Summary
Здесь мы представляем протокол для точного и надежного измерения метаболитов в редких типах клеток. Технические усовершенствования, в том числе модифицированная жидкость оболочки для сортировки клеток и генерация соответствующих пустых образцов, позволяют проводить всестороннюю количественную оценку метаболитов с вводом всего 5000 клеток на образец.
Abstract
Клеточная функция критически зависит от метаболизма, и функцию лежащих в ее основе метаболических сетей можно изучить, измеряя низкомолекулярные промежуточные продукты. Тем не менее, получение точных и надежных измерений клеточного метаболизма, особенно в редких типах клеток, таких как гемопоэтические стволовые клетки, традиционно требовало объединения клеток нескольких животных. Теперь протокол позволяет исследователям измерять метаболиты в редких типах клеток, используя только одну мышь на образец, создавая при этом несколько репликаций для более распространенных типов клеток. Это уменьшает количество животных, которые требуются для данного проекта. Протокол, представленный здесь, имеет несколько ключевых отличий от традиционных протоколов метаболомики, таких как использование 5 г/л NaCl в качестве жидкости оболочки, сортировка непосредственно в ацетонитрил и использование целевого количественного определения со строгим использованием внутренних стандартов, что позволяет проводить более точные и всесторонние измерения клеточного метаболизма. Несмотря на время, необходимое для выделения отдельных клеток, флуоресцентного окрашивания и сортировки, протокол может в значительной степени сохранить различия между типами клеток и лекарственными препаратами.
Introduction
Метаболизм – это важнейший биологический процесс, происходящий во всех живых клетках. Метаболические процессы включают в себя обширную сеть биохимических реакций, которые жестко регулируются и взаимосвязаны, позволяя клеткам вырабатывать энергию и синтезировать необходимыебиомолекулы. Чтобы понять функцию метаболических сетей, исследователи измеряют уровни низкомолекулярных промежуточных продуктов в клетках. Эти промежуточные продукты служат важными индикаторами метаболической активности и могут дать важную информацию о клеточной функции.
Масс-спектрометрия (МС) является наиболее популярным выбором для специфического обнаружения метаболитов в сложных образцах 1,2. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) имеет преимущества в абсолютном количественном определении соединений и выяснении структуры, но МС часто позволяет разрешать большее количество компонентов в сложных смесях, таких как биожидкости или клеточные экстракты. Чаще всего РС сочетается с предварительным разделением соединения с помощью капиллярного электрофореза (КЭ), газовой хроматографии (ГХ) или жидкостной хроматографии (ЖХ)3. Выбор платформы сепарации в основном определяется диапазоном целевых метаболитов и типом образца, а в реальных условиях — доступностью оборудования и опыта. Все три сепарационные платформы имеют широкий и перекрывающийся диапазон подходящих метаболитов, но различные ограничения. Короче говоря, КЭ может разделять только заряженные молекулы и требует большого опыта для осуществления надежного анализа большого количества образцов4. ГХ ограничен молекулами, которые достаточно малы и аполярны, чтобы испариться перед разложением3. Учитывая все коммерчески доступные колонки LC, любые два метаболита могут быть разделены с помощью этой технологии5. Тем не менее, многие методы LC обладают меньшей разрешающей способностью, чем методы CE или GC аналогичной длины.
Типичное количество исходного материала для метаболомных измерений обычно находится в диапазоне от 5 x 105 до 5 x 107 клеток на образец, 5-50 мг влажной ткани или 5-50 мкл биологической жидкости6. Однако при работе с первичными клетками редких типов клеток, таких как, например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) или циркулирующие опухолевые клетки, может быть сложно получить такое количество исходного материала. Эти клетки часто присутствуют в очень малых количествах и не могут быть культивированы без ущерба для критически важных клеточных характеристик.
