Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para medir metabólitos de forma precisa e confiável em tipos celulares raros. Melhorias técnicas, incluindo um fluido de bainha modificado para a triagem celular e a geração de amostras em branco relevantes, permitem uma quantificação abrangente de metabolitos com uma entrada de apenas 5000 células por amostra.
Abstract
A função celular depende criticamente do metabolismo, e a função das redes metabólicas subjacentes pode ser estudada medindo pequenos intermediários de moléculas. No entanto, a obtenção de medidas precisas e confiáveis do metabolismo celular, particularmente em tipos raros de células, como células-tronco hematopoéticas, tradicionalmente requer o agrupamento de células de vários animais. Um protocolo agora permite que os pesquisadores meçam metabólitos em tipos raros de células usando apenas um camundongo por amostra, enquanto geram várias réplicas para tipos de células mais abundantes. Isso reduz o número de animais necessários para um determinado projeto. O protocolo aqui apresentado envolve várias diferenças importantes em relação aos protocolos metabolômicos tradicionais, tais como o uso de NaCl 5 g/L como fluido de bainha, a classificação direta em acetonitrila e a utilização de quantificação direcionada com uso rigoroso de padrões internos, permitindo medidas mais precisas e abrangentes do metabolismo celular. Apesar do tempo necessário para o isolamento de células únicas, coloração fluorescente e classificação, o protocolo pode preservar as diferenças entre os tipos celulares e tratamentos medicamentosos em grande medida.
Introduction
O metabolismo é um processo biológico essencial que ocorre em todas as células vivas. Os processos metabólicos envolvem uma vasta rede de reações bioquímicas que são fortemente reguladas e interligadas, permitindo que as células produzam energia e sintetizem biomoléculas essenciais1. Para entender a função das redes metabólicas, os pesquisadores medem os níveis de pequenas moléculas intermediárias dentro das células. Esses intermediários servem como importantes indicadores da atividade metabólica e podem revelar insights críticos sobre a função celular.
A espectrometria de massas (EM) é a escolha mais popular para a detecção específica de metabólitos em amostras complexas 1,2. A ressonância magnética nuclear (RMN) tem vantagens na quantificação absoluta de compostos e na elucidação da estrutura, mas a EM pode frequentemente resolver mais componentes em misturas complexas, como biofluidos ou extratos celulares. Na maioria das vezes, a EM é combinada com a separação prévia do composto por eletroforese capilar (CE), cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida (LC)3. A escolha da plataforma de separação é impulsionada principalmente pela gama de metabólitos alvo e pelo tipo de amostra e, em um cenário do mundo real, pela disponibilidade de máquinas e experiência. Todas as três plataformas de separação têm uma ampla e sobreposta gama de metabólitos adequados, mas limitações diferentes. Resumidamente, a CE só pode separar moléculas carregadas e requer muita experiência para implementar análises robustas de um grande número de amostras4. O CG é limitado a moléculas pequenas e apolares o suficiente para evaporar antes de se decomporem3. Considerando todas as colunas LC disponíveis comercialmente, quaisquer dois metabólitos podem ser separados por essa tecnologia5. No entanto, muitos métodos LC exibem menor poder de resolução do que os métodos CE ou GC de comprimento semelhante.
A quantidade típica de material de partida para medições metabolômicas está geralmente na faixa de 5 x 105 a 5 x 107 células por amostra, 5-50 mg de tecido úmido ou 5-50 μL de fluido corporal6. No entanto, pode ser um desafio obter tais quantidades de material de partida ao trabalhar com células primárias de tipos celulares raros, como, por exemplo, células-tronco hematopoéticas (CTHs) ou células tumorais circulantes. Essas células estão frequentemente presentes em números muito baixos e não podem ser cultivadas sem comprometer características celulares críticas.
