Summary
Her presenterer vi en protokoll for nøyaktig og pålitelig måling av metabolitter i sjeldne celletyper. Tekniske forbedringer, inkludert en modifisert hylstervæske for cellesortering og generering av relevante blanke prøver, muliggjør en omfattende kvantifisering av metabolitter med en inngang på bare 5000 celler per prøve.
Abstract
Cellulær funksjon avhenger kritisk av metabolisme, og funksjonen til de underliggende metabolske nettverkene kan studeres ved å måle mellomprodukter fra små molekyler. Imidlertid har oppnåelse av nøyaktige og pålitelige målinger av cellulær metabolisme, spesielt i sjeldne celletyper som hematopoietiske stamceller, tradisjonelt krevd samling av celler fra flere dyr. En protokoll gjør det nå mulig for forskere å måle metabolitter i sjeldne celletyper ved å bruke bare en mus per prøve, mens de genererer flere replikater for mer rikelig celletyper. Dette reduserer antall dyr som kreves for et gitt prosjekt. Protokollen som presenteres her innebærer flere viktige forskjeller i forhold til tradisjonelle metabolomics-protokoller, for eksempel bruk av 5 g / L NaCl som skjede væske, sortering direkte i acetonitril og bruk av målrettet kvantifisering med streng bruk av interne standarder, noe som muliggjør mer nøyaktige og omfattende målinger av cellulær metabolisme. Til tross for tiden som kreves for isolering av enkeltceller, fluorescerende farging og sortering, kan protokollen i stor grad bevare forskjeller mellom celletyper og medikamentelle behandlinger.
Introduction
Metabolisme er en viktig biologisk prosess som forekommer i alle levende celler. Metabolske prosesser involverer et stort nettverk av biokjemiske reaksjoner som er tett regulert og sammenkoblet, slik at celler kan produsere energi og syntetisere essensielle biomolekyler1. For å forstå funksjonen til metabolske nettverk, måler forskere nivåene av mellomprodukter av små molekyler i celler. Disse mellomproduktene tjener som viktige indikatorer på metabolsk aktivitet og kan avsløre kritisk innsikt i cellulær funksjon.
Massespektrometri (MS) er det mest populære valget for spesifikk påvisning av metabolitter i komplekse prøver 1,2. Kjernemagnetisk resonans (NMR) har fordeler i absolutt kvantifisering av forbindelser og strukturoppklaring, men MS kan ofte løse flere komponenter i komplekse blandinger som biofluider eller celleekstrakter. Oftere enn ikke kombineres MS med tidligere separasjon av forbindelsen ved kapillær elektroforese (CE), gasskromatografi (GC) eller væskekromatografi (LC)3. Valget av separasjonsplattform er for det meste drevet av utvalget av målmetabolitter og typen prøve, og i en reell setting av tilgjengeligheten av maskiner og ekspertise. Alle tre separasjonsplattformene har et bredt og overlappende utvalg av egnede metabolitter, men forskjellige begrensninger. Kort fortalt kan CE bare skille ladede molekyler og krever mye kompetanse for å gjennomføre robust analyse av et stort antall prøver4. GC er begrenset til molekyler som er små og apolære nok til å fordampe før de brytes ned3. Tatt i betraktning alle kommersielt tilgjengelige LC-kolonner, kan alle to metabolitter separeres ved hjelp av denne teknologien5. Imidlertid viser mange LC-metoder mindre oppløsningsevne enn CE- eller GC-metoder av tilsvarende lengde.
Den typiske mengden utgangsmateriale for metabolomikkmålinger er vanligvis i området 5 x 105 til 5 x 107 celler per prøve, 5-50 mg vått vev eller 5-50 μL kroppsvæske6. Det kan imidlertid være utfordrende å få tak i slike mengder utgangsmateriale når man arbeider med primærceller av sjeldne celletyper, som for eksempel hematopoietiske stamceller (HSC) eller sirkulerende tumorceller. Disse cellene er ofte til stede i svært lave antall og kan ikke dyrkes uten at det går på bekostning av kritiske cellulære egenskaper.
