Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att noggrant och tillförlitligt mäta metaboliter i sällsynta celltyper. Tekniska förbättringar, inklusive en modifierad mantelvätska för cellsortering och generering av relevanta blankprover, möjliggör en omfattande kvantifiering av metaboliter med en inmatning på endast 5000 celler per prov.
Abstract
Cellulär funktion är kritiskt beroende av metabolismen, och funktionen hos de underliggande metaboliska nätverken kan studeras genom att mäta små molekylära intermediärer. För att få exakta och tillförlitliga mätningar av cellulär metabolism, särskilt i sällsynta celltyper som hematopoetiska stamceller, har det traditionellt krävts att man slagit samman celler från flera djur. Ett protokoll gör det nu möjligt för forskare att mäta metaboliter i sällsynta celltyper med endast en mus per prov samtidigt som flera replikat genereras för mer förekommande celltyper. Detta minskar antalet djur som krävs för ett visst projekt. Protokollet som presenteras här innebär flera viktiga skillnader jämfört med traditionella metabolomikprotokoll, såsom att använda 5 g/L NaCl som mantelvätska, sortera direkt i acetonitril och använda riktad kvantifiering med rigorös användning av interna standarder, vilket möjliggör mer exakta och omfattande mätningar av cellulär metabolism. Trots den tid som krävs för isolering av enskilda celler, fluorescerande färgning och sortering kan protokollet i stor utsträckning bevara skillnader mellan celltyper och läkemedelsbehandlingar.
Introduction
Metabolism är en essentiell biologisk process som sker i alla levande celler. Metaboliska processer involverar ett stort nätverk av biokemiska reaktioner som är tätt reglerade och sammankopplade, vilket gör det möjligt för celler att producera energi och syntetisera viktiga biomolekyler1. För att förstå funktionen hos metaboliska nätverk mäter forskarna nivåerna av småmolekylära intermediärer i celler. Dessa intermediärer fungerar som viktiga indikatorer på metabolisk aktivitet och kan avslöja viktiga insikter om cellulär funktion.
Masspektrometri (MS) är det mest populära valet för specifik detektion av metaboliter i komplexa prover 1,2. Kärnmagnetisk resonans (NMR) har fördelar när det gäller absolut kvantifiering av föreningar och strukturbestämning, men MS kan ofta lösa upp fler komponenter i komplexa blandningar som biovätskor eller cellextrakt. Oftast kombineras MS med tidigare separation av föreningen genom kapillärelektrofores (CE), gaskromatografi (GC) eller vätskekromatografi (LC)3. Valet av separationsplattform styrs främst av utbudet av målmetaboliter och typen av prov och, i en verklig miljö, av tillgången på maskiner och expertis. Alla tre separationsplattformarna har ett brett och överlappande utbud av lämpliga metaboliter men olika begränsningar. Kortfattat kan CE endast separera laddade molekyler och kräver mycket expertis för att genomföra robust analys av ett stort antal prover4. GC är begränsat till molekyler som är små och apolära nog att avdunsta innan de sönderdelas3. Med tanke på alla kommersiellt tillgängliga LC-kolonner kan vilka två metaboliter som helst separeras med denna teknik5. Många LC-metoder uppvisar dock mindre upplösningsförmåga än CE- eller GC-metoder av liknande längd.
Den typiska mängden utgångsmaterial för metabolomikmätningar ligger vanligtvis i intervallet 5 x 105 till 5 x 107 celler per prov, 5-50 mg våt vävnad eller 5-50 μL kroppsvätska6. Det kan dock vara svårt att få tag på sådana mängder utgångsmaterial när man arbetar med primära celler av sällsynta celltyper, som till exempel hematopoetiska stamceller (HSC) eller cirkulerande tumörceller. Dessa celler finns ofta i mycket små antal och kan inte odlas utan att kompromissa med kritiska cellulära egenskaper.
HSC och multipotenta progenitorceller (MPP) är de minst differentierade cellerna i det hematopoetiska systemet och producerar kontinuerligt nya blodceller under en organisms liv. Regleringen av hematopoes är av klinisk relevans vid tillstånd som leukemi och anemi. Trots sin betydelse är HSC och MPP bland de mest sällsynta cellerna i det hematopoetiska systemet. Från en enda mus kan vanligtvis cirka 5000 HSC:er isoleras 7,8,9. Eftersom traditionella metabolomikmetoder kräver mer ingående material var det ofta nödvändigt att slå samman celler från flera möss för att analysera sällsynta celltyper10,11.