As CTHs e as células progenitoras multipotentes (MPPs) são as células menos diferenciadas do sistema hematopoiético e produzem continuamente novas células sanguíneas ao longo da vida de um organismo. A regulação da hematopoese é de relevância clínica em condições como leucemia e anemia. Apesar de sua importância, as CTHs e MPPs estão entre as células mais raras do sistema hematopoético. De um único camundongo, tipicamente, cerca de 5000 CTHs podem ser isoladas 7,8,9. Como os métodos metabolômicos tradicionais requerem mais material de entrada, o agrupamento de células de múltiplos camundongos foi frequentemente necessário para analisar tipos celulares raros10,11.
Aqui, nosso objetivo foi desenvolver um protocolo que possibilitasse a mensuração de metabólitos em até 5000 células por amostra para possibilitar a geração de dados metabolômicos a partir das CTHs de um únicocamundongo12. Ao mesmo tempo, este método permite gerar múltiplas réplicas a partir de um único rato para tipos celulares mais abundantes, como os linfócitos. Esta abordagem reduz o número de animais necessários para um determinado projeto, contribuindo assim para o "3R" (redução, substituição, refinamento) de experimentos com animais.
Metabólitos em células podem ter taxas de turnover muito altas, muitas vezes da ordem de segundos13. No entanto, o preparo de amostras para a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) pode levar horas, e a própria classificação da FACS pode levar de minutos a horas, levando a possíveis alterações no metaboloma devido a condições não fisiológicas. Alguns dos reagentes usados neste protocolo (como tampão de lise amônio-cloreto de potássio [ACK]) podem ter efeitos semelhantes. Essas condições podem causar estresse celular e afetar os níveis e proporções de metabólitos dentro das células, levando a medidas imprecisas ou enviesadas do metabolismo celular 14,15,16. As alterações metabólicas devidas à preparação da amostra são por vezes referidas como artefatos de triagem. Longos protocolos de digestão e reagentes severos que podem ser necessários para produzir suspensões unicelulares a partir de tecidos duros ou resistentes podem agravar esse problema. As mudanças que podem ocorrer provavelmente dependem do tipo de célula e da condição de processamento. A natureza precisa das alterações permanece desconhecida, uma vez que o estado metabólico das células não perturbadas no tecido vivo não pode ser medido.
O protocolo aqui apresentado envolve várias diferenças importantes em relação aos métodos tradicionais, a saber, o uso de NaCl 5 g/L como fluido de bainha, a classificação diretamente em tampão de extração, a injeção de grandes volumes de amostra em cromatografia líquida-espectrometria de massas de interação hidrofílica (HILIC-MS), e a utilização de quantificação direcionada, uso rigoroso de padrões internos e controles de fundo (Figura 1). Esse protocolo tem o potencial de preservar diferenças entre os tipos celulares e entre o tratamento medicamentoso e o controle do veículo em grande medida12. Mesmo para células cultivadas, compara-se favoravelmente a abordagens alternativas, como a centrifugação mais estabelecida e a remoção manual do sobrenadante. No entanto, como os artefatos de classificação ainda podem ocorrer, os dados devem ser interpretados com cautela. Apesar dessa limitação, o protocolo representa uma melhora significativa no campo do perfil metabólico, permitindo medidas mais precisas e abrangentes do metabolismo celular em células primáriasraras12.
A capacidade de medir de forma robusta perfis metabólicos amplos em células primárias raras abre as portas para novos experimentos em pesquisas biomédicas envolvendo essas células. Por exemplo, foi demonstrado que a regulação metabolicamente mediada em HSCs afeta a capacidade de autorrenovação da dormência, com implicações para anemia e leucemia 11,17. Em células tumorais circulantes derivadas do paciente, diferenças na expressão de genes metabólicos entre células tumorais e adjacentes têm sido demonstradas18,19. Esse protocolo agora permite que os pesquisadores estudem essas diferenças sistematicamente em um nível metabólico, que geralmente é considerado mais próximo do fenótipo celular do que da expressão gênica.