ГСК и мультипотентные клетки-предшественники (MPP) являются наименее дифференцированными клетками кроветворной системы и непрерывно производят новые клетки крови на протяжении всей жизни организма. Регуляция кроветворения имеет клиническое значение при таких состояниях, как лейкемия и анемия. Несмотря на свою важность, ГСК и МПП являются одними из самых редких клеток в кроветворной системе. От одной мыши, как правило, можно выделить около 5000 ГСК 7,8,9. Поскольку традиционные методы метаболомики требуют большего количества входного материала, для анализа редких типов клеток10,11 часто приходилось объединять клетки нескольких мышей.
Здесь мы стремились разработать протокол, который позволяет измерять метаболиты всего в 5000 клетках на образец, чтобы обеспечить генерацию метаболомных данных из ГСК одной мыши12. В то же время этот метод позволяет генерировать несколько репликаций из одной мыши для более распространенных типов клеток, таких как лимфоциты. Такой подход уменьшает количество животных, необходимых для данного проекта, тем самым способствуя «3R» (сокращение, замена, уточнение) экспериментов на животных.
Метаболиты в клетках могут иметь очень высокую скорость оборота, часто порядка13 секунд. Тем не менее, подготовка образцов для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) может занять несколько часов, а сама сортировка FACS может занять от нескольких минут до нескольких часов, что приводит к потенциальным изменениям в метаболоме из-за нефизиологических условий. Некоторые из реагентов, используемых в этом протоколе (например, лизисный буфер аммония-хлорида-калия [ACK]), могут иметь аналогичные эффекты. Эти условия могут вызывать клеточный стресс и влиять на уровни и соотношение метаболитов в клетках, что приводит к неточным или смещенным измерениям клеточного метаболизма 14,15,16. Метаболические изменения, вызванные пробоподготовкой, иногда называют артефактами сортировки. Длительные протоколы пищеварения и жесткие реагенты, которые могут потребоваться для получения одноклеточной суспензии из твердых или жестких тканей, могут усугубить эту проблему. Какие изменения могут произойти, скорее всего, зависит от типа клетки и условий обработки. Точная природа изменений остается неизвестной, так как метаболическое состояние ненарушенных клеток в живой ткани не может быть измерено.
Представленный здесь протокол включает в себя несколько ключевых отличий по сравнению с традиционными методами, а именно: использование 5 г/л NaCl в качестве жидкости оболочки, сортировка непосредственно в буфер экстракции, введение больших объемов образцов для жидкостной хромато-масс-спектрометрии с гидрофильным взаимодействием (HILIC-MS) и использование целевого количественного определения, строгое использование внутренних стандартов и фонового контроля (рис. 1). Этот протокол обладает потенциалом для сохранения различий между типами клеток, а также между лекарственным лечением и контролем транспортных средств в значительной степени12. Даже для культивируемых клеток он выгодно отличается от альтернативных подходов, таких как более традиционное центрифугирование и ручное удаление надосадочной жидкости. Однако, поскольку артефакты сортировки все еще могут возникать, данные следует интерпретировать с осторожностью. Несмотря на это ограничение, протокол представляет собой значительное улучшение в области метаболического профилирования, позволяя проводить более точные и всесторонние измерения клеточного метаболизма в редких первичных клетках12.
Возможность надежно измерять широкие метаболические профили в редких первичных клетках открывает дверь для новых экспериментов в биомедицинских исследованиях с участием этих клеток. Например, было показано, что метаболически опосредованная регуляция в ГСК влияет на способность к самообновлению в состоянии покоя, что имеет значение для анемии и лейкемии11,17. В циркулирующих опухолевых клетках, полученных от пациентов, были показаны различия в экспрессии метаболических генов между опухолью и соседними клетками18,19. Этот протокол теперь позволяет исследователям систематически изучать эти различия на метаболическом уровне, который обычно рассматривается как более близкий к клеточному фенотипу, чем экспрессия генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Разведение и содержание всех мышей, использованных для этого протокола, проводилось в обычном животноводческом помещении в Институте иммунобиологии и эпигенетики Макса Планка (MPI-IE) в соответствии с правилами местных властей (Regierungspräsidium Freiburg). Мышей усыпляли с помощьюСО2 и вывиха шейки матки персоналом, прошедшим обучение по программе FELASA B, в соответствии с руководящими принципами и правилами, утвержденными комитетом по защите животных MPI-IE и местными властями. Никаких экспериментов на животных не проводилось, и у мышей не было проблем со здоровьем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокочувствительные аналитические методы, такие как метод ЖХ-МС, используемый в этом протоколе, могут обнаруживать даже очень незначительные загрязнения в образце. Поэтому крайне важно свести к минимуму такие загрязнения. Самой важной мерой является надевание чистых перчаток при прикосновении к чему-либо, контактирующему с образцами. Это включает, например, приготовление буферов и жидкости для оболочки, маркировку пробирок для образцов и очистку лабораторного оборудования. Кроме того, по возможности следует использовать одноразовую лабораторную посуду. Перед использованием стеклянную посуду следует промыть растворителями марки LC-MS. Чистая рабочая среда также помогает снизить загрязнение.
