Summary
Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.
Abstract
La funzione cellulare dipende in modo critico dal metabolismo e la funzione delle reti metaboliche sottostanti può essere studiata misurando gli intermedi di piccole molecole. Tuttavia, l'ottenimento di misurazioni accurate e affidabili del metabolismo cellulare, in particolare in tipi di cellule rare come le cellule staminali ematopoietiche, ha tradizionalmente richiesto il raggruppamento di cellule provenienti da più animali. Un protocollo consente ora ai ricercatori di misurare i metaboliti in tipi di cellule rare utilizzando un solo topo per campione, generando al contempo più repliche per tipi di cellule più abbondanti. In questo modo si riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto. Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai protocolli metabolomici tradizionali, come l'utilizzo di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto in acetonitrile e l'utilizzo di una quantificazione mirata con un uso rigoroso di standard interni, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare. Nonostante il tempo necessario per l'isolamento delle singole cellule, la colorazione fluorescente e lo smistamento, il protocollo può preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e i trattamenti farmacologici.
Introduction
Il metabolismo è un processo biologico essenziale che si verifica in tutte le cellule viventi. I processi metabolici coinvolgono una vasta rete di reazioni biochimiche strettamente regolate e interconnesse, consentendo alle cellule di produrre energia e sintetizzare biomolecole essenziali1. Per comprendere la funzione delle reti metaboliche, i ricercatori misurano i livelli di piccole molecole intermedie all'interno delle cellule. Questi intermedi fungono da importanti indicatori dell'attività metabolica e possono rivelare informazioni critiche sulla funzione cellulare.
La spettrometria di massa (MS) è la scelta più popolare per la rilevazione specifica di metaboliti in campioni complessi 1,2. La risonanza magnetica nucleare (NMR) presenta vantaggi nella quantificazione assoluta dei composti e nella delucidazione della struttura, ma la MS può spesso risolvere più componenti in miscele complesse come biofluidi o estratti cellulari. Il più delle volte, la MS è combinata con la separazione preventiva del composto mediante elettroforesi capillare (CE), gascromatografia (GC) o cromatografia liquida (LC)3. La scelta della piattaforma di separazione è guidata principalmente dalla gamma di metaboliti target e dal tipo di campione e, in un contesto reale, dalla disponibilità di macchine e competenze. Tutte e tre le piattaforme di separazione hanno una gamma ampia e sovrapposta di metaboliti adatti, ma limitazioni diverse. In breve, la CE può solo separare le molecole cariche e richiede molta esperienza per implementare un'analisi robusta di un gran numero di campioni4. La GC è limitata alle molecole che sono abbastanza piccole e apolari da evaporare prima di decomporsi3. Considerando tutte le colonne LC disponibili in commercio, due metaboliti qualsiasi possono essere separati con questa tecnologia5. Tuttavia, molti metodi LC mostrano un potere risolutivo inferiore rispetto ai metodi CE o GC di lunghezza simile.
La quantità tipica di materiale di partenza per le misurazioni metabolomiche è solitamente compresa tra 5 x 10e 5 x 107 cellule per campione, 5-50 mg di tessuto umido o 5-50 μL di fluido corporeo6. Tuttavia, può essere difficile ottenere tali quantità di materiale di partenza quando si lavora con cellule primarie di tipi di cellule rare, come ad esempio le cellule staminali ematopoietiche (HSC) o le cellule tumorali circolanti. Queste cellule sono spesso presenti in numero molto basso e non possono essere coltivate senza compromettere le caratteristiche cellulari critiche.
Le HSC e le cellule progenitrici multipotenti (MPP) sono le cellule meno differenziate del sistema ematopoietico e producono continuamente nuove cellule del sangue per tutta la vita di un organismo. La regolazione dell'emopoiesi è di rilevanza clinica in condizioni come la leucemia e l'anemia. Nonostante la loro importanza, le HSC e le MPP sono tra le cellule più rare all'interno del sistema ematopoietico. Da un singolo topo, tipicamente, si possono isolare circa 5000 HSC 7,8,9. Poiché i metodi metabolomici tradizionali richiedono più materiale di input, è stato spesso necessario raggruppare le cellule di più topi per analizzare i tipi di cellule rare10,11.