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Protocol
A criação e criação de todos os camundongos utilizados para este protocolo foram conduzidos em um biotério convencional no Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética (MPI-IE) de acordo com as regulamentações das autoridades locais (Regierungspräsidium Freiburg). Os camundongos foram eutanasiados com CO2 e deslocamento cervical por pessoal treinado em FELASA B, seguindo diretrizes e regulamentos aprovados pelo comitê de bem-estar animal do IPM-IE e pelas autoridades locais. Nenhuma experimentação animal foi realizada, e os camundongos estavam sem encargos de saúde.
NOTA: Métodos analíticos altamente sensíveis, como o método LC-MS usado neste protocolo, têm o potencial de detectar até mesmo contaminações muito pequenas na amostra. Portanto, é de extrema importância minimizar tais contaminações. A medida mais importante é usar luvas limpas sempre que tocar em qualquer coisa que entre em contato com as amostras. Isso inclui, por exemplo, a preparação de tampões e fluido de bainha, rotulagem de tubos de amostra e limpeza de equipamentos de laboratório. Além disso, o material de laboratório de uso único deve ser usado sempre que possível. Os utensílios de vidro devem ser enxaguados com solventes de grau LC-MS antes do uso. Um ambiente de trabalho limpo ajuda ainda mais a reduzir as contaminações.
1. Preparações gerais
- Preparar solução-mãe padrão interna: Preparar 6 mg/mL de cloro-fenilalanina (CLF) e 6 mg/mL de ácido aminotereftálico (ATA) em 30% v/v 2-propanol em água ultrapura.
- Preparar tampão de ressuspensão FACS: Adicionar 0,9 g de NaCl, 99,5 mL de água ultrapura e 0,5 mL de solução-estoque padrão interno. Pré-arrefecer a 4 °C.
- Preparar o líquido da bainha: Em um tanque de fluido de bainha, dissolver 30 g de NaCl em 6 L de água deionizada e conectar a um classificador de células.
NOTA: A concentração de NaCl no fluido da bainha foi otimizada para permitir a deflexão de gotículas no classificador que é tão robusta quanto quando se usa PBS como fluido de bainha e, simultaneamente, para minimizar os efeitos negativos na detecção de metabólitos por LC-MS12. Concentrações mais baixas de NaCl são vantajosas para a detecção de metabólitos, mas prejudicam a classificação robusta das células.
2. Isolamento de células B e T do baço
- Pré-resfriar 90 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por camundongo em geladeira ou em gelo a 4 °C. Pré-resfriar uma centrífuga a 4 °C.
- Isolamento dos baços
NOTA: É mais crítico trabalhar rápido, no gelo e com buffers frios (4 °C) durante o isolamento celular e as seguintes etapas de coloração. Caso contrário, o perfil metabólico das células pode mudar consideravelmente.- Preparar 1,5 mL de PBS em um tubo de reação de 2 mL sobre gelo.
- Eutanásia de um rato C57BL6/J de acordo com as diretrizes e métodos aprovados pelas autoridades locais.
- Esterilizar peles com etanol 70%.
- Abra o abdômen com tesoura e retire o baço usando pinças finas sem romper o órgão. Colocar imediatamente o baço em PBS frio (4 °C).
- Geração de uma suspensão de célula única
- Coloque um filtro celular de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL e umedeça-o com PBS. Passar o baço através da malha utilizando o apoio do polegar de um êmbolo de seringa e 30 ml de PBS frio (4 °C)
- Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de lise ACK e incubar por 2 min à temperatura ambiente (TR; 20 °C).
- Adicionar 50 ml de PBS frio (4 °C). Centrifugar a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Coloração FACS
- Preparar o cocktail de anticorpos em 500 μL de PBS frio (4 °C) por rato: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Ressuspenda a pastilha de células no coquetel de anticorpos. Transfira para um tubo FACS de 5 mL. Incubar durante 30 min a 4 °C no escuro.