Här syftade vi till att utveckla ett protokoll som möjliggör mätning av metaboliter i så lite som 5000 celler per prov för att möjliggöra generering av metabolomikdata från HSCs från en enda mus12. Samtidigt gör denna metod det möjligt att generera flera replikat från en enda mus för rikligare celltyper som lymfocyter. Detta tillvägagångssätt minskar antalet djur som krävs för ett visst projekt, vilket bidrar till "3R" (minskning, ersättning, förfining) av djurförsök.
Metaboliter i celler kan ha mycket höga omsättningshastigheter, ofta i storleksordningensekunder 13. Att förbereda prover för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan dock ta timmar, och själva FACS-sorteringen kan ta minuter till timmar, vilket leder till potentiella förändringar i metabolomet på grund av icke-fysiologiska förhållanden. Vissa av de reagenser som används i detta protokoll (t.ex. ammonium-klorid-kalium [ACK] lysbuffert) kan ha liknande effekter. Dessa tillstånd kan orsaka cellulär stress och påverka nivåerna och förhållandena av metaboliter i celler, vilket leder till felaktiga eller partiska mätningar av cellulär metabolism 14,15,16. De metaboliska förändringarna på grund av provberedning kallas ibland sorteringsartefakter. Långa matsmältningsprotokoll och starka reagenser som kan krävas för att producera encellssuspensioner från hårda eller hårda vävnader kan förvärra detta problem. Vilka förändringar som kan uppstå beror sannolikt på celltypen och bearbetningsförhållandena. Den exakta karaktären av förändringarna är fortfarande okänd, eftersom det metaboliska tillståndet hos de ostörda cellerna i den levande vävnaden inte kan mätas.
Protokollet som presenteras här innehåller flera viktiga skillnader jämfört med traditionella metoder, nämligen användningen av 5 g/L NaCl som mantelvätska, sortering direkt i extraktionsbuffert, injicering av stora provvolymer på hydrofil interaktion vätskekromatografi-masspektrometri (HILIC-MS), och användning av riktad kvantifiering, rigorös användning av interna standarder och bakgrundskontroller (Figur 1). Detta protokoll har potential att istor utsträckning bevara skillnader mellan celltyper och mellan läkemedelsbehandling och vehikelkontroll. Även för odlade celler kan det jämföras med alternativa metoder, såsom den mer etablerade centrifugeringen och manuell borttagning av supernatant. Men eftersom sorteringsartefakter fortfarande kan uppstå måste data tolkas med försiktighet. Trots denna begränsning representerar protokollet en betydande förbättring inom området metabolisk profilering, vilket möjliggör mer exakta och omfattande mätningar av cellulär metabolism i sällsynta primära celler12.
Möjligheten att på ett robust sätt mäta breda metaboliska profiler i sällsynta primära celler öppnar dörren för nya experiment inom biomedicinsk forskning som involverar dessa celler. Till exempel har metaboliskt medierad reglering i HSC visat sig påverka förmågan att förnya sig i dvala, med implikationer för anemi och leukemi11,17. I cirkulerande tumörceller från patienter har skillnader i uttrycket av metabola gener mellan tumör och intilliggande celler visats18,19. Detta protokoll gör det nu möjligt för forskare att studera dessa skillnader systematiskt på en metabolisk nivå, som allmänt anses ligga närmare den cellulära fenotypen än genuttrycket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Uppfödning och uppfödning av alla möss som användes för detta protokoll utfördes i en konventionell djuranläggning vid Max Planck-institutet för immunobiologi och epigenetik (MPI-IE) i enlighet med de lokala myndigheternas (Regierungspräsidium Freiburg) bestämmelser. Möss avlivades med CO2 och cervikal luxation av FELASA B-utbildad personal enligt riktlinjer och föreskrifter som godkänts av djurskyddskommittén vid MPI-IE och de lokala myndigheterna. Inga djurförsök utfördes och mössen var utan hälsoproblem.
OBS: Mycket känsliga analysmetoder som LC-MS-metoden som används i detta protokoll har potential att upptäcka även mycket små föroreningar i provet. Därför är det av yttersta vikt att minimera sådana föroreningar. Den enskilt viktigaste åtgärden är att bära rena handskar när du rör vid något som kommer i kontakt med proverna. Detta inkluderar till exempel beredning av buffertar och mantelvätska, märkning av provrör och rengöring av laboratorieutrustning. Dessutom bör laboratorieutrustning för engångsbruk användas när det är möjligt. Glas bör sköljas med lösningsmedel av LC-MS-kvalitet före användning. En ren arbetsmiljö bidrar ytterligare till att minska föroreningar.
