Summary
Burada, nadir hücre tiplerinde metabolitleri doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Hücre sınıflandırması için modifiye edilmiş bir kılıf sıvısı ve ilgili boş numunelerin oluşturulması da dahil olmak üzere teknik iyileştirmeler, numune başına yalnızca 5000 hücrelik bir girdi ile metabolitlerin kapsamlı bir miktar tayinini sağlar.
Abstract
Hücresel fonksiyon kritik olarak metabolizmaya bağlıdır ve altta yatan metabolik ağların fonksiyonu, küçük moleküllü ara ürünler ölçülerek incelenebilir. Bununla birlikte, özellikle hematopoietik kök hücreler gibi nadir hücre tiplerinde hücresel metabolizmanın doğru ve güvenilir ölçümlerinin elde edilmesi, geleneksel olarak birden fazla hayvandan alınan hücrelerin toplanmasını gerektirmiştir. Bir protokol artık araştırmacıların, daha bol hücre tipleri için birden fazla kopya üretirken, örnek başına yalnızca bir fare kullanarak nadir hücre tiplerindeki metabolitleri ölçmelerini sağlıyor. Bu, belirli bir proje için gerekli olan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan protokol, bir kılıf sıvısı olarak 5 g / L NaCl kullanmak, doğrudan asetonitril'e ayırmak ve iç standartların titiz kullanımıyla hedeflenen miktar tayinini kullanmak gibi geleneksel metabolomik protokollere göre birkaç önemli farklılık içerir ve hücresel metabolizmanın daha doğru ve kapsamlı ölçümlerine izin verir. Tek hücrelerin izolasyonu, floresan boyama ve sıralama için gereken süreye rağmen, protokol hücre tipleri ve ilaç tedavileri arasındaki farklılıkları büyük ölçüde koruyabilir.
Introduction
Metabolizma, tüm canlı hücrelerde meydana gelen önemli bir biyolojik süreçtir. Metabolik süreçler, hücrelerin enerji üretmesine ve temel biyomolekülleri sentezlemesine izin veren, sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve birbirine bağlı geniş bir biyokimyasal reaksiyon ağını içerir1. Metabolik ağların işlevini anlamak için araştırmacılar, hücrelerdeki küçük moleküllü ara ürünlerin seviyelerini ölçerler. Bu ara ürünler, metabolik aktivitenin önemli göstergeleri olarak hizmet eder ve hücresel fonksiyona ilişkin kritik bilgileri ortaya çıkarabilir.
Kütle spektrometresi (MS), karmaşık numunelerde metabolitlerin spesifik tespiti için en popüler seçimdir 1,2. Nükleer manyetik rezonans (NMR), bileşiklerin mutlak miktar tayininde ve yapı aydınlatmasında avantajlara sahiptir, ancak MS genellikle biyoakışkanlar veya hücre ekstraktları gibi karmaşık karışımlarda daha fazla bileşeni çözebilir. Çoğu zaman MS, bileşiğin kapiler elektroforez (CE), gaz kromatografisi (GC) veya sıvı kromatografisi (LC) ile önceden ayrılması ile birleştirilir3. Separasyon platformunun seçimi çoğunlukla hedef metabolitlerin aralığı ve numunenin türü ve gerçek dünya ortamında makinelerin ve uzmanlığın mevcudiyeti tarafından yönlendirilir. Her üç ayırma platformunun da geniş ve örtüşen bir uygun metabolit aralığı vardır, ancak farklı sınırlamalar vardır. Kısaca CE, yalnızca yüklü molekülleri ayırabilir ve çok sayıda numunenin sağlam analizini uygulamak için çok fazla uzmanlık gerektirir4. GC, ayrışmadan önce buharlaşacak kadar küçük ve apolar moleküllerle sınırlıdır3. Piyasada bulunan tüm LC kolonları göz önüne alındığında, herhangi iki metabolit bu teknoloji ile ayrılabilir5. Bununla birlikte, birçok LC yöntemi, benzer uzunluktaki CE veya GC yöntemlerinden daha az çözme gücü sergiler.
Metabolomik ölçümler için tipik başlangıç materyali miktarı genellikle numune başına 5 x 105 ila 5 x 107 hücre, 5-50 mg ıslak doku veya 5-50 μL vücut sıvısı6 aralığındadır. Bununla birlikte, örneğin hematopoietik kök hücreler (HSC'ler) veya dolaşımdaki tümör hücreleri gibi nadir hücre tiplerinin birincil hücreleriyle çalışırken bu miktarlarda başlangıç materyali elde etmek zor olabilir. Bu hücreler genellikle çok düşük sayılarda bulunur ve kritik hücresel özelliklerden ödün vermeden yetiştirilemez.