HSC og multipotente stamceller (MPP) er de minst differensierte cellene i det hematopoietiske systemet og produserer kontinuerlig nye blodceller gjennom en organismes liv. Reguleringen av hematopoiesis er av klinisk relevans i forhold som leukemi og anemi. Til tross for deres betydning er HSC og MPP blant de sjeldneste cellene i det hematopoietiske systemet. Fra en enkelt mus kan vanligvis ca. 5000 HSC-er isoleres 7,8,9. Siden tradisjonelle metabolomics-metoder krever mer inngangsmateriale, var det ofte nødvendig å samle celler fra flere mus for å analysere sjeldne celletyper10,11.
Her hadde vi som mål å utvikle en protokoll som muliggjør måling av metabolitter i så lite som 5000 celler per prøve for å muliggjøre generering av metabolomics-data fra HSC-ene til en enkelt mus12. Samtidig tillater denne metoden å generere flere replikater fra en enkelt mus for mer tallrike celletyper som lymfocytter. Denne tilnærmingen reduserer antall dyr som kreves for et gitt prosjekt, og bidrar dermed til "3R" (reduksjon, erstatning, forfining) av dyreforsøk.
Metabolitter i celler kan ha svært høye omsetningshastigheter, ofte i størrelsesordensekunder 13. Imidlertid kan forberedelse av prøver for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ta timer, og FACS-sortering i seg selv kan ta minutter til timer, noe som fører til potensielle endringer i metabolomet på grunn av ikke-fysiologiske forhold. Noen av reagensene som brukes i denne protokollen (slik som ammoniumklorid-kalium [ACK] lysisbuffer) kan ha lignende effekter. Disse forholdene kan forårsake cellulær stress og påvirke nivåene og forholdene mellom metabolitter i celler, noe som fører til unøyaktige eller partiske målinger av cellulær metabolisme 14,15,16. De metabolske endringene på grunn av prøvepreparering blir noen ganger referert til som sorteringsartefakter. Lange fordøyelsesprotokoller og sterke reagenser som kan være nødvendige for å produsere enkeltcellesuspensjoner fra hardt eller tøft vev, kan forverre dette problemet. Hvilke endringer som kan oppstå, avhenger sannsynligvis av celletype og behandlingstilstand. Den nøyaktige naturen til endringene forblir ukjent, da den metabolske tilstanden til de uforstyrrede cellene i levende vev ikke kan måles.
Protokollen som presenteres her innebærer flere viktige forskjeller sammenlignet med tradisjonelle metoder, nemlig bruk av 5 g / L NaCl som hylstervæske, sortering direkte i ekstraksjonsbuffer, injisering av store prøvevolumer på hydrofil interaksjon væskekromatografi-massespektrometri (HILIC-MS), og bruk av målrettet kvantifisering, streng bruk av interne standarder og bakgrunnskontroller (figur 1). Denne protokollen har potensial til å bevare forskjeller mellom celletyper og mellom medikamentell behandling og kjøretøykontroll i stor grad12. Selv for dyrkede celler sammenligner den seg gunstig med alternative tilnærminger, for eksempel den mer etablerte sentrifugeringen og manuell fjerning av supernatant. Siden sortering av artefakter fortsatt kan forekomme, må data tolkes med forsiktighet. Til tross for denne begrensningen representerer protokollen en betydelig forbedring innen metabolsk profilering, noe som muliggjør mer nøyaktige og omfattende målinger av cellulær metabolisme i sjeldne primærceller12.