- Adicionar 3 ml de PBS frio (4 °C). Centrifugar a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet de células em 1 mL de tampão de ressuspensão FACS frio (4 °C). Filtre as células através de um tubo FACS com tampa de filtro. As células estão prontas para a classificação baseada em citometria de fluxo.
3. Isolamento de HSCs e MPPs da medula óssea
- Dissecar e isolar a medula óssea.
NOTA: É mais crítico trabalhar rápido e manter os ossos isolados e as células frias (4 °C) durante todo o procedimento para permitir resultados precisos. Além disso, para minimizar os sinais de fundo, trabalhe e use um espaço limpo e equipamentos de laboratório.- Eutanásia de camundongos de acordo com diretrizes e métodos aprovados pelas autoridades locais.
- Pulverizar etanol 70% na parte inferior dos ratos.
- Disseque as pernas e os espinhos usando uma tesoura. Faça uma incisão nas costas e estenda o corte até o abdômen. Descasque a pele dos membros posteriores.
- Rasgue ou corte os membros posteriores e certifique-se de que as pernas contenham a articulação da tíbia, fêmur e quadril.
- Pegue a tesoura e corte-as ao lado da coluna até ser completamente removida.
- Distribua as pernas e os espinhos em placas de 6 poços contendo PBS frio (4 °C) e mantenha as placas no gelo.
- Limpe o fêmur, a tíbia, a articulação do quadril e as vértebras dos tecidos moles usando bisturi e tesoura.
- Esmagar os ossos limpos com uma argamassa e pilão em 5 mL de PBS frio (4 °C).
- Filtrar a suspensão celular através de um filtro celular de 40 μm para um tubo de 50 ml.
- Repita as etapas 3.1.8-3.1.9 até que os ossos pareçam completamente brancos.
- Lise de eritrócitos:
- Centrifugar a suspensão celular colhida a 400 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet de células em 1 mL de tampão ACK frio (4 °C). Incubar por 5 minutos no gelo.
- Adicionar PBS frio (4 °C) para interromper a reação (opcional).
- Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Depleção da linhagem:
NOTA: Para enriquecer para células de linhagem negativa (Lin-), um kit de seleção negativo para células CD4 foi usado.- Prepare as contas magnéticas:
- Adicionar 500 μL de contas em tubos de microcentrífuga de 2 mL. Coloque os tubos em um ímã e descarte o sobrenadante.
- Lavar as esferas com 1 ml de PBS frio (4 °C) e eliminar o sobrenadante.
- Adicionar 500 μL de PBS frio (4 °C) e manter as contas frias (4 °C).
- Incubar as células com 500 μL de coquetel de linhagem (50 μL de anticorpo fornecido pelo kit + 450 μL de PBS) por 25 min (agitação, 4 °C) no escuro.
- Lavar as células com PBS frio (4 °C).
- Centrifugar o tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 1000 μL de PBS frio (4 °C) e transferir a suspensão celular para a solução do cordão.
- Incubar durante 15 minutos numa roda giratória a 4 °C.
- Coloque os tubos em um ímã e aguarde até que a solução se limpe. Transfira o sobrenadante para um tubo FACS fresco.
- Lave as contas com 500 μL de PBS.
- Coloque os tubos em um ímã e aguarde até que a solução se limpe.
- Transfira o sobrenadante para o tubo FACS fresco.
- Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Prepare as contas magnéticas:
- Coloração para FACS
- Preparar 300 μL de mistura de anticorpos por rato em PBS frio (4 °C).
- Mistura de anticorpos para células-tronco/progenitoras: HSCs: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
- Incubar as células durante 40 minutos no escuro a 4 °C.
- Lavar com 1 ml de PBS frio (4 °C). Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet de células em 1 mL de tampão de ressuspensão FACS e filtrar as células através de um tubo FACS com tampa de filtro.