HSC'ler ve multipotent progenitör hücreler (MPP'ler), hematopoetik sistemin en az farklılaşmış hücreleridir ve bir organizmanın yaşamı boyunca sürekli olarak yeni kan hücreleri üretir. Hematopoezin düzenlenmesi, lösemi ve anemi gibi durumlarda klinik öneme sahiptir. Önemlerine rağmen, HSC'ler ve MPP'ler hematopoetik sistemdeki en nadir hücreler arasındadır. Tek bir fareden, tipik olarak, yaklaşık 5000 HSCizole edilebilir 7,8,9. Geleneksel metabolomik yöntemler daha fazla girdi materyali gerektirdiğinden, nadir hücre tiplerini analiz etmek için genellikle birden fazla fareden alınan hücrelerin toplanması gerekliydi10,11.
Burada, tek bir farenin HSC'lerinden metabolomik verilerin üretilmesini sağlamak için numune başına 5000 hücrede metabolitlerin ölçülmesini sağlayan bir protokol geliştirmeyi amaçladık12. Aynı zamanda, bu yöntem, lenfositler gibi daha bol hücre tipleri için tek bir fareden birden fazla kopya oluşturmaya izin verir. Bu yaklaşım, belirli bir proje için gereken hayvan sayısını azaltır, böylece hayvan deneylerinin "3R" (azaltma, değiştirme, iyileştirme) özelliğine katkıda bulunur.
Hücrelerdeki metabolitler, genellikle saniye mertebesinde çok yüksek devir oranlarına sahip olabilir13. Bununla birlikte, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için numunelerin hazırlanması saatler sürebilir ve FACS sıralamasının kendisi dakikalar ila saatler sürebilir ve bu da fizyolojik olmayan koşullar nedeniyle metabolomda potansiyel değişikliklere yol açabilir. Bu protokolde kullanılan bazı reaktifler (amonyum-klorür-potasyum [ACK] lizis tamponu gibi) benzer etkilere sahip olabilir. Bu koşullar hücresel strese neden olabilir ve hücrelerdeki metabolitlerin seviyelerini ve oranlarını etkileyerek hücresel metabolizmanın yanlış veya önyargılı ölçümlerine yol açabilir 14,15,16. Numune hazırlamaya bağlı metabolik değişiklikler bazen tasnif artefaktları olarak adlandırılır. Sert veya sert dokulardan tek hücreli süspansiyonlar üretmek için gerekli olabilecek uzun sindirim protokolleri ve sert reaktifler bu sorunu daha da kötüleştirebilir. Hangi değişikliklerin meydana gelebileceği muhtemelen hücre tipine ve işlem durumuna bağlıdır. Canlı dokudaki bozulmamış hücrelerin metabolik durumu ölçülemediğinden, değişikliklerin kesin doğası bilinmemektedir.
Burada sunulan protokol, geleneksel yöntemlere kıyasla birkaç önemli farklılık içerir, yani kılıf sıvısı olarak 5 g/L NaCl kullanımı, doğrudan ekstraksiyon tamponuna ayırma, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (HILIC-MS) üzerine büyük numune hacimlerinin enjekte edilmesi ve hedeflenen miktar tayininin kullanılması, dahili standartların ve arka plan kontrollerinin titiz kullanımı (Şekil 1). Bu protokol, hücre tipleri arasındaki ve ilaç tedavisi ile araç kontrolü arasındaki farklılıkları büyük ölçüde koruma potansiyeline sahiptir12. Kültürlenmiş hücreler için bile, daha yerleşik santrifüjleme ve süpernatantın manuel olarak çıkarılması gibi alternatif yaklaşımlarla olumlu bir şekilde karşılaştırılır. Ancak, sıralama yapıtları yine de gerçekleşebileceğinden, veriler dikkatle yorumlanmalıdır. Bu sınırlamaya rağmen, protokol, nadir birincil hücrelerde hücresel metabolizmanın daha doğru ve kapsamlı ölçümlerine izin veren metabolik profilleme alanında önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir12.