Evnen til å robust måle brede metabolske profiler i sjeldne primærceller åpner døren for nye eksperimenter i biomedisinsk forskning som involverer disse cellene. For eksempel har metabolsk mediert regulering i HSC vist seg å påvirke dvalens selvfornyelseskapasitet, med implikasjoner for anemi og leukemi11,17. I pasientavledede sirkulerende tumorceller er forskjeller i uttrykket av metabolske gener mellom tumor og tilstøtende celler vist18,19. Denne protokollen tillater nå forskere å studere disse forskjellene systematisk på et metabolsk nivå, som generelt anses som nærmere den cellulære fenotypen enn genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avl og oppdrett av alle mus som ble brukt til denne protokollen ble utført i et konvensjonelt dyreanlegg ved Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics (MPI-IE) i henhold til forskriftene fra de lokale myndighetene (Regierungspräsidium Freiburg). Mus ble avlivet med CO2 og cervical dislokasjon av FELASA B-trent personell etter retningslinjer og forskrifter godkjent av dyrevelferdskomiteen i MPI-IE og de lokale myndighetene. Ingen dyreforsøk ble utført, og mus var uten helsebelastninger.
MERK: Svært følsomme analysemetoder som LC-MS-metoden som brukes i denne protokollen, har potensial til å oppdage selv svært små forurensninger i prøven. Derfor er det av største betydning å minimere slike forurensninger. Det aller viktigste tiltaket er å bruke rene hansker når man berører noe som kommer i kontakt med prøvene. Dette inkluderer for eksempel klargjøring av buffere og hylstervæske, merking av prøverør og rengjøring av laboratorieutstyr. Videre bør engangslabware brukes når det er mulig. Glassvarer skal skylles med løsemidler av LC-MS-kvalitet før bruk. Et rent arbeidsmiljø bidrar ytterligere til å redusere forurensninger.
1. Generelle forberedelser
- Forbered intern standard stamløsning: Tilbered 6 mg/ml klorfenylalanin (CLF) og 6 mg/ml aminoteeftalsyre (ATA) i 30% v/v 2-propanol i ultrarent vann.
- Forbered FACS resuspensjonsbuffer: Tilsett 0,9 g NaCl, 99,5 ml ultrarent vann og 0,5 ml intern standard stamløsning. Forkjøl til 4 °C.
- Forbered kappevæske: Løs opp 30 g NaCl i 6 liter avionisert vann i en kappevæsketank og koble til en cellesorterer.
MERK: Konsentrasjonen av NaCl i hylstervæsken er optimalisert for å tillate avbøyning av dråper i sortereren som er like robust som ved bruk av PBS som kappevæske og samtidig for å minimere negative effekter på metabolittdeteksjon av LC-MS12. Lavere konsentrasjoner av NaCl er fordelaktig for metabolittdeteksjon, men svekker den robuste sorteringen av celler.
2. Isolering av B- og T-celler fra milten
- Forkjøl 90 ml fosfatbufret saltvann (PBS) per mus i kjøleskap eller på is til 4 °C. Forkjøl en sentrifuge til 4 °C.
- Isolering av milt
MERK: Det er mest kritisk å arbeide raskt, på is og med kalde (4 °C) buffere under celleisolering og følgende fargetrinn. Ellers kan den metabolske profilen til celler endres betydelig.- Klargjør 1,5 ml PBS i et 2 ml reaksjonsrør på is.
- Avlive en C57BL6/J-mus i henhold til retningslinjene og metodene som er godkjent av lokale myndigheter.
- Steriliser pels med 70% etanol.
- Åpne magen med saks og fjern milten ved hjelp av fine tang uten å briste orgelet. Sett milten umiddelbart i kald PBS (4 °C).
- Generering av en encelle suspensjon
- Plasser en 70 μm cellesil på et 50 ml sentrifugerør og fukt den med PBS. Før milten gjennom nettet ved hjelp av tommelstøtten på et sprøytestempel og 30 ml kald PBS (4 °C)
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml ACK lysisbuffer og inkuber i 2 minutter ved romtemperatur (RT; 20 °C).
- Tilsett 50 ml kald PBS (4 °C). Sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter og kast supernatanten.