1. Общие приготовления
- Приготовьте внутренний стандартный исходный раствор: Приготовьте 6 мг/мл хлорфенилаланина (CLF) и 6 мг/мл аминотерефталевой кислоты (ATA) в 30% v/v 2-пропанола в сверхчистой воде.
- Приготовьте буфер для ресуспензии FACS: добавьте 0,9 г NaCl, 99,5 мл сверхчистой воды и 0,5 мл внутреннего стандартного исходного раствора. Предварительно охладить до 4 °C.
- Приготовьте жидкость для оболочки: В резервуаре для жидкости для оболочки растворите 30 г NaCl в 6 л деионизированной воды и подключите к сортировщику клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NaCl в оболочечной жидкости была оптимизирована таким образом, чтобы обеспечить отклонение капель в сортировщике, что является таким же прочным, как при использовании PBS в качестве жидкости оболочки, и одновременно свести к минимуму негативное влияние на обнаружение метаболитов с помощью LC-MS12. Более низкие концентрации NaCl полезны для обнаружения метаболитов, но ухудшают надежную сортировку клеток.
2. Выделение В- и Т-клеток из селезенки
- Предварительно охладите 90 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) на мышь в холодильнике или на льду до 4 °C. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C.
- Изоляция селезенки
ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее важно работать быстро, на льду и с холодными (4 °C) буферами во время изоляции клеток и последующих этапов окрашивания. В противном случае метаболический профиль клеток может значительно измениться.- Приготовьте 1,5 мл PBS в реакционной пробирке объемом 2 мл на льду.
- Усыпите мышь C57BL6/J в соответствии с рекомендациями и методами, утвержденными местными властями.
- Стерилизовать мех 70% этиловым спиртом.
- Вскрыть брюшную полость ножницами и удалить селезенку с помощью тонких щипцов, не разрывая орган. Немедленно поместите селезенку в холодную ПБС (4 °C).
- Генерация одноклеточной суспензии
- Поместите ситечко с ячейками 70 мкм на центрифужную пробирку объемом 50 мл и смочите ее PBS. Пропустите селезенку через сетку с помощью большого пальца поршня шприца и 30 мл холодного PBS (4 °C)
- Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера для лизиса ACK и инкубируйте в течение 2 минут при комнатной температуре (RT; 20 °C).
- Добавьте 50 мл холодного PBS (4 °C). Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
- Окрашивание FACS
- Приготовьте коктейль антител в 500 мкл холодного PBS (4 °C) на мышь: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в коктейле антител. Переложите в пробирку FACS объемом 5 мл. Выдерживать 30 мин при температуре 4 °С в темноте.
- Добавьте 3 мл холодного PBS (4 °C). Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендант клеточной гранулы в 1 мл холодного буфера для ресуспензии FACS (4 °C). Отфильтруйте ячейки через фильтр-колпачок трубки FACS. Клетки готовы к сортировке методом проточной цитометрии.