Nadir birincil hücrelerde geniş metabolik profilleri sağlam bir şekilde ölçme yeteneği, bu hücreleri içeren biyomedikal araştırmalarda yeni deneylere kapı açar. Örneğin, HSC'lerde metabolik aracılı düzenlemenin, anemi ve lösemi için etkileri olan uyku halinin kendini yenileme kapasitesini etkilediği gösterilmiştir11,17. Hasta kaynaklı dolaşımdaki tümör hücrelerinde, tümör ve komşu hücreler arasındaki metabolik genlerin ekspresyonunda farklılıklar gösterilmiştir18,19. Bu protokol şimdi araştırmacıların bu farklılıkları sistematik olarak metabolik düzeyde incelemelerine izin veriyor, bu da genellikle hücresel fenotipe gen ekspresyonundan daha yakın olarak kabul ediliyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için kullanılan tüm farelerin üreme ve yetiştiriciliği, yerel makamların (Regierungspräsidium Freiburg) düzenlemelerine göre Max Planck İmmünobiyoloji ve Epigenetik Enstitüsü'ndeki (MPI-IE) geleneksel bir hayvan tesisinde gerçekleştirildi. Fareler, MPI-IE'nin hayvan refahı komitesi ve yerel makamlar tarafından onaylanan yönergeler ve düzenlemeler izlenerek FELASA B eğitimli personel tarafından CO2 ve servikal çıkık ile ötenazi yapıldı. Hiçbir hayvan deneyi yapılmadı ve farelerin sağlık yükü yoktu.
NOT: Bu protokolde kullanılan LC-MS yöntemi gibi son derece hassas analitik yöntemler, numunedeki çok küçük kontaminasyonları bile tespit etme potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, bu tür kirlenmelerin en aza indirilmesi son derece önemlidir. En önemli önlem, numunelerle temas eden herhangi bir şeye dokunurken temiz eldiven giymektir. Bu, örneğin tamponların ve kılıf sıvısının hazırlanmasını, numune tüplerinin etiketlenmesini ve laboratuvar ekipmanının temizlenmesini içerir. Ayrıca, mümkün olduğunca tek kullanımlık laboratuvar gereçleri kullanılmalıdır. Cam eşyalar kullanılmadan önce LC-MS sınıfı çözücülerle durulanmalıdır. Temiz bir çalışma ortamı ayrıca kontaminasyonların azaltılmasına yardımcı olur.
1. Genel hazırlıklar
- Dahili standart stok çözeltisi hazırlayın: Ultra saf suda %30 v/v 2-propanol içinde 6 mg/mL kloro-fenilalanin (CLF) ve 6 mg/mL aminotereftalik asit (ATA) hazırlayın.
- FACS resüspansiyon tamponu hazırlayın: 0,9 g NaCl, 99,5 mL ultra saf su ve 0,5 mL dahili standart stok çözeltisi ekleyin. 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
- Kılıf sıvısını hazırlayın: Bir kılıf sıvı tankında, 30 g NaCl'yi 6 L deiyonize suda çözün ve bir hücre sıralayıcıya bağlayın.
NOT: Kılıf sıvısındaki NaCl konsantrasyonu, kılıf sıvısı olarak PBS kullanıldığında olduğu kadar sağlam olan ve aynı zamanda LC-MS12 ile metabolit tespiti üzerindeki olumsuz etkileri en aza indirmek için sıralayıcıdaki damlacıkların sapmasına izin verecek şekilde optimize edilmiştir. Daha düşük NaCl konsantrasyonları, metabolit tespiti için avantajlıdır, ancak hücrelerin sağlam bir şekilde sıralanmasını bozar.
2. B ve T hücrelerinin dalaktan izolasyonu
- Fare başına 90 mL fosfat tamponlu salini (PBS) buzdolabında veya buz üzerinde 4 °C'ye kadar önceden soğutun. Bir santrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun.
- Dalak izolasyonu
NOT: Hücre izolasyonu ve aşağıdaki boyama adımları sırasında hızlı, buz üzerinde ve soğuk (4 °C) tamponlarla çalışmak en kritiktir. Aksi takdirde, hücrelerin metabolik profili önemli ölçüde değişebilir.- Buz üzerinde 2 mL'lik bir reaksiyon tüpünde 1.5 mL PBS hazırlayın.
- Bir C57BL6/J fareyi yerel yetkililer tarafından onaylanan yönergelere ve yöntemlere göre ötenazi yapın.
- Kürkü% 70 etanol ile sterilize edin.
- Karnı makasla açın ve organı yırtmadan ince forseps kullanarak dalağı çıkarın. Dalağı hemen soğuk PBS'ye (4 °C) yerleştirin.
- Tek hücreli süspansiyonun oluşturulması
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve PBS ile ıslatın. Bir şırınga pistonunun başparmak dayanağını ve 30 mL soğuk PBS'yi (4 °C) kullanarak dalağı ağdan geçirin
- 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Peletin 1 mL ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi ve oda sıcaklığında (RT; 20 °C) 2 dakika inkübe edilmesi.