- FACS-farging
- Forbered antistoffcocktailen i 500 μL kald PBS (4 °C) per mus: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Resuspender cellepelleten i antistoffcocktailen. Overfør til et 5 ml FACS-rør. Rug i 30 minutter ved 4 °C i mørket.
- Tilsett 3 ml kald PBS (4 °C). Sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml kald FACS-reuspensjonsbuffer (4 °C). Filtrer cellene gjennom et FACS-rør med filterhette. Cellene er klare for flowcytometribasert sortering.
3. Isolering av HSC og MPP fra benmarg
- Dissekere og isolere benmargen.
MERK: Det er mest kritisk å jobbe raskt og holde isolerte bein og cellene kalde (4 ° C) under hele prosedyren for å tillate nøyaktige resultater. Videre, for å minimere bakgrunnssignaler, arbeid og bruk et rent rom og laboratorieutstyr.- Avlive mus i henhold til retningslinjer og metoder godkjent av lokale myndigheter.
- Spray 70% etanol på den nedre delen av musene.
- Dissekere bena og ryggradene ved hjelp av saks. Lag et snitt på ryggen og forleng kuttet rundt til magen. Skal huden fra bakre lemmer.
- Riv eller kutt bakre lemmer av, og sørg for at bena inneholder tibia, lårben og hofteledd.
- Ta saksen og klipp dem tett sammen med ryggraden til den er helt fjernet.
- Fordel bena og piggene i 6-brønnsplater som inneholder kald PBS (4 °C) og hold platene på is.
- Rengjør lårbenet, tibia, hofteleddet og ryggvirvlene i bløtvev ved hjelp av en skalpell og saks.
- Knus de rensede beinene med en morter og støt i 5 ml kald PBS (4 °C).
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 μm cellesil i et 50 ml rør.
- Gjenta trinn 3.1.8-3.1.9 til beinene ser helt hvite ut.
- Lysis av erytrocytter:
- Sentrifuger den slaktede cellesuspensjonen ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml kald ACK-buffer (4 °C). Inkuber i 5 minutter på is.
- Tilsett kald PBS (4 °C) for å stoppe reaksjonen (valgfritt).
- Sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Uttømming av avstamning:
MERK: For å berike for avstamningsnegative (Lin-) celler ble det brukt et negativt seleksjonssett for CD4-celler.- Forbered magnetkulene:
- Tilsett 500 μL perler i 2 ml mikrosentrifugerør. Plasser rørene på en magnet og kast supernatanten.
- Vask kulene med 1 ml kald PBS (4 °C) og kast supernatanten.
- Tilsett 500 μL kald PBS (4 °C) og hold kulene kalde (4 °C).
- Inkuber cellene med 500 μL avstamningscocktail (50 μL antistoff levert av settet + 450 μL PBS) i 25 minutter (risting, 4 °C) i mørket.
- Vask cellene med kald PBS (4 °C).
- Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspender cellene i 1000 μL kald PBS (4 °C) og overfør cellesuspensjonen til perleoppløsningen.
- Inkuber i 15 minutter på et roterende hjul ved 4 °C.
- Plasser rørene på en magnet og vent til løsningen klarner. Overfør supernatanten til et nytt FACS-rør.
- Vask perlene med 500 μL PBS.
- Plasser rørene på en magnet og vent til løsningen klarner.
- Overfør supernatanten til det ferske FACS-røret.
- Sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Forbered magnetkulene:
- Farging for FACS
- Tilbered 300 mikrol antistoffblanding per mus i kald PBS (4 °C).
- Antistoffblanding for stam-/stamceller: HSC: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-sett - PE(1:1000), Sca1 - APC-CY7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
- Inkuber cellene i 40 minutter i mørket ved 4 °C.
- Vask med 1 ml kald PBS (4 °C). Sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Suspender cellepelleten på nytt i 1 ml FACS-resuspensjonsbuffer og filtrer cellene gjennom et FACS-rør med filterhette.
4. FACS-sortering
- Sett opp cellesorteringen.