Qui, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo che consenta la misurazione dei metaboliti in appena 5000 cellule per campione per consentire la generazione di dati metabolomici dalle HSC di un singolo topo12. Allo stesso tempo, questo metodo consente di generare più repliche da un singolo topo per tipi di cellule più abbondanti come i linfociti. Questo approccio riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto, contribuendo così alle "3R" (riduzione, sostituzione, perfezionamento) degli esperimenti sugli animali.
I metaboliti nelle cellule possono avere tassi di turnover molto elevati, spesso nell'ordine dei secondi13. Tuttavia, la preparazione dei campioni per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) può richiedere ore e lo smistamento FACS stesso può richiedere da minuti a ore, portando a potenziali alterazioni del metaboloma a causa di condizioni non fisiologiche. Alcuni dei reagenti utilizzati in questo protocollo (come il tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio [ACK]) possono avere effetti simili. Queste condizioni possono causare stress cellulare e avere un impatto sui livelli e sui rapporti dei metaboliti all'interno delle cellule, portando a misurazioni imprecise o distorte del metabolismo cellulare 14,15,16. I cambiamenti metabolici dovuti alla preparazione del campione sono talvolta indicati come artefatti di smistamento. I lunghi protocolli di digestione e i reagenti aggressivi che potrebbero essere necessari per produrre sospensioni unicellulari da tessuti duri o duri possono aggravare questo problema. I cambiamenti che possono verificarsi dipendono probabilmente dal tipo di cellula e dalle condizioni di elaborazione. La natura precisa dei cambiamenti rimane sconosciuta, poiché lo stato metabolico delle cellule indisturbate nel tessuto vivente non può essere misurato.
Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai metodi tradizionali, vale a dire l'uso di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto nel tampone di estrazione, l'iniezione di grandi volumi di campione sull'interazione idrofila cromatografia liquida-spettrometria di massa (HILIC-MS) e l'utilizzo di una quantificazione mirata, l'uso rigoroso di standard interni e controlli di fondo (Figura 1). Questo protocollo ha il potenziale per preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e tra il trattamento farmacologico e il controllo del veicolo12. Anche per le cellule in coltura, si confronta favorevolmente con approcci alternativi, come la centrifugazione più consolidata e la rimozione manuale del surnatante. Tuttavia, poiché gli artefatti di ordinamento possono ancora verificarsi, i dati devono essere interpretati con cautela. Nonostante questa limitazione, il protocollo rappresenta un miglioramento significativo nel campo della profilazione metabolica, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare in cellule primarie rare12.
La capacità di misurare in modo robusto ampi profili metabolici in cellule primarie rare apre la porta a nuovi esperimenti di ricerca biomedica che coinvolgono queste cellule. Ad esempio, è stato dimostrato che la regolazione metabolicamente mediata nelle HSC ha un impatto sulla capacità di auto-rinnovamento della dormienza, con implicazioni per l'anemia e la leucemia11,17. Nelle cellule tumorali circolanti derivate da pazienti, sono state dimostrate differenze nell'espressione dei geni metabolici tra il tumore e le cellule adiacenti18,19. Questo protocollo consente ora ai ricercatori di studiare sistematicamente queste differenze a livello metabolico, che è generalmente considerato più vicino al fenotipo cellulare che all'espressione genica.
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Protocol
L'allevamento e l'allevamento di tutti i topi utilizzati per questo protocollo sono stati condotti in una struttura per animali convenzionale presso l'Istituto Max Planck per l'immunobiologia e l'epigenetica (MPI-IE) secondo i regolamenti delle autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg). I topi sono stati sottoposti a eutanasia con CO2 e lussazione cervicale da personale addestrato FELASA B seguendo le linee guida e i regolamenti approvati dal comitato per il benessere degli animali del MPI-IE e dalle autorità locali. Non è stata eseguita alcuna sperimentazione animale e i topi non hanno avuto problemi di salute.