- 50 mL soğuk PBS (4 °C) ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- FACS boyama
- Antikor kokteylini fare başına 500 μL soğuk PBS (4 °C) içinde hazırlayın: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Antikor kokteylinde hücre peletini yeniden süspanse edin. 5 mL'lik bir FACS tüpüne aktarın. Karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- 3 mL soğuk PBS (4 °C) ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini 1 mL soğuk FACS resüspansiyon tamponunda (4 °C) yeniden süspanse edin. Hücreleri filtre kapaklı bir FACS tüpünden süzün. Hücreler akış sitometrisi tabanlı sıralama için hazırdır.
3. HSC'lerin ve MPP'lerin kemik iliğinden izolasyonu
- Kemik iliğini diseke edin ve izole edin.
NOT: Doğru sonuçlar elde etmek için tüm prosedür boyunca hızlı çalışmak ve izole kemikleri ve hücreleri soğuk (4 ° C) tutmak çok önemlidir. Ayrıca, arka plan sinyallerini en aza indirmek için temiz bir alan ve laboratuvar ekipmanı çalışın ve kullanın.- Fareleri yerel makamlar tarafından onaylanan yönergelere ve yöntemlere göre ötenazi yapın.
- Farelerin alt kısmına %70 Etanol püskürtün.
- Makas kullanarak bacakları ve dikenleri inceleyin. Sırtta bir kesi yapın ve kesiği karına kadar uzatın. Cildi arka bacaklardan soyun.
- Arka bacakları sökün veya kesin ve bacakların tibia, femur ve kalça eklemini içerdiğinden emin olun.
- Makası alın ve tamamen çıkarılana kadar omurganın yanında yakın kesin.
- Bacakları ve dikenleri soğuk PBS (4 °C) içeren 6 oyuklu plakalara dağıtın ve plakaları buz üzerinde tutun.
- Bir neşter ve makas kullanarak femur, tibia, kalça eklemi ve yumuşak doku omurlarını temizleyin.
- Temizlenmiş kemikleri bir havanda ezin ve 5 mL soğuk PBS'de (4 °C) havanda havanda dövün.
- Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe süzün.
- Kemikler tamamen beyaz görünene kadar 3.1.8-3.1.9 adımlarını tekrarlayın.
- Eritrositlerin parçalanması:
- Hasat edilen hücre süspansiyonunu 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini 1 mL soğuk ACK tamponunda (4 °C) yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurmak için soğuk PBS (4 °C) ekleyin (isteğe bağlı).
- 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Soy tükenmesi:
NOT: Soy negatif (Lin-) hücreleri zenginleştirmek için, CD4 hücreleri için bir negatif seçim kiti kullanıldı.- Manyetik boncukları hazırlayın:
- 2 mL mikrosantrifüj tüplerine 500 μL boncuk ekleyin. Tüpleri bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı atın.
- Boncukları 1 mL soğuk PBS (4 °C) ile yıkayın ve süpernatanı atın.
- 500 μL soğuk PBS (4 °C) ekleyin ve boncukları soğuk tutun (4 °C).
- Hücreleri 500 μL soy kokteyli (kit tarafından sağlanan 50 μL antikor + 450 μL PBS) ile karanlıkta 25 dakika (çalkalama, 4 °C) inkübe edin.
- Hücreleri soğuk PBS (4 °C) ile yıkayın.
- Tüpü 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücreleri 1000 μL soğuk PBS'de (4 °C) yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu boncuk çözeltisine aktarın.
- 4 °C'de dönen bir tekerlek üzerinde 15 dakika inkübe edin.
- Tüpleri bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar bekleyin. Süpernatanı yeni bir FACS tüpüne aktarın.
- Boncukları 500 μL PBS ile yıkayın.
- Tüpleri bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar bekleyin.
- Süpernatanı taze FACS tüpüne aktarın.
- 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Manyetik boncukları hazırlayın:
- FACS için boyama
- Soğuk PBS'de (4 °C) fare başına 300 μL antikor karışımı hazırlayın.
- Kök / progenitör hücreler için antikor karışımı: HSC'ler: CD4 (1: 1000) / CD8a (1: 1000) / B220 (1: 1000) / Ter119 (1: 500) / Gr-1 (1: 1000) / CD11b - PeCy7 (1: 1000), c-Kit - PE (1:1000), Sca1 - APC-Cy7 (1:500), CD48 - BV421 (1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
- Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
- 1 mL soğuk PBS (4 °C) ile yıkayın. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini 1 mL FACS resüspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri bir filtre kapaklı FACS tüpünden süzün.
4. FACS Sıralama
- Hücre sıralayıcıyı ayarlayın.
- 70 μm meme ucu takın. 405 nm, 488 nm, 561 nm ve 633 nm lazerleri etkinleştirin.