3. Выделение ГСК и МПП из костного мозга
- Препарируют и изолируют костный мозг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно работать быстро и поддерживать изолированные кости и клетки в холодном состоянии (4 °C) в течение всей процедуры, чтобы обеспечить точные результаты. Кроме того, чтобы свести к минимуму фоновые сигналы, работайте и используйте чистое помещение и лабораторное оборудование.- Усыпляйте мышей в соответствии с рекомендациями и методами, одобренными местными властями.
- Распылите 70% этанола на нижнюю часть мышей.
- Рассеките ножки и позвоночник с помощью ножниц. Сделайте надрез на спине и распространите разрез вокруг живота. Снимите кожу с задних конечностей.
- Оторвите или отрежьте задние конечности и убедитесь, что ноги содержат большеберцовую кость, бедренную кость и тазобедренный сустав.
- Возьмите ножницы и обрежьте их вдоль корешка до полного удаления.
- Распределите ножки и позвоночники по 6-луночным тарелкам, содержащим холодный PBS (4 °C), и держите пластины на льду.
- Очистите бедренную, большеберцовую кость, тазобедренный сустав и позвонки от мягких тканей с помощью скальпеля и ножниц.
- Очищенные косточки измельчить в ступке с пестиком в 5 мл холодного ПБС (4 °C).
- Отфильтруйте клеточную суспензию через ситечко 40 мкм в пробирку объемом 50 мл.
- Повторяйте шаги 3.1.8-3.1.9 до тех пор, пока кости не станут полностью белыми.
- Лизис эритроцитов:
- Центрифугируют собранную клеточную суспензию при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбрасывают надосадочную жидкость.
- Ресуспендант клеточной гранулы в 1 мл холодного буфера ACK (4 °C). Выдерживать 5 минут на льду.
- Добавьте холодный PBS (4 °C), чтобы остановить реакцию (опционально).
- Центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
- Истощение родословной:
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обогащения линейных отрицательных (Lin-) клеток использовали набор для отрицательного отбора CD4-клеток.- Подготовьте магнитные шарики:
- Добавьте 500 мкл гранул в пробирки для микроцентрифуг объемом 2 мл. Поместите пробирки на магнит и выбросьте надосадочную жидкость.
- Промойте шарики 1 мл холодного PBS (4 °C) и выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 500 мкл холодного PBS (4 °C) и держите шарики в холоде (4 °C).
- Инкубируют клетки с 500 мкл линейного коктейля (50 мкл антител, поставляемых набором + 450 мкл PBS) в течение 25 мин (встряхивание, 4 °C) в темноте.
- Промойте ячейки холодным ПБС (4 °C).
- Центрифужируют пробирку при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте ячейки в 1000 мкл холодного PBS (4 °C) и перенесите клеточную суспензию в раствор гранул.
- Выдерживают 15 мин на вращающемся колесе при температуре 4 °С.
- Поместите пробирки на магнит и подождите, пока раствор выдохнется. Перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку FACS.
- Промойте шарики 500 мкл PBS.
- Поместите пробирки на магнит и подождите, пока раствор выдохнется.
- Перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку FACS.
- Центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
- Подготовьте магнитные шарики:
- Окрашивание для FACS
- Приготовьте 300 мкл смеси антител для каждой мыши в холодном PBS (4 °C).
- Смесь антител к стволовым клеткам/клеткам-предшественникам: ГСК: CD4 (1:1000) / CD8a (1:1000) / B220 (1:1000) / Ter119 (1:500) / Gr-1 (1:1000) / CD11b - PeCy7 (1:1000), c-Kit - PE (1:1000), Sca1 - APC-Cy7 (1:500), CD48 - BV421 (1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
- Инкубируют клетки в течение 40 мин в темноте при температуре 4 °С.
- Умывайтесь 1 мл холодного PBS (4 °C). Центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендант гранулы клеток в 1 мл буфера для ресуспендирования FACS и отфильтруйте клетки через трубку FACS с фильтрующим колпачком.
4. Сортировка FACS
- Настройте сортировщик ячеек.
- Вставьте наконечник сопла 70 мкм. Активация лазеров с длиной волны 405 нм, 488 нм, 561 нм и 633 нм.