1. Allmänna förberedelser
- Bered intern standardstamlösning: Bered 6 mg/ml klorfenylalanin (CLF) och 6 mg/ml aminotereftalsyra (ATA) i 30 % v/v 2-propanol i ultrarent vatten.
- Förbered FACS-resuspensionsbuffert: Tillsätt 0,9 g NaCl, 99,5 ml ultrarent vatten och 0,5 ml intern standardstamlösning. Förkyl till 4 °C.
- Förbered mantelvätska: Lös upp 30 g NaCl i 6 L avjoniserat vatten i en mantelvätsketank och anslut till en cellsorterare.
OBS: Koncentrationen av NaCl i mantelvätskan har optimerats för att tillåta avböjning av droppar i sorteraren som är lika robust som vid användning av PBS som mantelvätska och samtidigt minimera negativa effekter på metabolitdetektion med LC-MS12. Lägre koncentrationer av NaCl är fördelaktiga för metabolitdetektion men försämrar den robusta sorteringen av celler.
2. Isolering av B- och T-celler från mjälten
- Förkyl 90 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) per mus i kylskåp eller på is till 4 °C. Förkyl centrifugen till 4 °C.
- Isolering av mjälte
OBS: Det är mest kritiskt att arbeta snabbt, på is och med kalla (4 °C) buffertar under cellisolering och följande färgningssteg. Annars kan cellernas metaboliska profil förändras avsevärt.- Förbered 1,5 ml PBS i ett 2 ml reaktionsrör på is.
- Avliva en C57BL6/J-mus enligt de riktlinjer och metoder som godkänts av lokala myndigheter.
- Sterilisera pälsen med 70% etanol.
- Öppna buken med en sax och ta bort mjälten med en fin pincett utan att spräcka organet. Placera omedelbart mjälten i kall PBS (4 °C).
- Generering av en encellssuspension
- Placera en 70 μm cellsil på ett 50 ml centrifugrör och fukta den med PBS. För mjälten genom nätet med hjälp av tumstödet på en sprutkolv och 30 ml kall PBS (4 °C)
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Ta bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml ACK lysbuffert och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur (RT; 20 °C).
- Tillsätt 50 ml kall PBS (4 °C). Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och kassera supernatanten.
- FACS-färgning
- Bered antikroppscocktailen i 500 μl kall PBS (4 °C) per mus: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Återsuspendera cellpelleten i antikroppscocktailen. Överför till ett 5 ml FACS-rör. Inkubera i 30 min vid 4 °C i mörker.
- Tillsätt 3 ml kall PBS (4 °C). Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml kall FACS-resuspensionsbuffert (4 °C). Filtrera cellerna genom ett FACS-rör med filterlock. Cellerna är redo för flödescytometribaserad sortering.
3. Isolering av HSC och MPP från benmärgen
- Dissekera och isolera benmärgen.
OBS: Det är mycket viktigt att arbeta snabbt och hålla isolerade ben och celler kalla (4 °C) under hela proceduren för att möjliggöra korrekta resultat. Dessutom, för att minimera bakgrundssignaler, arbeta och använd ett rent utrymme och laboratorieutrustning.- Avliva möss enligt riktlinjer och metoder som godkänts av lokala myndigheter.
- Spraya 70% etanol på den nedre delen av mössen.
- Dissekera benen och ryggarna med en sax. Gör ett snitt på baksidan och förläng snittet runt buken. Skala av huden från bakbenen.
- Riv eller skär av bakbenen och se till att benen innehåller skenbenet, lårbenet och höftleden.
- Ta saxen och klipp av den nära ryggraden tills den är helt borttagen.
- Fördela benen och taggarna i 6-hålsplattor som innehåller kall PBS (4 °C) och håll plattorna på is.
- Rengör lårbenet, skenbenet, höftleden och kotorna från mjukvävnad med en skalpell och sax.
- Krossa de rengjorda benen med en mortel och stöt i 5 ml kall PBS (4 °C).
- Filtrera cellsuspensionen genom en 40 μm cellsil till ett 50 ml rör.