- Sıralama modunu 4 Saflık olarak ayarlayın: verim maskesi 0, saflık maskesi 32, faz maskesi 0
- Düşme frekansını 90,400 Hz'e ayarlayın ve genliği ve düşme gecikmesini üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Plaka voltajını 5000 V'a ayarlayın.
- Ayırma kapılarını üreticinin talimatlarına göre tanımlayın.
- Tüm hücre tipleri için, önce ileri saçılma ve yana doğru saçılma sinyaline dayalı tek hücreleri seçin, ardından hücre tipine özgü boyamaya dayalı seçim yapın.
- B hücreleri için AF647 pozitif, PE negatif popülasyonu seçin.
- T hücreleri için PE pozitif, AF647 negatif popülasyonu seçin.
- HSC'ler için PE-Cy7-düşük, PE-pozitif, APC-Cy7-pozitif, BV605-pozitif, BV421-negatif popülasyonu seçin.
- MPP'ler için PE-Cy7-düşük, PE-pozitif, APC-Cy7-pozitif, BV421-pozitif, BV605-negatif popülasyonu seçin.
- Enkaz örnekleri için, ileri saçılma ve yana doğru saçılma sinyaline dayalı olarak bozulmamış hücreleri temsil edemeyecek kadar küçük olayları seçin. Bu geçit stratejilerini gösteren tipik FACS grafikleri Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmektedir.
- 15.000 olay/sn'den daha az olay elde etmek için akış hızını ayarlayın.
- Toplama plakasını hazırlayın
- Maya özü stok çözeltisini hazırlayın: 7.5 mL ultra safH2Ove 2.5 mL metanol içinde 13C maya ekstraktının 1 alikotunu yeniden süspanse edin.
- Ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 10 mL asetonitril'e 10 μL 13C maya özü stok çözeltisi ekleyin ve karıştırın.
- Toplama plakası hazırlayın: Numuneyi toplamak için kullanılacak 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna 25 μL ekstraksiyon tamponu ekleyin. Buharlaşmayı en aza indirmek için, kuyuları PCR kapaklarıyla kapatın (şeritler tekli olarak kesilir).
- Hücre sıralamasını gerçekleştirin.
- Sıralanmış hücreleri toplamak için toplama kuyularını gerektiği gibi açın ve buharlaşmayı en aza indirmek için mümkün olan en kısa sürede kapatın.
- Numuneler hemen ölçülemiyorsa, kapalı kaplarda -80 °C'de birkaç gün saklayın. Çözüldükten sonra, metabolitlerin tamamen yeniden süspansiyonunu sağlamak için numuneleri 5 dakika boyunca sonikleştirin.
5. LC-QQQ-MS ölçümü
- LC Çözücüleri Hazırlayın
- Medronik asit stok çözeltisi hazırlayın (100 mM): 17.6 mg medronik asidi 1 mL ultra safH2Oiçinde çözün.
- Tampon A'yı Hazırlayın: 1.92 g amonyum karbonatı 1 L ultra safH2Oiçinde çözün ve 50 μL medronik asit stok çözeltisi ekleyin.
- Tampon B'yi Hazırlayın: 50 mL tamponu 450 mL asetonitril ile karıştırın.
- LC test karışımını hazırlayın: Lösin, izolösin, AMP, ADP ve ATP'nin her birini 1 ppm 80:20 asetonitrilde karıştırın: ultra safH2O.
NOT: Medronik asit stoğu -20 °C'de birkaç ay saklanabilir; diğer tamponlar 2 gün boyunca RT'de tutulabilir.
- Program LC-QQQ-MS yöntemi
- Bileşiğe özgü MS ayarlarını (örn. çarpışma enerjisi) üreticinin talimatlarına göre optimize edin. Agilent 6495 serisi cihazlar için Ek Tablo 1'deki ayarları kullanın.
- Kaynağa özel MS ayarlarını üreticinin talimatlarına göre optimize edin. JetStream ısıtmalı ESI kaynağına sahip cihazlar için aşağıdaki parametreleri kullanın: gaz sıcaklığı: 240 °C, gaz akışı: 15 L/dk, nebulizatör: 50 psi, kılıf gazı sıcaklığı: 400 °C, kılıf gazı akışı: 11 L/dk, kapiler gerilim: 2000 V, nozul voltajı: 300 V.
- İyon transfer optiklerinin ayarlarını üreticinin talimatlarına göre optimize edin. iFunnel iyon optiğine sahip Agilent cihazları için aşağıdaki parametreleri kullanın: yüksek basınçlı RF pozitif: 110 V, yüksek basınçlı RF negatif: 90 V, düşük basınçlı RF pozitif: 80 V, düşük basınçlı RF negatif: 60 V.