- Sett inn 70 μm dysespiss. Aktiver lasere på 405 nm, 488 nm, 561 nm og 633 nm.
- Sett sorteringsmodus til 4-veis renhet: flytemaske 0, renhetsmaske 32, fasemaske 0
- Sett fallfrekvensen til 90 400 Hz, og juster amplitude og slippforsinkelse i henhold til produsentens instruksjoner. Sett platespenning til 5000 V.
- Definer sorteringsporter i henhold til produsentens instruksjoner.
- For alle celletyper velger du først enkeltceller basert på foroverpunkt- og sidesprengsignal, etterfulgt av valg basert på celletypespesifikk farging.
- For B-celler, velg den AF647-positive, PE-negative populasjonen.
- For T-celler, velg den PE-positive, AF647-negative populasjonen.
- For HSC-er, velg PE-Cy7-lav, PE-positiv, APC-Cy7-positiv, BV605-positiv, BV421-negativ populasjon.
- For MPP-er velger du populasjonen PE-Cy7-lav, PE-positiv, APC-Cy7-positiv, BV421-positiv, BV605-negativ.
- For ruskprøver velger du hendelser som er for små til å representere intakte celler basert på foroverspredning og spredningssignal sidelengs. Typiske FACS-plott som viser disse gating-strategiene er vist i figur 2 og figur 3.
- Juster strømningshastigheten for å oppnå mindre enn 15 000 hendelser/er.
- Forbered oppsamlingsplate
- Forbered gjærekstraktløsning: Resuspender 1 alikot av 13C gjærekstrakt i 7,5 ml ultrarenH2Oog 2,5 ml metanol.
- Forbered ekstraksjonsbuffer: Tilsett 10 μL 13C gjærekstraktstamløsning til 10 ml acetonitril og bland.
- Forbered oppsamlingsplate: Tilsett 25 μL av ekstraksjonsbufferen til hver brønn på en 96 brønns PCR-plate som skal brukes til å samle prøven. For å minimere fordampning, dekk brønner med PCR-lokk (striper kuttet i singleter).
- Utfør cellesorteringen.
- Åpne samlingsbrønnene etter behov for å samle sorterte celler og lukke dem så snart som mulig for å minimere fordampning.
- Hvis prøvene ikke kan måles umiddelbart, oppbevares de i lukkede beholdere ved -80 °C i flere dager. Etter tining, sonicate prøvene i 5 minutter for å sikre fullstendig resuspensjon av metabolitter.
5. LC-QQQ-MS-måling
- Forbered LC-løsningsmidler
- Klargjør medronsyreoppløsning (100 mM): Løs opp 17,6 mg medronsyre i 1 ml ultrarenH2O.
- Forbered buffer A: Løs opp 1,92 g ammoniumkarbonat i 1 liter ultrarenH2O, og tilsett 50 μL medronsyreoppløsning.
- Forbered buffer B: Bland 50 ml buffer med 450 ml acetonitril.
- Forbered LC-testblanding: Bland 1 ppm hver av leucin, isoleucin, AMP, ADP og ATP i 80:20 acetonitril: ultraren H2O.
MERK: Medronsyre kan oppbevares ved -20 °C i flere måneder. andre buffere kan holdes på RT i 2 dager.
- Program LC-QQQ-MS metode
- Optimaliser sammensatte spesifikke MS-innstillinger (f.eks. kollisjonsenergi) i henhold til produsentens instruksjoner. For instrumenter i Agilent 6495-serien bruker du innstillingene i tilleggstabell 1.
- Optimaliser kildespesifikke MS-innstillinger i henhold til produsentens instruksjoner. For instrumenter med JetStream oppvarmet ESI-kilde, bruk følgende parametere: gasstemperatur: 240 °C, gasmengde: 15 l / min, forstøver: 50 psi, kappegasstemperatur: 400 ° C, kappegasstrøm: 11 l / min, kapillærspenning: 2000 V, dysespenning: 300 V.