4. Classificação FACS
- Configure o classificador de células.
- Insira a ponta do bocal de 70 μm. Ative lasers de 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm.
- Defina o modo de classificação para Pureza de 4 vias: máscara de rendimento 0, máscara de pureza 32, máscara de fase 0
- Ajuste a frequência de queda para 90.400 Hz e ajuste a amplitude e o atraso de queda de acordo com as instruções do fabricante. Ajuste a tensão da placa para 5000 V.
- Defina as portas de classificação de acordo com as instruções do fabricante.
- Para todos os tipos de células, primeiro, selecione células únicas com base na dispersão direta e no sinal de dispersão lateral, seguido pela seleção com base na coloração específica do tipo de célula.
- Para células B, selecione a população AF647-positiva, PE-negativa.
- Para células T, selecione a população PE-positiva, AF647-negativa.
- Para HSCs, selecione a população PE-Cy7-baixa, PE-positiva, APC-Cy7-positiva, BV605-positiva, BV421-negativa.
- Para MPPs, selecione a população PE-Cy7-baixa, PE-positiva, APC-Cy7-positiva, BV421-positiva, BV605-negativa.
- Para amostras de detritos, selecione eventos que são muito pequenos para representar células intactas com base na dispersão direta e no sinal de dispersão lateral. Gráficos FACS típicos mostrando essas estratégias de fechamento são mostrados na Figura 2 e na Figura 3.
- Ajuste a taxa de fluxo para obter menos de 15.000 eventos/s.
- Preparar placa de coleta
- Preparar solução estoque de extrato de levedura: Ressuspender 1 alíquota de extrato de levedura 13C em 7,5 mL de H2O ultrapuro e 2,5 mL de metanol.
- Preparar tampão de extração: Adicionar 10 μL de solução-mãe de extrato de levedura a 13C a 10 mL de acetonitrila e misturar.
- Preparar placa de coleta: Adicionar 25 μL do tampão de extração a cada poço de uma placa de PCR de 96 poços que será usada para coletar a amostra. Para minimizar a evaporação, cubra os poços com tampas de PCR (listras cortadas em singletes).
- Execute a classificação de células.
- Abra os poços de coleta conforme necessário para coletar as células separadas e feche-as o mais rápido possível para minimizar a evaporação.
- Se as amostras não puderem ser medidas imediatamente, armazená-las em recipientes selados a -80 °C por vários dias. Após o descongelamento, sonicar as amostras por 5 min para garantir a ressuspensão completa dos metabólitos.
5. Medição de LC-QQQ-MS
- Preparar solventes LC
- Preparar solução estoque de ácido medrônico (100 mM): Dissolver 17,6 mg de ácido medrônico em 1 mL de H2O ultrapuro.
- Preparar o tampão A: Dissolver 1,92 g de carbonato de amónio em 1 L de H2O ultrapuro e adicionar 50 μL de solução-mãe de ácido medrónico.
- Preparar o tampão B: Misturar 50 mL de tampão com 450 mL de acetonitrila.
- Preparar mistura de teste LC: Misturar 1 ppm cada de leucina, isoleucina, AMP, ADP e ATP em acetonitrila 80:20: H2O ultrapuro.
NOTA: O estoque de ácido medrônico pode ser armazenado a -20 °C por vários meses; outros tampões podem ser mantidos em TR por 2 dias.
- Programa LC-QQQ-MS método
- Otimize as configurações de MS específicas do composto (por exemplo, energia de colisão) de acordo com as instruções do fabricante. Para instrumentos da série Agilent 6495, use as configurações da Tabela Suplementar 1.
- Otimize as configurações de MS específicas da fonte de acordo com as instruções do fabricante. Para instrumentos com fonte ESI aquecida JetStream, use os seguintes parâmetros: temperatura do gás: 240 °C, fluxo de gás: 15 L/min, nebulizador: 50 psi, temperatura do gás da bainha: 400 °C, fluxo de gás da bainha: 11 L/min, tensão capilar: 2000 V, tensão do bocal: 300 V.