- LC gradyanını programlayın: 0 dk, %95 B, 150 μL/dk; 18 dk, %55 B, 150 μL/dk; 19 dk, %30 B, 150 μL/dk; 21,5 dk, %30 B, 150 μL/dk; 22 dk, %95 B, 150 μL/dk; 22.7 dk, %95 B, 200 μL/dk, 23.5 dk, %95 B, 400 μL/dk; durma süresi 28 dak. Kolon sıcaklığı: 35 °C.
- LC-MS cihazını kurun.
- Kromatografik sütunu sıcaklık kontrollü sütun bölmesine bağlayın.
- Tamponları bağlayın ve tüm hatları temizleyin.
- Sütunu dengelemek için en az 4 boş örnek veya havuz örneği çalıştırın.
- Kromatografik performansı kontrol etmek için LC test karışımını çalıştırın. Aşağıdaki kriterlerin karşılandığından emin olun. Değilse, çalıştırmadan önce cihazı temizleyin veya sorun giderin.amps.
- İlk karşı basıncın <150 bar ve maksimum karşı basıncın <400 bar olduğunu onaylayın.
- Bekletme sürelerinin aşağıdaki gibi ±1 dakikalık bir pencerede olduğunu onaylayın: izolösin 6,0 dakika, lösin 6,4 dakika, AMP 9,5 dakika, ADP 11,2 dakika ve ATP 12,7 dakika.
- +132->86 geçişinde lösin ve izolösin arasındaki vadinin tepe yüksekliğinin < %20'si olduğundan emin olun.
- AMP'den ADP'ye bekletme süresi arasındaki farkın 1,5 ila 1,9 dakika olduğundan ve ADP'den ATP'ye bekletme süresi arasındaki farkın 1,1 ila 1,9 dakika olduğundan emin olun.
- İş listesini ayarlama
- LC test karışımından taşınmayı en aza indirmek için boş bir örnekle başlayın.
- Örnekleri rastgele sırayla çalıştırın.
- Gelecekteki deneyler için sütunu temizlemek üzere boş bir örnekle sonlandırın.
6. AutomRm'de veri ön işleme
NOT: Aşağıdaki adımlar, msconvert'te .d'den .mzML'ye dönüştürmeyi, metabdb'nin hazırlanmasını, veri ve modellerin ve metabdb'nin yüklenmesini ve manuel tepe incelemesi için genel stratejileri tartışır.
- Aşağıdaki ayarlarla ProteoWizard20'yi kullanarak ham verileri .d biçiminden .mzML biçimine dönüştürün: ikili kodlama hassasiyeti: 32 bit, MS Düzeyleri 1-2, Yazma Dizini seçili, Zlib sıkıştırmasını kullan seçili.
- R'yi başlatın.
- automRm21'i paket belgelerine göre kurun (ilk kullanımdan önce yalnızca bir kez gereklidir).
- R'de automRm GUI'sini başlatın: automRm::automrm_gui()
- İşlem > İşlem Toplu İşlemi sekmesindeki .d dosyaları grubunu işleyin.
- Metabolit bilgilerini tutan .xlsx dosya seçin. Bu dosya LC-QQQ-MS yöntemiyle eşleşmelidir.
- Seçmek. En yüksek toplama ML modelini tutan RData dosyası.
- Seçmek. En yüksek raporlama ML modelini tutan RData dosyası.
- .mzML dosyalarını içeren proje klasörünü seçin.
- İşlem Grubu'na tıklayarak veri ön işlemeyi başlatın.
- Ön işlem bittikten sonra, kromatografik piklerin doğru tespitini kontrol etmek için peakoverview.pdf açın. İsteğe bağlı olarak, tepe filtrelemeyi ve tepe tümleştirmesini el ile değiştirmek için automRm GUI'sinin Gözden Geçir sekmesinden automRmdata_Review.RData'yı yükleyin.
- Proje klasöründen peakinfo.xlsx açın ve verileri kontrol edin.
- 13CArea sekmesindeki 13C dahili standart sinyalini kontrol edin: Deney grupları arasında ve hücre numuneleri ile enkaz numuneleri arasında yoğunluk değerlerinde sistematik farklılıklar olmadığından emin olun. Bu tür farklılıklar varsa, sonraki analizler için yalnızca NormArea veya NormHeight sekmelerindeki verileri kullanın; aksi takdirde, RawArea veya RawHeight sekmelerindeki verileri kullanın.