NOTA: I metodi analitici altamente sensibili come il metodo LC-MS utilizzato in questo protocollo hanno il potenziale per rilevare anche contaminazioni molto piccole nel campione. Pertanto, è della massima importanza ridurre al minimo tali contaminazioni. La misura più importante è quella di indossare guanti puliti ogni volta che si tocca qualcosa che viene a contatto con i campioni. Ciò include, ad esempio, la preparazione di tamponi e fluidi di guaina, l'etichettatura delle provette dei campioni e la pulizia delle apparecchiature di laboratorio. Inoltre, il materiale da laboratorio monouso dovrebbe essere utilizzato quando possibile. La vetreria deve essere risciacquata con solventi di grado LC-MS prima dell'uso. Un ambiente di lavoro pulito aiuta ulteriormente a ridurre le contaminazioni.
1. Preparativi generali
- Preparare la soluzione madre standard interna: preparare 6 mg/mL di cloro-fenilalanina (CLF) e 6 mg/mL di acido amminotereftalico (ATA) in 2-propanolo al 30% v/v in acqua ultrapura.
- Preparare il tampone di risospensione FACS: aggiungere 0,9 g di NaCl, 99,5 mL di acqua ultrapura e 0,5 mL di soluzione madre standard interna. Preraffreddare a 4 °C.
- Preparare il fluido della guaina: in un serbatoio del fluido della guaina, sciogliere 30 g di NaCl in 6 L di acqua deionizzata e collegarlo a un selezionatore di cellule.
NOTA: La concentrazione di NaCl nel fluido della guaina è stata ottimizzata per consentire la deflessione delle goccioline nel selezionatore che è robusta come quando si utilizza il PBS come fluido della guaina e contemporaneamente per ridurre al minimo gli effetti negativi sul rilevamento dei metaboliti mediante LC-MS12. Concentrazioni più basse di NaCl sono vantaggiose per il rilevamento dei metaboliti, ma compromettono il robusto smistamento delle cellule.
2. Isolamento delle cellule B e T dalla milza
- Preraffreddare 90 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per topo in frigorifero o su ghiaccio a 4 °C. Preraffreddare una centrifuga a 4 °C.
- Isolamento della milza
NOTA: È fondamentale lavorare velocemente, su ghiaccio e con tamponi freddi (4 °C) durante l'isolamento cellulare e le seguenti fasi di colorazione. In caso contrario, il profilo metabolico delle cellule potrebbe cambiare considerevolmente.- Preparare 1,5 mL di PBS in una provetta di reazione da 2 mL su ghiaccio.
- Sopprimere un topo C57BL6/J secondo le linee guida e i metodi approvati dalle autorità locali.
- Sterilizzare la pelliccia con etanolo al 70%.
- Aprire l'addome con le forbici e rimuovere la milza usando una pinza sottile senza rompere l'organo. Mettere immediatamente la milza in PBS freddo (4 °C).
- Generazione di una sospensione monocellulare
- Posizionare un colino cellulare da 70 μm su una provetta da centrifuga da 50 mL e bagnarla con PBS. Far passare la milza attraverso la rete utilizzando il poggiapollice di uno stantuffo da siringa e 30 mL di PBS freddo (4 °C)
- Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi ACK e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente (RT; 20 °C).
- Aggiungere 50 mL di PBS freddo (4 °C). Centrifugare a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Colorazione FACS
- Preparare il cocktail di anticorpi in 500 μL di PBS freddo (4 °C) per topo: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Risospendere il pellet cellulare nel cocktail di anticorpi. Trasferire in una provetta FACS da 5 mL. Incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
- Aggiungere 3 mL di PBS freddo (4 °C). Centrifugare a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di risospensione FACS freddo (4 °C). Filtrare le celle attraverso un tubo FACS con tappo filtrante. Le cellule sono pronte per lo smistamento basato sulla citometria a flusso.
3. Isolamento di HSC e MPPs dal midollo osseo
- Sezionare e isolare il midollo osseo.