- Установите режим сортировки на 4 Way Purity: маска выхода 0, маска чистоты 32, фазовая маска 0
- Установите частоту падения на 90 400 Гц и отрегулируйте амплитуду и задержку падения в соответствии с инструкциями производителя. Установите напряжение пластины на 5000 В.
- Определите сортировочные ворота в соответствии с инструкциями производителя.
- Для всех типов ячеек сначала выберите одиночные ячейки на основе сигнала прямого и бокового рассеяния, а затем выберите на основе окрашивания, специфичного для конкретного типа ячейки.
- Для В-клеток выберите AF647-положительную, ПЭ-отрицательную популяцию.
- Для Т-клеток выберите ПЭ-положительную, AF647-отрицательную популяцию.
- Для ГСК выберите PE-Cy7-низкую, PE-положительную, APC-Cy7-положительную, BV605-положительную, BV421-отрицательную популяцию.
- Для MPP выберите популяцию PE-Cy7-низкий, PE-положительный, APC-Cy7-положительный, BV421-положительный, BV605-отрицательный.
- Для образцов обломков выберите события, которые слишком малы, чтобы представить неповрежденные ячейки на основе сигнала прямого и бокового рассеяния. Типичные графики FACS, показывающие эти стратегии стробирования, показаны на рисунке 2 и рисунке 3.
- Отрегулируйте скорость потока, чтобы получить менее 15 000 событий в секунду.
- Подготовьте сборную пластину
- Приготовьте исходный раствор дрожжевого экстракта: Ресуспендируйте 1 аликвоту 13С дрожжевого экстракта в 7,5 мл сверхчистого H2O и 2,5 мл метанола.
- Приготовьте буфер для экстракции: добавьте 10 мкл исходногораствора дрожжевого экстракта 13 C к 10 мл ацетонитрила и перемешайте.
- Подготовьте планшет для сбора: добавьте 25 мкл буфера для экстракции в каждую лунку 96-луночного планшета для ПЦР, который будет использоваться для сбора образца. Чтобы свести к минимуму испарение, накрывают лунки ПЦР-крышками (полоски, нарезанные на синглеты).
- Выполните сортировку ячеек.
- Открывайте сборные лунки по мере необходимости для сбора отсортированных клеток и закрывайте их как можно скорее, чтобы свести к минимуму испарение.
- Если образцы не могут быть измерены немедленно, храните их в герметичных контейнерах при температуре -80 °C в течение нескольких дней. После размораживания образцы обрабатывают ультразвуком в течение 5 мин, чтобы обеспечить полную ресуспендию метаболитов.
5. Измерение LC-QQQ-MS
- Подготовка растворителей LC
- Приготовьте исходный раствор медроновой кислоты (100 мМ): растворите 17,6 мг медроновой кислоты в 1 мл сверхчистого H2O.
- Приготовьте буфер А: растворите 1,92 г карбоната аммония в 1 л сверхчистогоH2O и добавьте 50 мкл исходного раствора медроновой кислоты.
- Приготовьте буфер B: смешайте 50 мл буфера с 450 мл ацетонитрила.
- Приготовьте тестовую смесь LC: смешайте по 1 ppm лейцина, изолейцина, АМФ, АДФ и АТФ с ацетонитрилом 80:20: сверхчистый H2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запас медроновой кислоты можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев; другие буферы могут храниться в RT в течение 2 дней.
- Программный метод LC-QQQ-MS
- Оптимизируйте настройки MS для конкретного соединения (например, энергию столкновения) в соответствии с инструкциями производителя. Для приборов Agilent серии 6495 используйте настройки, приведенные в дополнительной таблице 1.
- Оптимизируйте настройки MS для конкретного источника в соответствии с инструкциями производителя. Для приборов с источником ESI с подогревом JetStream используйте следующие параметры: температура газа: 240 °C, расход газа: 15 л/мин, небулайзер: 50 фунтов на квадратный дюйм, температура газа в оболочке: 400 °C, расход газа в оболочке: 11 л/мин, капиллярное напряжение: 2000 В, напряжение сопла: 300 В.