- Optimaliser innstillingene for ionoverføringsoptikk i henhold til produsentens instruksjoner. For Agilent-instrumenter med iFunnel-ionoptikk, bruk følgende parametere: høytrykks RF positiv: 110 V, høytrykks RF negativ: 90 V, lavtrykks RF positiv: 80 V, lavtrykks RF negativ: 60 V.
- Programmer LC-gradienten: 0 min, 95 % B, 150 μL/min; 18 min, 55 % B, 150 μL/min; 19 min, 30 % B, 150 μL/min; 21,5 min, 30 % B, 150 μL/min; 22 min, 95 % B, 150 μL/min; 22,7 min, 95 % B, 200 μL/min, 23,5 min, 95 % B, 400 μL/min; Stopptid 28 min. Kolonnetemperatur: 35 °C.
- Sett opp LC-MS-instrumentet.
- Koble kromatografisk kolonne i det temperaturkontrollerte kolonnerommet.
- Koble bufferne og tøm alle linjer.
- Kjør minst 4 tomme prøver eller bassengprøver for å balansere kolonnen.
- Kjør LC-testmiks for å kontrollere kromatografisk ytelse. Kontroller at følgende kriterier er oppfylt. Hvis ikke, rengjør eller feilsøk instrumentet før du kjører prøvene.
- Bekreft at starttrykket er <150 bar og maksimalt mottrykk er <400 bar.
- Bekreft at retensjonstidene er i et vindu på ±1 min som følger: isoleucin 6,0 min, leucin 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min og ATP 12,7 min.
- Sørg for at dalen mellom leucin og isoleucin i overgangen +132->86 er < 20 % av topphøyden.
- Sørg for at forskjellen i retensjonstid AMP til ADP er 1,5 til 1,9 min, og forskjellen i retensjonstid ADP til ATP er 1,1 til 1,9 min.
- Sett opp arbeidsliste
- Start med en tom prøve for å minimere overføring fra LC-testblandingen.
- Kjør eksemplene i tilfeldig rekkefølge.
- Avslutt med en tom prøve for å rense kolonnen for fremtidige eksperimenter.
6. Forhåndsbehandling av data i automRm
MERK: Følgende trinn diskuterer konvertering fra .d til .mzML i msconvert, klargjøring av metabdb, lasting av data og modeller og metabdb, og generelle strategier for manuell toppgjennomgang.
- Konverter rådata fra .d-format til .mzML-format ved hjelp av ProteoWizard20 med følgende innstillinger: binær kodingspresisjon: 32-bit, MS-nivå 1-2, skriveindeks valgt, Bruk zlib-komprimering valgt.
- Start R.
- Installer automRm21 i henhold til pakningsdokumentasjonen (kun nødvendig en gang før første gangs bruk).
- Start automRm GUI i R: automRm::automrm_gui()
- Behandle bunken med .d-filer i fanen Prosess > Prosess Batch.
- Velg .xlsx fil som inneholder metabolittinformasjonen. Denne filen må samsvare med LC-QQQ-MS-metoden.
- Velge. RData-fil som holder ML-modell for toppplukking.
- Velge. RData-fil som inneholder ML-modellen for topprapportering.
- Velg prosjektmappen som inneholder .mzML-filer.
- Start forhåndsbehandling av data ved å klikke på Behandle parti.
- Etter at forbehandlingen er ferdig, åpner du peakoverview.pdf for å kontrollere riktig deteksjon av kromatografiske topper. Du kan også laste inn automRmdata_Review.RData fra Se gjennom-fanen i automRm GUI for å manuelt endre toppfiltrering og toppintegrering.
- Åpne peakinfo.xlsx fra prosjektmappen og kontroller dataene.
- Sjekk 13C internt standardsignal i fanen 13CArea: Sørg for at det ikke er systematiske forskjeller i intensitetsverdiene mellom eksperimentelle grupper og mellom celleprøver og ruskprøver. Hvis slike forskjeller finnes, bruk bare data fra fanene NormArea eller NormHeight for senere analyse; Hvis ikke, bruker du data fra fanene RawArea eller RawHeight.