NOTA: È molto importante lavorare velocemente e mantenere le ossa isolate e le cellule fredde (4 °C) durante l'intera procedura per consentire risultati accurati. Inoltre, per ridurre al minimo i segnali di fondo, lavorare e utilizzare uno spazio pulito e attrezzature di laboratorio.- Sopprimere i topi secondo le linee guida e i metodi approvati dalle autorità locali.
- Spruzzare etanolo al 70% sulla parte inferiore dei topi.
- Sezionare le gambe e le spine usando le forbici. Fai un'incisione sulla schiena ed estendi il taglio fino all'addome. Staccare la pelle dagli arti posteriori.
- Strappa o taglia gli arti posteriori e assicurati che le gambe contengano la tibia, il femore e l'articolazione dell'anca.
- Prendi le forbici e tagliale vicino alla colonna vertebrale fino a rimuoverle completamente.
- Distribuire le gambe e le spine in piastre a 6 pozzetti contenenti PBS freddo (4 °C) e tenere le piastre su ghiaccio.
- Pulisci il femore, la tibia, l'articolazione dell'anca e le vertebre dai tessuti molli usando un bisturi e delle forbici.
- Schiacciare le ossa pulite con mortaio e pestello in 5 ml di PBS freddo (4 °C).
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 40 μm in una provetta da 50 ml.
- Ripetere i passaggi 3.1.8-3.1.9 fino a quando le ossa appaiono completamente bianche.
- Lisi degli eritrociti:
- Centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone ACK freddo (4 °C). Incubare per 5 minuti con ghiaccio.
- Aggiungere PBS freddo (4 °C) per arrestare la reazione (opzionale).
- Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Esaurimento del lignaggio:
NOTA: Per arricchire le cellule negative del lignaggio (Lin-), è stato utilizzato un kit di selezione negativa per le cellule CD4.- Preparare le perline magnetiche:
- Aggiungere 500 μL di microsfere in provette per microcentrifuga da 2 mL. Posizionare le provette su un magnete e gettare il surnatante.
- Lavare le perle con 1 mL di PBS freddo (4 °C) ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 500 μL di PBS freddo (4 °C) e mantenere le perle fredde (4 °C).
- Incubare le cellule con 500 μL di cocktail di lignaggio (50 μL di anticorpo fornito dal kit + 450 μL di PBS) per 25 minuti (agitazione, 4 °C) al buio.
- Lavare le celle con PBS freddo (4 °C).
- Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 1000 μL di PBS freddo (4 °C) e trasferire la sospensione cellulare nella soluzione di microsfere.
- Incubare per 15 minuti su una ruota rotante a 4 °C.
- Posiziona i tubi su un magnete e attendi che la soluzione si schiarisca. Trasferire il surnatante in una provetta FACS fresca.
- Lavare le perle con 500 μL di PBS.
- Posiziona i tubi su un magnete e attendi che la soluzione si schiarisca.
- Trasferire il surnatante nella provetta FACS fresca.
- Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Preparare le perline magnetiche:
- Colorazione per FACS
- Preparare 300 μL di miscela di anticorpi per topo in PBS a freddo (4 °C).
- Mix di anticorpi per cellule staminali/progenitrici: HSCs: CD4 (1:1000) / CD8a (1:1000) / B220 (1:1000) / Ter119 (1:500) / Gr-1 (1:1000) / CD11b - PeCy7 (1:1000), c-Kit - PE (1:1000), Sca1 - APC-Cy7 (1:500), CD48 - BV421 (1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
- Incubare le cellule per 40 minuti al buio a 4 °C.
- Lavare con 1 mL di PBS freddo (4 °C). Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di risospensione FACS e filtrare le cellule attraverso una provetta FACS con tappo filtrante.
4. Smistamento FACS
- Impostare il selezionatore di celle.
- Inserire la punta dell'ugello da 70 μm. Attiva laser da 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm.
- Impostare la modalità di ordinamento su Purezza a 4 vie: maschera di resa 0, maschera di purezza 32, maschera di fase 0
- Impostare la frequenza di caduta su 90.400 Hz e regolare l'ampiezza e il ritardo di caduta secondo le istruzioni del produttore. Impostare la tensione di placca a 5000 V.