- Оптимизируйте настройки ионно-трансферной оптики в соответствии с инструкциями производителя. Для приборов Agilent с ионной оптикой iFunnel используйте следующие параметры: РЧ-излучение высокого давления положительное: 110 В, РЧ-отрицательное высокое давление: 90 В, РЧ-излучение низкого давления положительное: 80 В, РЧ-отрицательное низкое давление: 60 В.
- Программирование LC-градиента: 0 мин, 95% B, 150 мкл/мин; 18 мин, 55% B, 150 мкл/мин; 19 мин, 30% B, 150 мкл/мин; 21,5 мин, 30% B, 150 мкл/мин; 22 мин, 95% B, 150 мкл/мин; 22,7 мин, 95% B, 200 мкл/мин, 23,5 мин, 95% B, 400 мкл/мин; Время остановки 28 мин. Температура колонки: 35 °C.
- Настройте прибор ЖХ-МС.
- Подключите хроматографическую колонку к отсеку колонки с регулируемой температурой.
- Соедините буферы и очистите все линии.
- Запустите по крайней мере 4 пустых выборки или пул выборок, чтобы уравновесить столбец.
- Запустите тестовую смесь LC для проверки хроматографических характеристик. Убедитесь, что соблюдены следующие критерии. Если это не так, очистите прибор или устраните неполадки перед запуском образцов.
- Убедитесь, что начальное противодавление составляет <150 бар, а максимальное противодавление — <400 бар.
- Убедитесь, что время удержания составляет ±1 мин следующим образом: изолейцин 6,0 мин, лейцин 6,4 мин, АМФ 9,5 мин, АДФ 11,2 мин и АТФ 12,7 мин.
- Убедитесь, что долина между лейцином и изолейцином на переходе +132->86 составляет < 20 % от высоты пика.
- Убедитесь, что разница во времени удержания АМФ и АДФ составляет от 1,5 до 1,9 мин, а разница во времени удержания АМФ к АТФ составляет от 1,1 до 1,9 мин.
- Настройка рабочего списка
- Начните с пустого образца, чтобы свести к минимуму перенос из тестовой смеси LC.
- Выполните выборки в случайном порядке.
- Закончите пустым образцом, чтобы очистить столбец для будущих экспериментов.
6. Предварительная обработка данных в automRm
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих шагах обсуждается преобразование из .d в .mzML в msconvert, подготовка metabdb, загрузка данных и моделей и metabdb, а также общие стратегии ручного просмотра пиков.
- Преобразуйте необработанные данные из формата .d в формат .mzML с помощью ProteoWizard20 со следующими настройками: точность двоичного кодирования: 32-бит, уровни MS 1-2, выбран индекс записи , выбран параметр сжатия zlib .
- Старт R.
- Установите automRm21 в соответствии с документацией к пакету (требуется только один раз перед первым использованием).
- Запустите графический интерфейс automRm в R: automRm::automrm_gui()
- Обработайте пакет .d файлов на вкладке Обработка > Пакетная обработка.
- Выберите файл.xlsx содержащий информацию о метаболитах. Этот файл должен соответствовать методу LC-QQQ-MS.
- Выбирать. Файл RData, содержащий модель машинного обучения пикового пика.
- Выбирать. RData-файл, содержащий модель машинного обучения с пиковой отчетностью.
- Выберите папку проекта, содержащую файлы .mzML.
- Запустите предварительную обработку данных, щелкнув Пакетная обработка.
- После завершения предварительной обработки откройте peakoverview.pdf , чтобы проверить правильность обнаружения хроматографических пиков. При необходимости загрузите automRmdata_Review.RData с вкладки Review графического интерфейса automRm, чтобы вручную изменить пиковую фильтрацию и пиковую интеграцию.
- Откройте peakinfo.xlsx из папки проекта и проверьте данные.