- Upprepa steg 3.1.8-3.1.9 tills benen är helt vita.
- Lys av erytrocyter:
- Centrifugera den skördade cellsuspensionen vid 400 × g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml kall ACK-buffert (4 °C). Inkubera i 5 minuter på is.
- Tillsätt kall PBS (4 °C) för att stoppa reaktionen (valfritt).
- Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Utarmning av härstamning:
OBS: För att berika för härstamningsnegativa (Lin-) celler användes ett negativt selektionskit för CD4-celler.- Förbered de magnetiska pärlorna:
- Tillsätt 500 μL pärlor i 2 ml mikrocentrifugrör. Placera rören på en magnet och kassera supernatanten.
- Tvätta pärlorna med 1 ml kall PBS (4 °C) och kassera supernatanten.
- Tillsätt 500 μL kall PBS (4 °C) och håll pärlorna kalla (4 °C).
- Inkubera cellerna med 500 μl linjecocktail (50 μl antikroppar från satsen + 450 μl PBS) i 25 minuter (skakning, 4 °C) i mörker.
- Tvätta cellerna med kall PBS (4 °C).
- Centrifugera röret vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1000 μL kall PBS (4 °C) och överför cellsuspensionen till kullösningen.
- Inkubera i 15 minuter på ett roterande hjul vid 4 °C.
- Placera rören på en magnet och vänta tills lösningen klarnar. Överför supernatanten till ett nytt FACS-rör.
- Tvätta pärlorna med 500 μL PBS.
- Placera rören på en magnet och vänta tills lösningen klarnar.
- Överför supernatanten till det färska FACS-röret.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Förbered de magnetiska pärlorna:
- Färgning för FACS
- Bered 300 μl antikroppsblandning per mus i kall PBS (4 °C).
- Antikroppsblandning för stam-/stamceller: HSC: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
- Inkubera cellerna i 40 minuter i mörker vid 4 °C.
- Tvätta med 1 ml kall PBS (4 °C). Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml FACS-resuspensionsbuffert och filtrera cellerna genom ett FACS-rör med filterlock.
4. FACS-sortering
- Ställ in cellsorteraren.
- Sätt i 70 μm munstycksspetsen. Aktivera lasrar på 405 nm, 488 nm, 561 nm och 633 nm.
- Ställ in sorteringsläget på 4-vägs renhet: avkastningsmask 0, renhetsmask 32, fasmask 0
- Ställ in fallfrekvensen på 90 400 Hz och justera amplituden och droppfördröjningen enligt tillverkarens instruktioner. Ställ in plattan voltage till 5000 V.
- Definiera sorteringsgrindar enligt tillverkarens instruktioner.
- För alla celltyper väljer du först enskilda celler baserat på framåtriktad spridning och sidospridningssignal, följt av markering baserat på celltypsspecifik färgning.
- För B-celler väljer du den AF647-positiva, PE-negativa populationen.
- För T-celler, välj den PE-positiva, AF647-negativa populationen.
- För HSC:er väljer du PE-Cy7-låg, PE-positiv, APC-Cy7-positiv, BV605-positiv, BV421-negativ population.
- För MPP:er väljer du PE-Cy7-låg, PE-positiv, APC-Cy7-positiv, BV421-positiv, BV605-negativ, population.
- För skräpprover väljer du händelser som är för små för att representera intakta celler baserat på framåtriktad spridning och sidoriktad spridningssignal. Typiska FACS-diagram som visar dessa grindstrategier visas i figur 2 och figur 3.
- Justera flödeshastigheten för att få mindre än 15 000 händelser/s.
- Förbered uppsamlingsplattan
- Bered stamlösning av jästextrakt: Omsuspendera 1 alikvot av 13C jästextrakt i 7,5 ml ultrarentH2O och 2,5 ml metanol.
- Förbered extraktionsbufferten: Tillsätt 10 μl 13C stamlösning av jästextrakt till 10 ml acetonitril och blanda.
- Förbered uppsamlingsplattan: Tillsätt 25 μl extraktionsbuffert till varje brunn på en PCR-platta med 96 brunnar som kommer att användas för att samla upp provet. För att minimera avdunstning, täck brunnarna med PCR-lock (ränder skurna i undertröjor).
- Utför cellsorteringen.
- Öppna uppsamlingsbrunnarna efter behov för att samla upp sorterade celler och stäng dem så snart som möjligt för att minimera avdunstning.
