen bij RT worden bewaard.
- Programma LC-QQQ-MS methode
- Optimaliseer compound-specifieke MS-instellingen (bijv. botsingsenergie) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik voor instrumenten uit de Agilent 6495-serie de instellingen in aanvullende tabel 1.
- Optimaliseer bronspecifieke MS-instellingen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik voor instrumenten met JetStream verwarmde ESI-bron de volgende parameters: gastemperatuur: 240 °C, gasstroom: 15 L/min, vernevelaar: 50 psi, mantelgastemperatuur: 400 °C, mantelgasstroom: 11 L/min, capillaire spanning: 2000 V, sproeierspanning: 300 V.
- Optimaliseer de instellingen van ionenoverdrachtsoptiek volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik voor Agilent instrumenten met iFunnel ionenoptiek de volgende parameters: hoge druk RF positief: 110 V, hoge druk RF negatief: 90 V, lage druk RF positief: 80 V, lage druk RF negatief: 60 V.
- Programmeer de LC-gradiënt: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μL/min; Stoptijd 28 min. Kolomtemperatuur: 35 °C.
- LC-MS-instrument instellen.
- Sluit de chromatografische kolom aan op het kolomcompartiment met temperatuurregeling.
- Sluit de buffers aan en verwijder alle lijnen.
- Voer ten minste 4 blanco monsters of poolvoorbeelden uit om de kolom in evenwicht te brengen.
- Voer de LC-testmix uit om de chromatografische prestaties te controleren. Zorg ervoor dat aan de volgende criteria wordt voldaan. Als dit niet het geval is, reinigt u het instrument of lost u problemen op voordat u de monsters uitvoert.
- Controleer of de aanvangstegendruk <150 bar is en de maximale tegendruk <400 bar.
- Controleer of de retentietijden zich in een venster van ±1 min als volgt bevinden: isoleucine 6,0 min, leucine 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min en ATP 12,7 min.
- Zorg ervoor dat de vallei tussen leucine en isoleucine in de overgang +132->86 < 20 % van de piekhoogte ligt.
- Zorg ervoor dat het verschil in retentietijd AMP naar ADP 1.5 tot 1.9 min is en het verschil in retentietijd ADP naar ATP 1.1 tot 1.9 min.
- Werklijst instellen
- Begin met een blanco monster om de overdracht van de LC-testmix tot een minimum te beperken.
- Voer de steekproeven in willekeurige volgorde uit.
- Eindig met een blanco monster om de kolom schoon te maken voor toekomstige experimenten.
6. Voorbewerking van gegevens in automRm
OPMERKING: In de volgende stappen worden de conversie van .d naar .mzML in msconvert, de voorbereiding van metabdb, het laden van gegevens en modellen en metabdb en algemene strategieën voor handmatige piekbeoordeling besproken.
- Converteer onbewerkte gegevens van .d-formaat naar .mzML-formaat met behulp van ProteoWizard20 met de volgende instellingen: binaire coderingsprecisie: 32-bits, MS-niveaus 1-2, Schrijfindex geselecteerd, Zlib-compressie gebruiken geselecteerd.
- Start R.
- Installeer automRm21 volgens de documentatie van de verpakking (slechts één keer nodig voor het eerste gebruik).
- Start automRm GUI in R: automRm::automrm_gui()
- Verwerk de batch .d-bestanden in het tabblad Verwerken > Batch verwerken.
- Selecteer .xlsx bestand met metabolietinformatie. Dit bestand moet overeenkomen met de LC-QQQ-MS-methode.
- Selecteren. RData-bestand met ML-model voor piekpicking.
- Selecteren. RData-bestand met het ML-model voor piekrapportage.
- Selecteer de projectmap met .mzML-bestanden.
- Start de voorverwerking van gegevens door op Batch verwerken te klikken.
- Nadat de voorbewerking is voltooid, opent u peakoverview.pdf om de juiste detectie van chromatografische pieken te controleren. Laad eventueel de automRmdata_Review.RData vanaf het tabblad Controleren van de automRm GUI om piekfiltering en piekintegratie handmatig te wijzigen.
- Open de peakinfo.xlsx uit de projectmap en controleer de gegevens.
- Controleer het interne standaardsignaal van 13C in het tabblad 13CArea: Zorg ervoor dat er geen systematische verschillen zijn in de intensiteitswaarden tussen experimentele groepen en tussen celmonsters en puinmonsters. Als dergelijke verschillen bestaan, gebruik dan alleen gegevens van de tabbladen NormArea of NormHeight voor latere analyse; Gebruik anders gegevens van de tabbladen RawArea of RawHeight.