- Otimize as configurações da óptica de transferência iônica de acordo com as instruções do fabricante. Para instrumentos Agilent com óptica iFunnel, utilize os seguintes parâmetros: RF de alta pressão positivo: 110 V, RF de alta pressão negativo: 90 V, RF de baixa pressão positivo: 80 V, RF de baixa pressão negativo: 60 V.
- Programar o gradiente CL: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μL/min; Tempo de parada 28 min. Temperatura da coluna: 35 °C.
- Configurar o instrumento LC-MS.
- Ligar a coluna cromatográfica no compartimento da coluna com temperatura controlada.
- Conecte os buffers e limpe todas as linhas.
- Execute pelo menos 4 amostras em branco ou agrupe amostras para equilibrar a coluna.
- Execute a mistura de teste LC para verificar o desempenho cromatográfico. Certifique-se de que os seguintes critérios sejam atendidos. Caso contrário, limpe ou solucione problemas do instrumento antes de executar as amostras.
- Confirme se a contrapressão inicial é de <150 bar e a contrapressão máxima é de <400 bar.
- Confirme se os tempos de retenção estão em uma janela de ±1 min da seguinte forma: isoleucina 6,0 min, leucina 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min e ATP 12,7 min.
- Certifique-se de que o vale entre leucina e isoleucina na transição +132->86 seja < 20 % da altura do pico.
- Certifique-se de que a diferença no tempo de retenção AMP para ADP é de 1,5 a 1,9 min, e a diferença no tempo de retenção ADP para ATP é de 1,1 a 1,9 min.
- Configurar lista de trabalho
- Comece com uma amostra em branco para minimizar a transferência da mistura de teste LC.
- Execute as amostras em ordem aleatória.
- Termine com uma amostra em branco para limpar a coluna para experimentos futuros.
6. Pré-processamento de dados no automRm
Observação : as etapas a seguir discutem a conversão de .d para .mzML em msconvert, preparação de metabdb, carregamento de dados e modelos e metabdb e estratégias gerais para revisão manual de pico.
- Converta dados brutos do formato .d para o formato .mzML usando o ProteoWizard20 com as seguintes configurações: precisão de codificação binária: 32 bits, MS Níveis 1-2, Índice de gravação selecionado, Usar compactação zlib selecionado.
- Iniciar R.
- Instale o automRm21 de acordo com a documentação do pacote (necessário apenas uma vez antes do primeiro uso).
- Inicie a GUI do automRm em R: automRm::automrm_gui()
- Processe o lote de arquivos .d na guia Process > Process Batch.
- Selecione .xlsx arquivo que contém informações de metabólito. Esse arquivo deve corresponder ao método LC-QQQ-MS.
- Selecionar. Arquivo RData que contém o modelo de ML de coleta de pico.
- Selecionar. Arquivo RData que contém o modelo de ML de relatório de pico.
- Selecione a pasta do projeto que contém os arquivos .mzML.
- Inicie o pré-processamento de dados clicando em Processar lote.
- Após o término do pré-processamento, abra peakoverview.pdf para verificar a detecção correta de picos cromatográficos. Opcionalmente, carregue o automRmdata_Review.RData na guia Revisão da GUI do automRm para modificar manualmente a filtragem de pico e a integração de pico.
- Abra o peakinfo.xlsx na pasta do projeto e verifique os dados.
- Verifique o sinal padrão interno de 13C na guia 13CArea: Certifique-se de que não há diferenças sistemáticas nos valores de intensidade entre os grupos experimentais e entre amostras de células e amostras de detritos. Se tais diferenças existirem, use apenas os dados das abas NormArea ou NormHeight para análise posterior; caso contrário, use dados das guias RawArea ou RawHeight.