- Om proverna inte kan mätas omedelbart, förvara dem i förseglade behållare vid -80 °C i flera dagar. Efter upptining, sonikera proverna i 5 minuter för att säkerställa fullständig resuspension av metaboliter.
5. LC-QQQ-MS-mätning
- Förbered LC-lösningsmedel
- Bered stamlösning av medronsyra (100 mM): Lös upp 17,6 mg medronsyra i 1 ml ultraren H2O.
- Förbered buffert A: Lös upp 1,92 g ammoniumkarbonat i 1 l ultrarent H2O och tillsätt 50 μl stamlösning av medronsyra.
- Förbered buffert B: Blanda 50 ml buffert med 450 ml acetonitril.
- Förbered LC-testblandning: Blanda 1 ppm vardera av leucin, isoleucin, AMP, ADP och ATP i 80:20 acetonitril: ultraren H2O.
OBS: Lager av medronsyra kan förvaras vid -20 °C i flera månader. andra buffertar kan hållas på RT i 2 dagar.
- Programmera LC-QQQ-MS-metoden
- Optimera föreningsspecifika MS-inställningar (t.ex. kollisionsenergi) enligt tillverkarens instruktioner. För instrument i Agilent 6495-serien, använd inställningarna i tilläggstabell 1.
- Optimera källspecifika MS-inställningar enligt tillverkarens instruktioner. För instrument med uppvärmd ESI-källa JetStream, använd följande parametrar: gastemperatur: 240 °C, gasflöde: 15 l/min, nebulisator: 50 psi, mantelgastemperatur: 400 °C, mantelgasflöde: 11 l/min, kapillärspänning: 2000 V, munstycksspänning: 300 V.
- Optimera inställningarna för jonöverföringsoptik enligt tillverkarens instruktioner. För Agilent-instrument med iFunnel-jonoptik, använd följande parametrar: högtrycks RF positiv: 110 V, högtrycks RF negativ: 90 V, lågtrycks RF positiv: 80 V, lågtrycks RF negativ: 60 V.
- Programmera LC-gradienten: 0 min, 95 % B, 150 μL/min; 18 min, 55 % B, 150 μL/min; 19 min, 30 % B, 150 μL/min; 21,5 min, 30 % B, 150 μL/min; 22 min, 95 % B, 150 μL/min; 22,7 min, 95 % B, 200 μL/min, 23,5 min, 95 % B, 400 μL/min; Stopptid 28 min. Kolonnens temperatur: 35 °C.
- Ställ in LC-MS-instrumentet.
- Anslut den kromatografiska kolonnen i det temperaturkontrollerade kolonnfacket.
- Anslut buffertarna och rensa alla ledningar.
- Kör minst 4 tomma exempel eller poolexempel för att utjämna kolumnen.
- Kör LC-testblandningen för att kontrollera kromatografisk prestanda. Se till att följande kriterier är uppfyllda. Om inte, rengör eller felsök instrumentet innan du kör samples.
- Kontrollera att det initiala mottrycket är <150 bar och det maximala mottrycket är <400 bar.
- Bekräfta att retentionstiderna är i ett fönster på ±1 min enligt följande: isoleucin 6.0 min, leucin 6.4 min, AMP 9.5 min, ADP 11.2 min och ATP 12.7 min.
- Se till att dalen mellan leucin och isoleucin i övergången +132->86 är < 20 % av topphöjden.
- Se till att skillnaden i retentionstid AMP till ADP är 1.5 till 1.9 min, och skillnaden i retentionstid ADP till ATP är 1.1 till 1.9 min.
- Konfigurera arbetslista
- Börja med ett blankprov för att minimera överföringen från LC-testblandningen.
- Kör exemplen i slumpmässig ordning.
- Avsluta med ett tomt prov för att rengöra kolonnen för framtida experiment.
6. Förbehandling av uppgifter i automatiskt
I följande steg beskrivs konvertering från .d till .mzML i msconvert, förberedelse av metabdb, inläsning av data och modeller och metabdb samt allmänna strategier för manuell toppgranskning.
- Konvertera rådata från .d-format till .mzML-format med ProteoWizard20 med följande inställningar: binär kodningsprecision: 32-bitars, MS-nivåer 1-2, Skriv index valt, Använd zlib-komprimering valt.
- Starta R.
- Installera automRm21 enligt paketdokumentationen (krävs endast en gång före första användningen).