- Controleer de signaalintensiteit van de interne standaarden ATA en CLF in het tabblad RawArea. Zorg ervoor dat er geen systematische verschillen zijn in de intensiteit van beide verbindingen tussen experimentele groepen.
- Vergelijk voor elke metaboliet de signaalintensiteit van monsters die cellen bevatten met de puinmonsters van dezelfde celsuspensie. Gebruik een geschikte statistische test om metabolieten te identificeren waarin monsters die cellen bevatten een hogere intensiteit hebben dan puinmonsters. Neem alleen metabolieten op die deze test doorstaan in de daaropvolgende gegevensanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-sortering maakt het mogelijk om schone populaties van verschillende celtypen uit dezelfde celsuspensie te isoleren (Figuur 2 en Figuur 3). De specificiteit van deze methode berust op de kleuring van de verschillende celtypen met specifieke oppervlaktemarkers (bijvoorbeeld B-cellen en T-cellen uit de milt) of specifieke combinaties van oppervlaktemarkers (bijvoorbeeld HSC's en MPP's). Kleuring van intracellulaire markers vereist doorgaans permeabilisatie van het celmembraan. Dit kan lekkage van metabolieten veroorzaken en daarom is dit type kleuring niet geschikt om in dit protocol te worden gebruikt.
LC zorgt voor de scheiding van metabolieten voorafgaand aan detectie door MS (Figuur 4). Metabolieten elueren uit de HILIC-kolom ongeveer gesorteerd op polariteit, waarbij minder polaire verbindingen vroeg elueren en meer polaire metabolieten later elueren. De signaalintensiteit wordt bepaald door de hoeveelheid van een doelmetaboliet in het monster en een metabolietspecifieke responsfactor. Bijgevolg kunnen signaalintensiteiten niet zinvol worden vergeleken tussen metabolieten, maar alleen voor één metaboliet tussen monsters. De 3 pieken die in figuur 4 worden gemarkeerd, vertegenwoordigen 1: niacinamide wordt gedetecteerd in zowel puin als celextract, zij het op verschillende niveaus, 2: acetyl-carnitine dat bijna uitsluitend wordt gedetecteerd in celextracten, en 3: het interne standaard aminoterefataalzuur dat op hetzelfde niveau wordt gedetecteerd in puinmonsters en celextracten.
Metabole verschillen tussen celtypen uit hetzelfde weefsel worden bewaard met behulp van het gecombineerde FACS-LC-MS-protocol (Figuur 5). Voor HSC's en MPP's waren cellen van 6 muizen nodig om 6 monsters te genereren, wat leidde tot een grotere variabiliteit binnen elke groep in vergelijking met B-cellen en T-cellen, die uit dezelfde milt van muizen werden gesorteerd. Puinmonsters die blanco controlemonsters vertegenwoordigen, zijn duidelijk gescheiden van monsters die celextracten bevatten. Binnen de puinmonsters is een duidelijke scheiding van de twee experimenten zichtbaar, wat het verschil in metabolische omgeving benadrukt dat de cellen ervaren voorafgaand aan het sorteren. Wanneer weergegeven in een geclusterde heatmap (Figuur 6), wordt aanvullende informatie zichtbaar, zoals de relatieve niveaus van metabolieten in monsters.