- Kontroller signalintensiteten til interne standarder ATA og CLF i fanen RawArea. Sørg for at det ikke er noen systematiske forskjeller i intensiteten av noen av forbindelsene mellom eksperimentelle grupper.
- For hver metabolitt, sammenlign signalintensiteten til prøver som inneholder celler med ruskprøvene fra samme cellesuspensjon. Bruk en passende statistisk test for å identifisere metabolitter der prøver som inneholder celler har høyere intensitet enn ruskprøver. Inkluder kun metabolitter som består denne testen i påfølgende dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-sortering gjør det mulig å isolere rene populasjoner av forskjellige celletyper fra samme cellesuspensjon (figur 2 og figur 3). Spesifisiteten til denne metoden er avhengig av farging av de forskjellige celletypene med spesifikke overflatemarkører (for eksempel B-celler og T-celler fra milten) eller spesifikke kombinasjoner av overflatemarkører (for eksempel HSC og MPP). Farging av intracellulære markører krever vanligvis permeabilisering av cellemembranen. Dette kan forårsake lekkasje av metabolitter, og derfor er denne typen farging ikke egnet til å brukes i denne protokollen.
LC gir separasjon av metabolitter før deteksjon av MS (figur 4). Metabolitter eluerer fra HILIC kolonnen omtrent sortert etter polaritet, med mindre polare forbindelser som eluerer tidlig og flere polare metabolitter som eluerer senere. Signalintensiteten bestemmes av mengden av en målmetabolitt i prøven og en metabolittspesifikk responsfaktor. Følgelig kan signalintensiteter ikke meningsfullt sammenlignes på tvers av metabolitter, men bare for én metabolitt på tvers av prøver. De 3 toppene som er fremhevet i figur 4 representerer 1: niacinamid påvises i både rusk og celleekstrakt, om enn i forskjellige nivåer, 2: acetyl-karnitin som nesten utelukkende påvises i celleekstrakter, og 3: den interne standard aminoterefatsyren som påvises på samme nivå i ruskprøver og celleekstrakter.
Metabolske forskjeller mellom celletyper fra samme vev bevares ved hjelp av den kombinerte FACS-LC-MS-protokollen (figur 5). For HSC og MPP ble celler fra 6 mus pålagt å generere 6 prøver, noe som førte til en større variasjon innen hver gruppe sammenlignet med B-celler og T-celler, som ble sortert fra samme murine milt. Avfallsprøver som representerer prosessblanke kontrollprøver er tydelig skilt fra prøver som inneholder celleekstrakter. Innenfor ruskprøvene er en klar separasjon av de to eksperimentene synlig, og fremhever forskjellen i metabolsk miljø som cellene opplever før sorteringen. Når det representeres i et gruppert varmekart (figur 6), blir tilleggsinformasjon synlig, for eksempel de relative nivåene av metabolitter på tvers av prøver.