- Проверьте внутренний стандартный сигнал 13C на вкладке 13CArea: Убедитесь в отсутствии систематических различий в значениях интенсивности между экспериментальными группами и между образцами клеток и образцами обломков. Если такие различия существуют, используйте только данные из вкладок NormArea или NormHeight для последующего анализа; в противном случае используйте данные из вкладок RawArea или RawHeight.
- Проверьте интенсивность сигнала внутренних эталонов ATA и CLF во вкладке RawArea. Убедитесь в отсутствии систематических различий в интенсивности любого соединения между экспериментальными группами.
- Для каждого метаболита сравните интенсивность сигнала образцов, содержащих клетки, с образцами мусора из той же клеточной суспензии. Используйте соответствующий статистический тест для выявления метаболитов, в которых образцы, содержащие клетки, имеют более высокую интенсивность, чем образцы мусора. Включайте в последующий анализ данных только те метаболиты, которые прошли этот тест.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сортировка FACS позволяет выделять чистые популяции различных типов клеток из одной и той же клеточной суспензии (рис. 2 и рис. 3). Специфичность этого метода заключается в окрашивании различных типов клеток специфическими поверхностными маркерами (например, В-клетками и Т-клетками селезенки) или специфическими комбинациями поверхностных маркеров (например, ГСК и МПП). Окрашивание внутриклеточных маркеров, как правило, требует пермеабилизации клеточной мембраны. Это может привести к утечке метаболитов, и поэтому данный тип окрашивания не подходит для использования в данном протоколе.
ЖК обеспечивает разделение метаболитов до обнаружения МС (рис. 4). Метаболиты вымываются из колонки HILIC приблизительно отсортированы по полярности, при этом менее полярные соединения элюируют рано, а более полярные метаболиты — позже. Интенсивность сигнала определяется количеством метаболита-мишени в образце и метаболитоспецифичным фактором ответа. Следовательно, интенсивность сигнала не может быть осмысленно сравнена между метаболитами, а только для одного метаболита в разных образцах. 3 пика, которые выделены на рисунке 4 , представляют 1: ниацинамид обнаруживается как в мусоре, так и в клеточном экстракте, хотя и на разных уровнях, 2: ацетилкарнитин, который обнаруживается почти исключительно в клеточных экстрактах, и 3: внутренняя стандартная аминорефаталовая кислота, которая обнаруживается на том же уровне в образцах мусора и клеточных экстрактах.
Метаболические различия между типами клеток из одной и той же ткани сохраняют с помощью комбинированного протокола FACS-LC-MS (рис. 5). Для ГСК и МПП клетки 6 мышей должны были генерировать 6 образцов, что приводило к большей вариабельности внутри каждой группы по сравнению с В-клетками и Т-клетками, которые были отсортированы из одной и той же селезенки мышей. Образцы мусора, представляющие собой контрольные образцы технологических заготовок, четко отделены от образцов, содержащих клеточные экстракты. В образцах мусора видно четкое разделение двух экспериментов, что подчеркивает разницу в метаболической среде, которую клетки испытывают до сортировки. При представлении в виде кластеризованной тепловой карты (рис. 6) становится видимой дополнительная информация, например, относительные уровни метаболитов в образцах.