- RawArea sekmesinde dahili standartlar ATA ve CLF'nin sinyal yoğunluğunu kontrol edin. Deney grupları arasında her iki bileşiğin yoğunluğunda sistematik farklılıklar olmadığından emin olun.
- Her metabolit için, hücre içeren numunelerin sinyal yoğunluğunu aynı hücre süspansiyonundan alınan enkaz numuneleriyle karşılaştırın. Hücre içeren numunelerin enkaz numunelerinden daha yüksek yoğunluğa sahip olduğu metabolitleri tanımlamak için uygun bir istatistiksel test kullanın. Yalnızca bu testi geçen metabolitleri sonraki veri analizine dahil edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS sınıflandırması, aynı hücre süspansiyonundan farklı hücre tiplerine sahip temiz popülasyonların izolasyonunu sağlar (Şekil 2 ve Şekil 3). Bu yöntemin özgüllüğü, farklı hücre tiplerinin spesifik yüzey belirteçleri (örneğin, dalaktan B hücreleri ve T hücreleri) veya yüzey belirteçlerinin spesifik kombinasyonları (örneğin HSC'ler ve MPP'ler) ile boyanmasına dayanır. Hücre içi belirteçlerin boyanması tipik olarak hücre zarının geçirgenliğini gerektirir. Bu, metabolitlerin sızmasına neden olabilir ve bu nedenle bu tip boyamalar bu protokolde kullanılmaya uygun değildir.
LC, MS tarafından tespit edilmeden önce metabolitlerin ayrılmasını sağlar (Şekil 4). Metabolitler, HILIC kolonundan yaklaşık olarak polariteye göre sıralanır, daha az polar bileşik erken ve daha fazla polar metabolit daha sonra ayrılır. Sinyal yoğunluğu, numunedeki bir hedef metabolit miktarı ve metabolite özgü bir yanıt faktörü ile belirlenir. Sonuç olarak, sinyal yoğunlukları metabolitler arasında anlamlı bir şekilde karşılaştırılamaz, ancak numuneler arasında yalnızca bir metabolit için karşılaştırılabilir. Şekil 4'te vurgulanan 3 tepe noktası, 1'i temsil eder: niasinamid farklı seviyelerde de olsa hem enkazda hem de hücre ekstraktında tespit edilir, 2: neredeyse sadece hücre ekstraktlarında tespit edilen asetil-karnitin ve 3: enkaz örneklerinde ve hücre ekstraktlarında aynı seviyede tespit edilen dahili standart aminotereptalik asit.
Aynı dokudan alınan hücre tipleri arasındaki metabolik farklılıklar, kombine FACS-LC-MS protokolü kullanılarak korunur (Şekil 5). HSC'ler ve MPP'ler için, 6 fareden alınan hücrelerin 6 numune üretmesi gerekiyordu, bu da aynı murin dalağından sıralanan B hücreleri ve T hücrelerine kıyasla her grupta daha büyük bir değişkenliğe yol açtı. Proses boş kontrol numunelerini temsil eden enkaz numuneleri, hücre ekstraktları içeren numunelerden net bir şekilde ayrılır. Enkaz örnekleri içinde, iki deneyin net bir şekilde ayrılması görülebilir ve bu da hücrelerin sıralamadan önce deneyimlediği metabolik ortamdaki farkı vurgular. Kümelenmiş bir ısı haritasında (Şekil 6) temsil edildiğinde, numuneler arasındaki göreceli metabolit seviyeleri gibi ek bilgiler görünür hale gelir.