Figur 1: Oversikt over viktige trinn i den presenterte protokollen. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Schönberger et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Isolering av rene populasjoner av B-celler og T-celler fra milten. Hendelser med celler og rusk ble valgt basert på foroverspredningssignaler (FSC) og sidesprengningssignaler (SSC). B-celler og T-celler ble valgt basert på celletypespesifikke fargesignaler. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Schönberger et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Isolering av HSC og MPP fra benmarg. Hendelser med celler og rusk ble valgt basert på foroverspredningssignaler (FSC) og sidesprengningssignaler (SSC). HSC- og MPP-populasjoner ble valgt basert på flere stadier av celletypespesifikke fargesignaler. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Schönberger et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på kromatogrammer. Prøver med (A) 5000 HSCs og (B) 5000 debris hendelser av samme type. Legg merke til at aksen deler samme skala i begge panelene. Utvalgte metabolitter er 1: nikotinamid, 2: acetylkarnitin, 3: aminotereftalsyre (ATA). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Prinsipal komponentanalyse (PCA) av metabolske profiler av forskjellige celletyper og rusk bakgrunnsprøver fra de samme forsøkene. Major separasjon observeres mellom de forskjellige organene og rusk bakgrunnsprøver fra et hvilket som helst organ. I tillegg er celletyper tydelig separert i cellene i hvert organ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Varmekart som representerer metabolitter målt på tvers av forskjellige celletyper og matchende bakgrunnskontrollprøver (rusk). Manglende verdier ble imputert med halv minimumsverdi av samme metabolitt på tvers av alle prøver. For plotting ble data normalisert til maksimum separat i hver rad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Tabellen viser de forbindelsesspesifikke innstillingene for de valgte metabolittene, inkludert retensjonstid (RT), polaritet (Pol), forløper m/z (Q1), fragment m/z (Q3) og kollisjonsenergi (CE). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinnene for vellykket implementering av målrettet metabolomikk ved bruk av denne protokollen er 1) en robust farge- og gatingstrategi som vil gi rene cellepopulasjoner 2) presis håndtering av væskevolumer, 3) reproduserbar timing av alle eksperimentelle trinn, spesielt alle trinn før metabolittekstraksjon. Ideelt sett bør alle prøver som tilhører ett eksperiment behandles og måles i en batch for å minimere batcheffekter22. For større eksperimenter foreslår vi å samle celleekstrakter ved -80 ° C og deretter måle alle ekstrakter i en batch.
Ved arbeid med prøver med lav inngang skal det legges vekt på ren håndtering av alle materialer som brukes i løpet av forsøkene23. Vanlige forurensninger er restbuffer, vaskemidler og hudpleieprodukter. Det viktigste tiltaket for å minimere forurensning er bruk av egnede hansker gjennom hele forsøket.
For å minimere potensielle endringer i metabolittsammensetningen på grunn av eksponering av celler for ufysiologiske forhold, er det avgjørende å forberede prøvene på is og med kalde reagenser (4 °C) er avgjørende. Å være så rask som mulig før FACS-trinnet vil også øke kvaliteten på måling2. De angitte tidene for antistofffarging er så korte som rimelig for god fargeeffektivitet. Et ekstra trinn for å blokkere den uspesifikke bindingen av antistoffer mot Fc-reseptorer ved bruk av Fc-blokkantistoffer kan legges til før FACS-fargeprosedyren24,25. Dette forhindrer forurensning av målcellepopulasjonene og er spesielt tilrådelig når man arbeider med cellesuspensjoner som inkluderer mange Fc-reseptor høye celletyper (som monocytter eller makrofager) eller celler som ble dyrket uten serum. Det vil imidlertid øke den totale håndteringstiden med 10-15 minutter og kan derfor legge til ytterligere ikke-fysiologisk variasjon i resultatene.
Ved bruk av dynamiske MRM-metoder på moderne massespektrometre, kan alle metabolitter oppført i forbindelsesspesifikke innstillinger registreres med en enkelt injeksjon. Begrensning av antall målmetabolitter muliggjør implementering av den beskrevne protokollen på eldre massespektrometre og akselererer dataforbehandling og dataanalyse.
Et visst nivå av bakgrunnssignal i LC-MS-dataene er uunngåelig. Derfor må det utvises stor forsiktighet for å identifisere de metabolittene som kan detekteres over bakgrunnen. Sorteringshendelser som er for små til å representere intakte celler (rusk), genererer relevante prosessblanke prøver som representerer matriseavhengige bakgrunnssignalintensiteter. I tillegg tillater interne standarder identifisering av problematiske prøver som bør utelukkes fra videre dataanalyse26. Begge kvalitetssikringstiltakene fungerer best hvis et tilstrekkelig stort antall replikater er tilgjengelig. Vi anbefaler at du bruker minst seks replikater per gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke dyreavdelingen ved Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics for å gi dyrene som brukes i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