- Definire i cancelli di smistamento secondo le istruzioni del produttore.
- Per tutti i tipi di cellule, selezionare prima le singole cellule in base al segnale di dispersione diretta e laterale di dispersione, quindi selezionare in base alla colorazione specifica del tipo di cellula.
- Per le cellule B, selezionare la popolazione AF647-positiva e PE-negativa.
- Per le cellule T, selezionare la popolazione PE-positiva e AF647-negativa.
- Per le HSC, selezionare la popolazione PE-Cy7-bassa, PE-positiva, APC-Cy7-positiva, BV605-positiva, BV421-negativa.
- Per gli MPP, selezionare la popolazione PE-Cy7-bassa, PE-positiva, APC-Cy7-positiva, BV421-positiva, BV605-negativa.
- Per i campioni di detriti, selezionare gli eventi troppo piccoli per rappresentare le cellule intatte in base al segnale di dispersione diretta e laterale. I tipici grafici FACS che mostrano queste strategie di gating sono mostrati nella Figura 2 e nella Figura 3.
- Regolare la portata per ottenere meno di 15.000 eventi/s.
- Preparare il piatto di raccolta
- Preparare la soluzione madre dell'estratto di lievito: risospendere 1 aliquota di estratto di lievito 13C in 7,5 mL di H2O ultrapuro e 2,5 mL di metanolo.
- Preparare il tampone di estrazione: aggiungere 10 μL di soluzione madre di estratto di lievito 13C a 10 mL di acetonitrile e mescolare.
- Preparare la piastra di raccolta: aggiungere 25 μL di tampone di estrazione a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti che verrà utilizzata per raccogliere il campione. Per ridurre al minimo l'evaporazione, coprire i pozzetti con coperchi PCR (strisce tagliate in singoletti).
- Eseguire l'ordinamento delle celle.
- Aprire i pozzetti di raccolta secondo necessità per raccogliere le cellule selezionate e chiuderli il prima possibile per ridurre al minimo l'evaporazione.
- Se i campioni non possono essere misurati immediatamente, conservarli in contenitori sigillati a -80 °C per diversi giorni. Dopo lo scongelamento, sonicare i campioni per 5 minuti per garantire la completa risospensione dei metaboliti.
5. Misurazione LC-QQQ-MS
- Preparazione dei solventi LC
- Preparare la soluzione madre di acido medronico (100 mM): sciogliere 17,6 mg di acido medronico in 1 mL di H2O ultrapuro.
- Preparare il tampone A: sciogliere 1,92 g di carbonato di ammonio in 1 L di H2O ultrapuro e aggiungere 50 μL di soluzione madre di acido medronico.
- Preparare il tampone B: mescolare 50 mL di tampone con 450 mL di acetonitrile.
- Preparare la miscela per il test LC: mescolare 1 ppm ciascuno di leucina, isoleucina, AMP, ADP e ATP in acetonitrile 80:20: H2O ultrapuro.
NOTA: Le scorte di acido medronico possono essere conservate a -20 °C per diversi mesi; altri tamponi possono essere mantenuti a RT per 2 giorni.
- Metodo programmato LC-QQQ-MS
- Ottimizzare le impostazioni MS specifiche della mescola (ad esempio, l'energia di collisione) secondo le istruzioni del produttore. Per gli strumenti Agilent serie 6495, utilizzare le impostazioni nella Tabella supplementare 1.
- Ottimizza le impostazioni MS specifiche della sorgente in base alle istruzioni del produttore. Per gli strumenti con sorgente ESI riscaldata JetStream, utilizzare i seguenti parametri: temperatura del gas: 240 °C, flusso del gas: 15 L/min, nebulizzatore: 50 psi, temperatura del gas della guaina: 400 °C, flusso del gas della guaina: 11 L/min, tensione capillare: 2000 V, tensione dell'ugello: 300 V.
- Ottimizza le impostazioni delle ottiche a trasferimento ionico secondo le istruzioni del produttore. Per gli strumenti Agilent con ottica ionica iFunnel, utilizzare i seguenti parametri: RF ad alta pressione positiva: 110 V, RF ad alta pressione negativa: 90 V, RF a bassa pressione positiva: 80 V, RF a bassa pressione negativa: 60 V.