Şekil 1: Sunulan protokolün temel adımlarına genel bakış. Bu rakam Schoenberger ve ark.12'nin izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dalaktan saf B hücresi ve T hücresi popülasyonlarının izolasyonu. Hücreler ve enkaz olayları, ileri saçılma (FSC) ve yana doğru saçılma (SSC) sinyallerine göre seçildi. B hücreleri ve T hücreleri, hücre tipine özgü boyama sinyallerine göre seçildi. Bu rakam Schoenberger ve ark.12'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HSC ve MPP'nin kemik iliğinden izolasyonu. Hücreler ve enkaz olayları, ileri saçılma (FSC) ve yana doğru saçılma (SSC) sinyallerine göre seçildi. HSC ve MPP popülasyonları, hücre tipine özgü boyama sinyallerinin çoklu aşamalarına göre seçildi. Bu rakam Schoenberger ve ark.12'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Örnek kromatogramlar. Aynı türden (A) 5000 HSC ve (B) 5000 enkaz olayı içeren numuneler. Eksenin her iki panelde de aynı ölçeği paylaştığını unutmayın. Vurgulanan metabolitler şunlardır: 1: nikotinamid, 2: asetil-karnitin, 3: aminotereftalik asit (ATA). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farklı hücre tiplerinin metabolik profillerinin temel bileşen analizi (PCA) ve aynı deneylerden elde edilen enkaz arka plan örnekleri. Farklı organlar ve herhangi bir organdan alınan enkaz arka plan örnekleri arasında büyük bir ayrım gözlenir. Ek olarak, hücre tipleri her organın hücreleri içinde açıkça ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Farklı hücre tiplerinde ölçülen metabolitleri ve eşleşen arka plan kontrol örneklerini (enkaz) temsil eden ısı haritası. Eksik değerler, tüm örneklerde aynı metabolitin yarı minimum değeri ile ilişkilendirildi. Çizim için, veriler her satırda ayrı ayrı maksimuma normalleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Tablo, tutma süresi (RT), polarite (Pol), Öncü m/z (Q1), Fragman m/z (Q3) ve çarpışma enerjisi (CE) dahil olmak üzere seçilen metabolitler için bileşiğe özgü ayarları listeler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolü kullanarak hedeflenen metabolomiklerin başarılı bir şekilde uygulanması için en kritik adımlar şunlardır: 1) temiz hücre popülasyonları sağlayacak sağlam bir boyama ve geçit stratejisi 2) sıvı hacimlerinin hassas bir şekilde işlenmesi, 3) tüm deneysel adımların tekrarlanabilir zamanlaması, özellikle metabolit ekstraksiyonundan önceki tüm adımlar. İdeal olarak, bir deneye ait tüm numuneler, parti etkilerini en aza indirmek için tek bir partide işlenmeli ve ölçülmelidir22. Daha büyük deneyler için, hücre ekstraktlarını -80 °C'de toplamanızı ve ardından tüm ekstraktları tek bir partide ölçmenizi öneririz.
Düşük girdili numunelerle çalışırken, deneyler sırasında kullanılan tüm malzemelerin temiz bir şekilde kullanılması vurgulanmalıdır23. Yaygın kontaminasyonlar artık tampon, deterjanlar ve cilt bakım ürünleridir. Kontaminasyonu en aza indirmek için en önemli önlem, deney boyunca uygun eldivenlerin kullanılmasıdır.
Hücrelerin fizyolojik olmayan koşullara maruz kalması nedeniyle metabolit bileşimindeki potansiyel değişiklikleri en aza indirmek için, numunelerin buz üzerinde ve soğuk reaktiflerle (4 °C) hazırlanması çok önemlidir. Ayrıca FACS adımından önce mümkün olduğunca hızlı olunması ölçüm kalitesini artıracaktır2. Antikor boyama için belirtilen süreler, iyi boyama verimliliği için makul olduğu kadar kısadır. Fc-blok antikorları kullanılarak antikorların Fc reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için ek bir adım, FACS boyama prosedüründenönce eklenebilir 24,25. Bu, hedef hücre popülasyonlarının kontaminasyonunu önler ve özellikle birçok Fc reseptörü yüksek hücre tipini (monositler veya makrofajlar gibi) veya serumsuz kültürlenmiş hücreleri içeren hücre süspansiyonları ile çalışırken tavsiye edilir. Bununla birlikte, genel kullanım süresini 10-15 dakika artıracaktır ve bu nedenle sonuçlara fizyolojik olmayan ek değişkenlik ekleyebilir.
Modern kütle spektrometrelerinde dinamik MRM yöntemlerinin kullanılmasıyla, bileşiğe özgü ayarlarda listelenen tüm metabolitler tek bir enjeksiyonla kaydedilebilir. Hedef metabolitlerin sayısının sınırlandırılması, açıklanan protokolün eski kütle spektrometrelerinde uygulanmasına izin verir ve veri ön işlemeyi ve veri analizini hızlandırır.
LC-MS verilerinde bir miktar arka plan sinyali kaçınılmazdır. Bu nedenle, arka planın üzerinde tespit edilebilen metabolitleri tanımlamak için büyük özen gösterilmelidir. Bozulmamış hücreleri (enkaz) temsil edemeyecek kadar küçük olan sıralama olayları, matrise bağlı arka plan sinyal yoğunluklarını temsil eden ilgili işlem boş örnekleri oluşturur. Ek olarak, iç standartlar, daha fazla veri analizinden hariç tutulması gereken sorunlu örneklerin tanımlanmasına izin verir26. Her iki kalite güvence ölçütü de, yeterince fazla sayıda kopya mevcutsa en iyi sonucu verir. Grup başına en az altı çoğaltma kullanmanızı öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan hayvanları sağladıkları için Max Planck İmmünobiyoloji ve Epigenetik Enstitüsü'nün hayvan tesisine teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