- Verifique a intensidade do sinal dos padrões internos ATA e CLF na aba RawArea. Garantir que não haja diferenças sistemáticas na intensidade de ambos os compostos entre os grupos experimentais.
- Para cada metabólito, comparar a intensidade de sinal das amostras contendo células com as amostras de detritos da mesma suspensão celular. Utilizar um teste estatístico adequado para identificar metabolitos em que as amostras contendo células têm intensidades mais elevadas do que as amostras de detritos. Inclua apenas metabólitos que passem nesse teste na análise de dados subsequente.
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Representative Results
A classificação FACS permite o isolamento de populações limpas de diferentes tipos celulares a partir da mesma suspensão celular (Figura 2 e Figura 3). A especificidade deste método baseia-se na coloração dos diferentes tipos celulares com marcadores de superfície específicos (por exemplo, células B e células T do baço) ou combinações específicas de marcadores de superfície (por exemplo, HSCs e MPPs). A coloração de marcadores intracelulares tipicamente requer permeabilização da membrana celular. Isso pode causar vazamento de metabólitos e, portanto, esse tipo de coloração não é adequado para ser usado neste protocolo.
O LC proporciona a separação dos metabólitos antes da detecção por MS (Figura 4). Metabólitos eluem da coluna HILIC aproximadamente ordenados por polaridade, com menos compostos polares eluíndo precocemente e mais metabólitos polares eluíndo mais tarde. A intensidade do sinal é determinada pela quantidade de um metabólito alvo na amostra e um fator de resposta metabólito-específico. Consequentemente, as intensidades de sinal não podem ser significativamente comparadas entre metabólitos, mas apenas para um metabólito em amostras. Os 3 picos destacados na Figura 4 representam 1: niacinamida é detectada tanto em debris quanto em extratos celulares, embora em níveis diferentes, 2: acetil-carnitina que é detectada quase exclusivamente em extratos celulares, e 3: o ácido aminoterefático padrão interno que é detectado no mesmo nível em amostras de debris e extratos celulares.
As diferenças metabólicas entre os tipos celulares de um mesmo tecido são preservadas usando o protocolo combinado FACS-LC-MS (Figura 5). Para HSCs e MPPs, células de 6 camundongos foram necessárias para gerar 6 amostras, levando a uma maior variabilidade dentro de cada grupo em comparação com células B e células T, que foram separadas do mesmo baço murino. As amostras de detritos que representam amostras de controle em branco do processo são claramente separadas das amostras que contêm extratos celulares. Dentro das amostras de detritos, uma separação clara dos dois experimentos é visível, destacando a diferença no ambiente metabólico que as células experimentam antes da classificação. Quando representado em um mapa de calor agrupado (Figura 6), informações adicionais tornam-se visíveis, como os níveis relativos de metabólitos entre as amostras.