- Programmare il gradiente LC: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μL/min; Tempo di sosta 28 min. Temperatura della colonna: 35 °C.
- Configurare lo strumento LC-MS.
- Collegare la colonna cromatografica al vano colonna a temperatura controllata.
- Collegare i buffer ed eliminare tutte le linee.
- Eseguire almeno 4 campioni vuoti o campioni di pool per bilanciare la colonna.
- Eseguire la miscela di test LC per verificare le prestazioni cromatografiche. Assicurarsi che siano soddisfatti i seguenti criteri. In caso contrario, pulire o risolvere i problemi dello strumento prima di eseguire i campioni.
- Verificare che la contropressione iniziale sia <150 bar e che la contropressione massima sia <400 bar.
- Verificare che i tempi di ritenzione siano in una finestra di ±1 minuto come segue: isoleucina 6,0 min, leucina 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min e ATP 12,7 min.
- Assicurarsi che la valle tra leucina e isoleucina nella transizione +132->86 sia < 20 % dell'altezza del picco.
- Assicurarsi che la differenza tra il tempo di ritenzione AMP e ADP sia compresa tra 1,5 e 1,9 minuti e la differenza tra il tempo di ritenzione ADP e ATP sia compresa tra 1,1 e 1,9 minuti.
- Impostare l'elenco di lavoro
- Iniziare con un campione bianco per ridurre al minimo il carry-over dalla miscela di test LC.
- Eseguire i campioni in ordine casuale.
- Termina con un campione vuoto per pulire la colonna per esperimenti futuri.
6. Pre-elaborazione dei dati in automRm
NOTA: i passaggi seguenti illustrano la conversione da .d a .mzML in msconvert, la preparazione di metabdb, il caricamento di dati e modelli e metabdb e le strategie generali per la revisione manuale dei picchi.
- Converti i dati grezzi dal formato .d al formato .mzML utilizzando ProteoWizard20 con le seguenti impostazioni: precisione di codifica binaria: 32 bit, livelli MS 1-2, indice di scrittura selezionato, Usa compressione zlib selezionato.
- Avviare R.
- Installare automRm21 secondo la documentazione della confezione (richiesto solo una volta prima del primo utilizzo).
- Avvia la GUI di automRm in R: automRm::automrm_gui()
- Elabora il batch di file .d nella scheda Elabora > Elabora batch.
- Selezionare .xlsx file contenente le informazioni sui metaboliti. Questo file deve corrispondere al metodo LC-QQQ-MS.
- Selezionare. File RData contenente il modello ML di prelievo dei picchi.
- Selezionare. RData contenente il modello di Machine Learning per la creazione di report di picco.
- Selezionare la cartella del progetto contenente i file .mzML.
- Avviare la pre-elaborazione dei dati facendo clic su Elabora batch.
- Al termine della pre-elaborazione, aprire peakoverview.pdf per verificare la corretta rilevazione dei picchi cromatografici. Facoltativamente, caricare il file automRmdata_Review.RData dalla scheda Review della GUI di automRm per modificare manualmente il filtraggio e l'integrazione dei picchi.
- Apri il peakinfo.xlsx dalla cartella del progetto e controlla i dati.
- Controllare il segnale standard interno 13C nella scheda 13CArea: Assicurarsi che non vi siano differenze sistematiche nei valori di intensità tra i gruppi sperimentali e tra i campioni di cellule e i campioni di detriti. Se tali differenze esistono, utilizzare solo i dati delle schede NormArea o NormHeight per l'analisi successiva; in caso contrario, utilizzare i dati delle schede RawArea o RawHeight.
- Controllare l'intensità del segnale degli standard interni ATA e CLF nella scheda RawArea. Assicurarsi che non vi siano differenze sistematiche nell'intensità di entrambi i composti tra i gruppi sperimentali.