Рисунок 1: Обзор ключевых шагов представленного протокола. Эта цифра перепечатана с разрешения Schoenberger et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выделение чистых популяций В-клеток и Т-клеток из селезенки. События ячеек и обломков были выбраны на основе сигналов прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). В-клетки и Т-клетки были выбраны на основе сигналов окрашивания, специфичных для типа клеток. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Schoenberger et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Выделение ГСК и МПП из костного мозга. События ячеек и обломков были выбраны на основе сигналов прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Популяции ГСК и МПП были отобраны на основе нескольких стадий сигналов окрашивания, специфичных для типа клеток. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Schoenberger et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры хроматограмм. Образцы с (A) 5000 HSC и (B) 5000 обломков одного и того же рода. Обратите внимание, что оси имеют одинаковый масштаб на обеих панелях. Выделены метаболиты: 1: никотинамид, 2: ацетил-карнитин, 3: аминотерефталевая кислота (АТА). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ главных компонент (PCA) метаболических профилей различных типов клеток и фоновых образцов мусора из одних и тех же экспериментов. Наблюдается значительное разделение между различными органами и образцами фона из любого органа. Кроме того, типы клеток четко разделены внутри клеток каждого органа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Тепловая карта, представляющая метаболиты, измеренные в различных типах клеток и соответствующие фоновые контрольные образцы (мусор). Отсутствующие значения были вменены с половинным минимальным значением одного и того же метаболита во всех образцах. Для построения графиков данные были нормализованы до максимума отдельно в каждой строке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: В таблице перечислены специфические параметры соединения для выбранных метаболитов, включая время удержания (RT), полярность (Pol), прекурсор m/z (Q1), фрагмент m/z (Q3) и энергию столкновения (CE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важными шагами для успешной реализации таргетной метаболомики с использованием этого протокола являются: 1) надежная стратегия окрашивания и стробирования, которая позволит получить популяции чистых клеток, 2) точное обращение с объемами жидкости, 3) воспроизводимое время всех экспериментальных этапов, в частности, всех этапов, предшествующих экстракции метаболитов. В идеале все образцы, принадлежащие одному эксперименту, должны быть обработаны и измерены в одной партии, чтобы свести к минимуму пакетные эффекты22. Для более крупных экспериментов мы рекомендуем собирать клеточные экстракты при -80 °C, а затем измерять все экстракты в одной партии.
При работе с малозатратными образцами необходимо уделять особое внимание чистоте обращения со всеми материалами, которые используются в ходе экспериментов23. Распространенными загрязнениями являются остаточный буфер, моющие средства и средства по уходу за кожей. Важнейшей мерой по минимизации загрязнения является использование подходящих перчаток на протяжении всего эксперимента.
Чтобы свести к минимуму возможные изменения в составе метаболитов из-за воздействия на клетки нефизиологических условий, крайне важно готовить образцы на льду и с холодными реагентами (4 °C). Кроме того, максимально быстрое выполнение перед этапом FACS повысит качество измерений2. Указанное время для окрашивания антителами настолько короткое, насколько это разумно для хорошей эффективности окрашивания. Дополнительный этап блокирования неспецифического связывания антител с Fc-рецепторами с помощью Fc-блокирующих антител может быть добавлен перед процедурой окрашивания FACS24,25. Это предотвращает контаминацию целевых клеточных популяций и особенно рекомендуется при работе с клеточными суспензиями, которые включают многие типы клеток с высоким содержанием Fc-рецепторов (например, моноциты или макрофаги) или клетки, которые были культивированы без сыворотки. Тем не менее, это увеличит общее время обработки на 10-15 минут и, следовательно, может добавить дополнительную нефизиологическую вариабельность к результатам.
При использовании методов динамического МРМ на современных масс-спектрометрах все метаболиты, перечисленные в специфических для соединения условиях, могут быть зарегистрированы с помощью одной инъекции. Ограничение количества метаболитов-мишеней позволяет реализовать описанный протокол на старых масс-спектрометрах и ускоряет предварительную обработку и анализ данных.
Некоторый уровень фонового сигнала в данных ЖХ-МС неизбежен. Поэтому необходимо проявлять большую осторожность к выявлению тех метаболитов, которые могут быть обнаружены на фоне. Сортировка событий, которые слишком малы для представления неповрежденных ячеек (мусора), генерирует соответствующие пустые образцы процесса, представляющие интенсивность фонового сигнала, зависящую от матрицы. Кроме того, внутренние стандарты позволяют выявлять проблемные образцы, которые должны быть исключены из дальнейшего анализа данных26. Обе меры обеспечения качества работают лучше всего, если доступно достаточно большое количество репликаций. Рекомендуется использовать не менее шести репликаций на группу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Институт иммунобиологии и эпигенетики им. Макса Планка за предоставление животных, использованных в этом исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