Figuur 1: Overzicht van de belangrijkste stappen van het gepresenteerde protocol. Deze figuur is overgenomen met toestemming van Schönberger et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van zuivere populaties van B-cellen en T-cellen uit de milt. Cellen en puingebeurtenissen werden geselecteerd op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) signalen. B-cellen en T-cellen werden geselecteerd op basis van celtype-specifieke kleuringssignalen. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Schönberger et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Isolatie van HSC en MPP uit het beenmerg. Cellen en puingebeurtenissen werden geselecteerd op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) signalen. HSC- en MPP-populaties werden geselecteerd op basis van meerdere stadia van celtype-specifieke kleuringssignalen. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Schönberger et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld chromatogrammen. Monsters met (A) 5000 HSC's en (B) 5000 puingebeurtenissen van dezelfde soort. Merk op dat de as in beide deelvensters dezelfde schaal heeft. Gemarkeerde metabolieten zijn 1: nicotinamide, 2: acetyl-carnitine, 3: aminotereftaalzuur (ATA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Principal component analysis (PCA) van metabole profielen van verschillende celtypen en achtergrondmonsters van puin uit dezelfde experimenten. Er wordt een grote scheiding waargenomen tussen de verschillende organen en achtergrondmonsters van puin van elk orgaan. Bovendien zijn celtypen duidelijk gescheiden binnen de cellen van elk orgaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Heatmap met metabolieten gemeten in verschillende celtypen en overeenkomende achtergrondcontrolemonsters (puin). Ontbrekende waarden werden toegerekend met de half-minimumwaarde van dezelfde metaboliet voor alle monsters. Voor het plotten werden de gegevens in elke rij afzonderlijk genormaliseerd tot het maximum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: De tabel geeft een overzicht van de samenstellingsspecifieke instellingen voor de geselecteerde metabolieten, waaronder retentietijd (RT), polariteit (Pol), voorloper m/z (Q1), fragment m/z (Q3) en botsingsenergie (CE). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle implementatie van gerichte metabolomics met behulp van dit protocol zijn 1) een robuuste kleurings- en gatingstrategie die schone celpopulaties zal opleveren 2) nauwkeurige behandeling van vloeistofvolumes, 3) reproduceerbare timing van alle experimentele stappen, in het bijzonder alle stappen voorafgaand aan metabolietextractie. Idealiter zouden alle monsters die tot één experiment behoren, in één batch moeten worden verwerkt en gemeten om batcheffecten te minimaliseren22. Voor grotere experimenten raden we aan om celextracten te verzamelen bij -80 °C en vervolgens alle extracten in één batch te meten.
Bij het werken met monsters met een lage input moet de nadruk worden gelegd op een schone omgang met alle materialen die in de loop van de experimenten worden gebruikt23. Veel voorkomende verontreinigingen zijn restbuffer, wasmiddelen en huidverzorgingsproducten. De belangrijkste maatregel om besmetting tot een minimum te beperken, is het gebruik van geschikte handschoenen tijdens het experiment.
Om mogelijke veranderingen in de samenstelling van de metabolieten als gevolg van blootstelling van cellen aan onfysiologische omstandigheden tot een minimum te beperken, is het van cruciaal belang om de monsters op ijs en met koude reagentia (4 °C) te bereiden. Ook zal het zo snel mogelijk zijn voor de FACS-stap de kwaliteit van de metingverhogen 2. De aangegeven tijden voor antilichaamkleuring zijn zo kort als redelijk voor een goede kleuringsefficiëntie. Een extra stap om de niet-specifieke binding van antilichamen aan Fc-receptoren te blokkeren met behulp van Fc-blokantilichamen zou kunnen worden toegevoegd vóór de FACS-kleuringsprocedure24,25. Dit voorkomt besmetting van de doelcelpopulaties en is vooral aan te raden bij het werken met celsuspensies die veel Fc-receptor hoge celtypen bevatten (zoals monocyten of macrofagen) of cellen die zonder serum zijn gekweekt. Het zal echter de totale verwerkingstijd met 10-15 minuten verlengen en kan daarom extra niet-fysiologische variabiliteit aan de resultaten toevoegen.
Met behulp van dynamische MRM-methoden op moderne massaspectrometers kunnen alle metabolieten die in de samenstellingsspecifieke instellingen worden vermeld, met een enkele injectie worden geregistreerd. Door het aantal doelmetabolieten te beperken, kan het beschreven protocol op oudere massaspectrometers worden geïmplementeerd en worden de voorverwerking en analyse van gegevens versneld.
Een bepaald niveau van achtergrondsignaal in de LC-MS-gegevens is onvermijdelijk. Daarom moet grote zorg worden besteed aan het identificeren van die metabolieten die boven de achtergrond kunnen worden gedetecteerd. Het sorteren van gebeurtenissen die te klein zijn om intacte cellen (puin) weer te geven, genereert relevante blanco procesmonsters die matrixafhankelijke achtergrondsignaalintensiteiten vertegenwoordigen. Bovendien maken interne normen het mogelijk om problematische monsters te identificeren die moeten worden uitgesloten van verdere gegevensanalyse26. Beide kwaliteitsborgingsmaatregelen werken het beste als er een voldoende groot aantal replicaten beschikbaar is. We raden aan om ten minste zes replicaten per groep te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs willen de dierenfaciliteit van het Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica bedanken voor het leveren van de dieren die in deze studie zijn gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