- Per ciascun metabolita, confrontare l'intensità del segnale dei campioni contenenti cellule con i campioni di detriti della stessa sospensione cellulare. Utilizzare un test statistico appropriato per identificare i metaboliti in cui i campioni contenenti cellule hanno intensità più elevate rispetto ai campioni di detriti. Includere solo i metaboliti che superano questo test nell'analisi successiva dei dati.
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Representative Results
Il sorting FACS consente l'isolamento di popolazioni pulite di diversi tipi di cellule dalla stessa sospensione cellulare (Figura 2 e Figura 3). La specificità di questo metodo si basa sulla colorazione dei diversi tipi di cellule con specifici marcatori di superficie (ad esempio, cellule B e cellule T della milza) o combinazioni specifiche di marcatori di superficie (ad esempio HSC e MPP). La colorazione dei marcatori intracellulari richiede in genere la permeabilizzazione della membrana cellulare. Ciò può causare la fuoriuscita di metaboliti e quindi questo tipo di colorazione non è adatto per essere utilizzato in questo protocollo.
La LC fornisce la separazione dei metaboliti prima del rilevamento da parte della SM (Figura 4). I metaboliti eluiscono dalla colonna HILIC approssimativamente ordinati in base alla polarità, con meno composti polari che eluiscono presto e più metaboliti polari che eluiscono più tardi. L'intensità del segnale è determinata dalla quantità di un metabolita bersaglio nel campione e da un fattore di risposta metabolita-specifico. Di conseguenza, le intensità del segnale non possono essere confrontate in modo significativo tra i metaboliti, ma solo per un metabolita in tutti i campioni. I 3 picchi evidenziati in Figura 4 rappresentano 1: la niacinamide viene rilevata sia nei detriti che nell'estratto cellulare, anche se a livelli diversi, 2: acetil-carnitina che viene rilevata quasi esclusivamente negli estratti cellulari, e 3: l'acido aminoterefatico standard interno che viene rilevato allo stesso livello nei campioni di detriti e negli estratti cellulari.
Le differenze metaboliche tra i tipi di cellule dello stesso tessuto sono preservate utilizzando il protocollo combinato FACS-LC-MS (Figura 5). Per le HSC e le MPP, le cellule di 6 topi sono state necessarie per generare 6 campioni, portando a una maggiore variabilità all'interno di ciascun gruppo rispetto alle cellule B e alle cellule T, che sono state selezionate dalla stessa milza murina. I campioni di detriti che rappresentano campioni di controllo in bianco di processo sono chiaramente separati dai campioni contenenti estratti cellulari. All'interno dei campioni di detriti, è visibile una chiara separazione dei due esperimenti, evidenziando la differenza nell'ambiente metabolico che le cellule sperimentano prima dell'ordinamento. Quando viene rappresentata in una mappa di calore raggruppata (Figura 6), diventano visibili informazioni aggiuntive, come i livelli relativi di metaboliti nei campioni.
Figura 1: Panoramica dei passaggi chiave del protocollo presentato. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Schoenberger et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento di popolazioni pure di cellule B e cellule T dalla milza. Gli eventi di cellule e detriti sono stati selezionati in base ai segnali di dispersione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC). Le cellule B e le cellule T sono state selezionate in base ai segnali di colorazione specifici del tipo di cellula. Questa figura è stata adattata con il permesso di Schoenberger et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Isolamento di HSC e MPP dal midollo osseo. Gli eventi di cellule e detriti sono stati selezionati in base ai segnali di dispersione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC). Le popolazioni di HSC e MPP sono state selezionate in base a più stadi di segnali di colorazione specifici per tipo di cellula. Questa figura è stata adattata con il permesso di Schoenberger et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempi di cromatogrammi. Campioni con (A) 5000 HSC e (B) 5000 eventi di detriti dello stesso tipo. Si noti che l'asse condivide la stessa scala in entrambi i pannelli. I metaboliti evidenziati sono 1: nicotinamide, 2: acetil-carnitina, 3: acido aminotereftalico (ATA). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi delle componenti principali (PCA) dei profili metabolici di diversi tipi di cellule e campioni di detriti di fondo provenienti dagli stessi esperimenti. Si osserva una maggiore separazione tra i diversi organi e i campioni di fondo dei detriti da qualsiasi organo. Inoltre, i tipi di cellule sono chiaramente separati all'interno delle cellule di ciascun organo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Mappa di calore che rappresenta i metaboliti misurati su diversi tipi di cellule e i campioni di controllo di fondo corrispondenti (detriti). I valori mancanti sono stati imputati con il valore minimo dimezzato dello stesso metabolita in tutti i campioni. Per il tracciato, i dati sono stati normalizzati al massimo separatamente in ogni riga. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1: La tabella elenca le impostazioni specifiche del composto per i metaboliti selezionati, tra cui il tempo di ritenzione (RT), la polarità (Pol), il precursore m/z (Q1), il frammento m/z (Q3) e l'energia di collisione (CE). Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
I passaggi più critici per un'implementazione di successo della metabolomica mirata utilizzando questo protocollo sono 1) una robusta strategia di colorazione e gating che produrrà popolazioni cellulari pulite 2) una gestione precisa dei volumi di liquido, 3) una tempistica riproducibile di tutte le fasi sperimentali, in particolare tutte le fasi precedenti all'estrazione del metabolita. Idealmente, tutti i campioni appartenenti a un esperimento dovrebbero essere processati e misurati in un lotto per ridurre al minimo gli effetti del lotto22. Per esperimenti più ampi, suggeriamo di raccogliere estratti cellulari a -80 °C e quindi misurare tutti gli estratti in un unico lotto.
Quando si lavora con campioni a basso input, è necessario sottolineare la manipolazione pulita di tutti i materiali utilizzati nel corso degli esperimenti23. Le contaminazioni più comuni sono i tamponi residui, i detergenti e i prodotti per la cura della pelle. La misura più importante per ridurre al minimo la contaminazione è l'uso di guanti adatti durante l'esperimento.
Per ridurre al minimo le potenziali alterazioni nella composizione dei metaboliti dovute all'esposizione delle cellule a condizioni non fisiologiche, è fondamentale preparare i campioni su ghiaccio e con reagenti freddi (4 °C). Inoltre, essere il più veloci possibile prima della fase FACS aumenterà la qualità della misurazione2. I tempi indicati per la colorazione degli anticorpi sono i più brevi possibili per una buona efficienza di colorazione. Un ulteriore passaggio per bloccare il legame aspecifico degli anticorpi ai recettori Fc utilizzando anticorpi Fc-block potrebbe essere aggiunto prima della procedura di colorazione FACS 24,25. Ciò previene la contaminazione delle popolazioni di cellule bersaglio ed è particolarmente consigliabile quando si lavora con sospensioni cellulari che includono molti tipi di cellule ad alto recettore Fc (come monociti o macrofagi) o cellule che sono state coltivate senza siero. Tuttavia, aumenterà il tempo di manipolazione complessivo di 10-15 minuti e quindi potrebbe aggiungere ulteriore variabilità non fisiologica ai risultati.
Con l'uso di metodi MRM dinamici sui moderni spettrometri di massa, tutti i metaboliti elencati nelle impostazioni specifiche del composto possono essere registrati con una singola iniezione. La limitazione del numero di metaboliti target consente l'implementazione del protocollo descritto sugli spettrometri di massa più vecchi e accelera la pre-elaborazione e l'analisi dei dati.
Un certo livello di segnale di fondo nei dati LC-MS è inevitabile. Pertanto, è necessario prestare molta attenzione all'identificazione di quei metaboliti che possono essere rilevati al di sopra dello sfondo. L'ordinamento di eventi troppo piccoli per rappresentare cellule intatte (detriti) genera campioni vuoti di processo rilevanti che rappresentano le intensità del segnale di fondo dipendenti dalla matrice. Inoltre, le norme interne consentono di individuare campioni problematici che dovrebbero essere esclusi da un'ulteriore analisi dei dati26. Entrambe le misure di garanzia della qualità funzionano meglio se è disponibile un numero sufficientemente elevato di repliche. È consigliabile usare almeno sei repliche per gruppo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la struttura animale del Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics per aver fornito gli animali utilizzati in questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
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