- Starta automRm GUI i R: automRm::automrm_gui()
- Bearbeta batchen med .d-filer på fliken Process > Process Batch.
- Välj .xlsx fil som innehåller information om metaboliter. Den här filen måste matcha LC-QQQ-MS-metoden.
- Utvald. RData-fil som innehåller ML-modell för toppplockning.
- Utvald. RData-fil som innehåller ML-modellen för topprapportering.
- Välj den projektmapp som innehåller .mzML-filer.
- Starta förbearbetning av data genom att klicka på Bearbeta batch.
- När förbehandlingen är klar, öppna peakoverview.pdf för att kontrollera korrekt detektering av kromatografiska toppar. Du kan också läsa in automRmdata_Review.RData från fliken Granska i automRm GUI för att manuellt ändra toppfiltrering och toppintegrering.
- Öppna peakinfo.xlsx från projektmappen och kontrollera data.
- Kontrollera 13C intern standardsignal i fliken 13CArea: Se till att det inte finns några systematiska skillnader i intensitetsvärdena mellan experimentgrupper och mellan cellprover och skräpprover. Om sådana skillnader finns, använd endast data från flikarna NormArea eller NormHeight för efterföljande analys; I annat fall använder du data från flikarna RawArea eller RawHeight.
- Kontrollera signalintensiteten för interna standarder ATA och CLF på fliken RawArea. Se till att det inte finns några systematiska skillnader i intensiteten av någon av föreningarna mellan experimentgrupperna.
- För varje metabolit jämförs signalintensiteten hos prover som innehåller celler med skräpproverna från samma cellsuspension. Använd ett lämpligt statistiskt test för att identifiera metaboliter där prover som innehåller celler har högre intensitet än skräpprover. Inkludera endast metaboliter som klarar detta test i efterföljande dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-sortering gör det möjligt att isolera rena populationer av olika celltyper från samma cellsuspension (figur 2 och figur 3). Specificiteten hos denna metod bygger på färgning av de olika celltyperna med specifika ytmarkörer (till exempel B-celler och T-celler från mjälten) eller specifika kombinationer av ytmarkörer (till exempel HSC och MPP). Färgning av intracellulära markörer kräver vanligtvis permeabilisering av cellmembranet. Detta kan orsaka läckage av metaboliter, och därför är denna typ av färgning inte lämplig att använda i detta protokoll.
LC tillhandahåller separation av metaboliter innan de detekteras av MS (figur 4). Metaboliter eluerar från HILIC-kolonnen ungefär sorterade efter polaritet, med mindre polära föreningar som eluerar tidigt och fler polära metaboliter som eluerar senare. Signalintensiteten bestäms av mängden av en målmetabolit i provet och en metabolitspecifik responsfaktor. Följaktligen kan signalintensiteter inte jämföras på ett meningsfullt sätt mellan metaboliter utan endast för en metabolit mellan prover. De 3 topparna som är markerade i figur 4 representerar 1: niacinamid detekteras i både skräp och cellextrakt, om än på olika nivåer, 2: acetyl-karnitin som nästan uteslutande detekteras i cellextrakt, och 3: den interna standardaminotereftalsyran som detekteras på samma nivå i skräpprover och cellextrakt.
Metaboliska skillnader mellan celltyper från samma vävnad bevaras med hjälp av det kombinerade FACS-LC-MS-protokollet (figur 5). För HSC och MPP krävdes celler från 6 möss för att generera 6 prover, vilket ledde till en större variabilitet inom varje grupp jämfört med B-celler och T-celler, som sorterades från samma murina mjälte. Skräpprover som representerar kontrollprover som utgör blankprov från processen är tydligt åtskilda från prover som innehåller cellextrakt. I skräpproverna syns en tydlig separation av de två experimenten, vilket belyser skillnaden i metabolisk miljö som cellerna upplever före sorteringen. När den representeras i en klustrad värmekarta (figur 6) blir ytterligare information synlig, såsom de relativa nivåerna av metaboliter över prover.