Figura 1: Visão geral das principais etapas do protocolo apresentado. Essa figura foi reimpressa com permissão de Schoenberger et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento de populações puras de células B e células T do baço. Células e detritos foram selecionados com base em sinais de espalhamento para frente (FSC) e espalhamento lateral (SSC). Células B e células T foram selecionadas com base em sinais de coloração específicos do tipo celular. Esse número foi adaptado com permissão de Schoenberger et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Isolamento da CTE e MPP da medula óssea. Células e detritos foram selecionados com base em sinais de espalhamento para frente (FSC) e espalhamento lateral (SSC). As populações de HSC e MPP foram selecionadas com base em múltiplos estágios de sinais de coloração específicos do tipo celular. Esse número foi adaptado com permissão de Schoenberger et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo de cromatogramas. Amostras com (A) 5000 HSCs e (B) 5000 eventos de detritos do mesmo tipo. Observe que os eixos compartilham a mesma escala em ambos os painéis. Os metabólitos destacados são 1: nicotinamida, 2: acetil-carnitina, 3: ácido aminotereftálico (ATA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de componentes principais (ACP) de perfis metabólicos de diferentes tipos celulares e amostras de fundo de detritos dos mesmos experimentos. Observa-se uma grande separação entre os diferentes órgãos e amostras de fundo de detritos de qualquer órgão. Além disso, os tipos celulares são claramente separados dentro das células de cada órgão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mapa de calor representando metabólitos medidos em diferentes tipos de células e amostras de controle de fundo correspondentes (detritos). Os valores faltantes foram imputados com o valor mínimo de meio mínimo do mesmo metabólito em todas as amostras. Para a plotagem, os dados foram normalizados ao máximo separadamente em cada linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela suplementar 1: A tabela lista as configurações específicas do composto para os metabólitos selecionados, incluindo tempo de retenção (TR), polaridade (Pol), precursor m/z (Q1), fragmento m/z (Q3) e energia de colisão (CE). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
As etapas mais críticas para a implementação bem-sucedida de metabolômica direcionada usando este protocolo são 1) uma estratégia robusta de coloração e fechamento que produzirá populações de células limpas 2) manuseio preciso de volumes de líquidos, 3) tempo reprodutível de todas as etapas experimentais, em particular todas as etapas anteriores à extração do metabólito. Idealmente, todas as amostras pertencentes a um experimento devem ser processadas e medidas em um lote para minimizar os efeitos do lote22. Para experimentos maiores, sugerimos coletar extratos celulares a -80 °C e, em seguida, medir todos os extratos em um lote.
Ao trabalhar com amostras de baixo consumo, deve-se enfatizar o manuseio limpo de todos os materiais que são utilizados no decorrer dos experimentos23. As contaminações comuns são tampão residual, detergentes e produtos para cuidados com a pele. A medida mais importante para minimizar a contaminação é o uso de luvas adequadas durante todo o experimento.
Para minimizar possíveis alterações na composição dos metabólitos devido à exposição das células a condições não fisiológicas, é crucial preparar as amostras em gelo e com reagentes frios (4 °C) é crucial. Além disso, ser o mais rápido possível antes da etapa da FACS aumentará a qualidade da medição2. Os tempos indicados para a coloração de anticorpos são tão curtos quanto razoáveis para uma boa eficiência de coloração. Um passo adicional para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos aos receptores Fc usando anticorpos Fc-block poderia ser adicionado antes do procedimento de coloração FACS24,25. Isso evita a contaminação das populações de células-alvo e é especialmente aconselhável quando se trabalha com suspensões celulares que incluem muitos tipos de células altas do receptor Fc (como monócitos ou macrófagos) ou células que foram cultivadas sem soro. No entanto, aumentará o tempo total de manuseio em 10-15 min e, portanto, poderá adicionar variabilidade não fisiológica adicional aos resultados.
Com o uso de métodos dinâmicos de MRM em espectrômetros de massa modernos, todos os metabólitos listados em configurações específicas de compostos podem ser registrados com uma única injeção. A limitação do número de metabólitos alvo permite a implementação do protocolo descrito em espectrômetros de massa mais antigos e acelera o pré-processamento e a análise dos dados.
Algum nível de sinal de fundo nos dados do LC-MS é inevitável. Portanto, muito cuidado deve ser tomado para identificar os metabólitos que podem ser detectados acima do fundo. A classificação de eventos que são muito pequenos para representar células intactas (detritos) gera amostras em branco de processo relevantes que representam intensidades de sinal de fundo dependentes da matriz. Além disso, as normas internas permitem a identificação de amostras problemáticas que devem ser excluídas da análise posterior dos dados26. Ambas as medidas de garantia de qualidade funcionam melhor se um número suficientemente grande de réplicas estiver disponível. Recomendamos o uso de pelo menos seis réplicas por grupo.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao biotério do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética pelo fornecimento dos animais utilizados neste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
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