Figur 1: Översikt över de viktigaste stegen i det presenterade protokollet. Denna figur har återgetts med tillstånd från Schoenberger et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Isolering av rena populationer av B-celler och T-celler från mjälten. Cell- och skräphändelser valdes ut baserat på framåtspridningssignaler (FSC) och sidledsspridningssignaler (SSC). B-celler och T-celler valdes ut baserat på celltypsspecifika färgningssignaler. Denna figur har anpassats med tillstånd från Schoenberger et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Isolering av HSC och MPP från benmärg. Cell- och skräphändelser valdes ut baserat på framåtspridningssignaler (FSC) och sidledsspridningssignaler (SSC). HSC- och MPP-populationer valdes ut baserat på flera stadier av celltypsspecifika färgningssignaler. Denna figur har anpassats med tillstånd från Schoenberger et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på kromatogram. Prover med (A) 5000 HSCs och (B) 5000 skräphändelser från samma sort. Observera att axeln delar samma skala i båda panelerna. Markerade metaboliter är 1: nikotinamid, 2: acetylkarnitin, 3: aminotereftalsyra (ATA). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Principalkomponentanalys (PCA) av metaboliska profiler för olika celltyper och bakgrundsprover från samma experiment. Stor separation observeras mellan de olika organen och bakgrundsprover från alla organ. Dessutom är celltyperna tydligt åtskilda inom cellerna i varje organ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Värmekarta som representerar metaboliter uppmätta i olika celltyper och matchande bakgrundskontrollprover (skräp). Saknade värden imputerades med halva minimivärdet av samma metabolit i alla prover. För plottning normaliserades data till maxvärdet separat på varje rad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Tabellen listar de föreningsspecifika inställningarna för de valda metaboliterna, inklusive retentionstid (RT), polaritet (Pol), prekursor m/z (Q1), fragment m/z (Q3) och kollisionsenergi (CE). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik implementering av riktad metabolomik med hjälp av detta protokoll är 1) en robust färgnings- och gatingstrategi som kommer att ge rena cellpopulationer 2) exakt hantering av vätskevolymer, 3) reproducerbar timing av alla experimentella steg, i synnerhet alla steg före metabolitextraktion. Helst bör alla prover som tillhör ett experiment bearbetas och mätas i en sats för att minimera satseffekter22. För större experiment föreslår vi att man samlar cellextrakt vid -80 °C och sedan mäter alla extrakt i en sats.
När man arbetar med prover med låg tillförsel måste ren hantering av alla material som används under experimenten betonas23. Vanliga föroreningar är restbuffert, rengöringsmedel och hudvårdsprodukter. Den viktigaste åtgärden för att minimera kontaminering är att använda lämpliga handskar under hela försöket.
För att minimera potentiella förändringar i metabolitsammansättningen på grund av exponering av celler för ofysiologiska förhållanden är det avgörande att förbereda proverna på is och med kalla reagenser (4 °C) är avgörande. Att vara så snabb som möjligt före FACS-steget kommer också att öka kvaliteten på mätning2. De angivna tiderna för antikroppsfärgning är så korta som rimligen för god färgningseffektivitet. Ett ytterligare steg för att blockera den ospecifika bindningen av antikroppar till Fc-receptorer med hjälp av Fc-blockantikroppar kan läggas till före FACS-färgningsproceduren24,25. Detta förhindrar kontaminering av målcellpopulationerna och är särskilt tillrådligt vid arbete med cellsuspensioner som innehåller många höga celltyper av Fc-receptorer (som monocyter eller makrofager) eller celler som odlats utan serum. Det kommer dock att öka den totala hanteringstiden med 10-15 minuter och kan därför lägga till ytterligare icke-fysiologisk variabilitet till resultaten.
Med hjälp av dynamiska MRM-metoder på moderna masspektrometrar kan alla metaboliter som anges i föreningsspecifika miljöer registreras med en enda injektion. Att begränsa antalet målmetaboliter gör det möjligt att implementera det beskrivna protokollet på äldre masspektrometrar och påskyndar förbehandling och analys av data.
En viss nivå av bakgrundssignal i LC-MS-data är oundviklig. Därför måste stor försiktighet iakttas för att identifiera de metaboliter som kan detekteras ovanför bakgrunden. Sortering av händelser som är för små för att representera intakta celler (skräp) genererar relevanta processtomma prover som representerar matrisberoende bakgrundssignalintensiteter. Dessutom gör interna standarder det möjligt att identifiera problematiska prover som bör undantas från ytterligare dataanalys26. Båda kvalitetssäkringsåtgärderna fungerar bäst om det finns ett tillräckligt stort antal replikat. Vi rekommenderar att du använder minst sex replikat per grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka djuranläggningen vid Max Planck-institutet för immunobiologi och epigenetik för att ha tillhandahållit de djur som användes i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
