Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir de manera precisa y confiable los metabolitos en tipos de células raras. Las mejoras técnicas, incluido un fluido de vaina modificado para la clasificación de células y la generación de muestras en blanco relevantes, permiten una cuantificación completa de metabolitos con una entrada de solo 5000 células por muestra.
Abstract
La función celular depende críticamente del metabolismo, y la función de las redes metabólicas subyacentes se puede estudiar midiendo los intermedios de moléculas pequeñas. Sin embargo, la obtención de mediciones precisas y fiables del metabolismo celular, especialmente en tipos de células raras como las células madre hematopoyéticas, ha requerido tradicionalmente la agrupación de células de múltiples animales. Un protocolo ahora permite a los investigadores medir metabolitos en tipos de células raras utilizando solo un ratón por muestra, al tiempo que generan múltiples réplicas para tipos de células más abundantes. Esto reduce el número de animales que se requieren para un proyecto determinado. El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave con respecto a los protocolos metabolómicos tradicionales, como el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en acetonitrilo y la utilización de una cuantificación dirigida con un uso riguroso de estándares internos, lo que permite mediciones más precisas y completas del metabolismo celular. A pesar del tiempo necesario para el aislamiento de células individuales, la tinción fluorescente y la clasificación, el protocolo puede preservar en gran medida las diferencias entre los tipos de células y los tratamientos farmacológicos.
Introduction
El metabolismo es un proceso biológico esencial que ocurre en todas las células vivas. Los procesos metabólicos implican una vasta red de reacciones bioquímicas que están estrechamente reguladas e interconectadas, lo que permite a las células producir energía y sintetizarbiomoléculas esenciales. Para comprender la función de las redes metabólicas, los investigadores miden los niveles de intermediarios de moléculas pequeñas dentro de las células. Estos intermediarios sirven como indicadores importantes de la actividad metabólica y pueden revelar información crítica sobre la función celular.
La espectrometría de masas (MS) es la opción más popular para la detección específica de metabolitos en muestras complejas 1,2. La resonancia magnética nuclear (RMN) tiene ventajas en la cuantificación absoluta de compuestos y la elucidación de estructuras, pero la EM a menudo puede resolver más componentes en mezclas complejas como biofluidos o extractos celulares. La mayoría de las veces, la EM se combina con la separación previa del compuesto mediante electroforesis capilar (CE), cromatografía de gases (GC) o cromatografía líquida (LC)3. La elección de la plataforma de separación depende principalmente de la gama de metabolitos objetivo y del tipo de muestra y, en un entorno real, de la disponibilidad de máquinas y experiencia. Las tres plataformas de separación tienen una amplia gama de metabolitos adecuados, pero diferentes limitaciones. En resumen, la CE solo puede separar moléculas cargadas y requiere mucha experiencia para implementar un análisis robusto de una gran cantidad de muestras4. La GC se limita a moléculas que son lo suficientemente pequeñas y apolares como para evaporarse antes dedescomponerse. Teniendo en cuenta todas las columnas de LC disponibles en el mercado, dos metabolitos cualesquiera pueden separarse mediante esta tecnología5. Sin embargo, muchos métodos de LC exhiben menos poder de resolución que los métodos CE o GC de longitud similar.
La cantidad típica de material de partida para las mediciones metabolómicas suele estar en el rango de 5 x 105 a 5 x 107 células por muestra, 5-50 mg de tejido húmedo o 5-50 μL de líquido corporal6. Sin embargo, puede ser difícil obtener tales cantidades de material de partida cuando se trabaja con células primarias de tipos celulares raros, como por ejemplo las células madre hematopoyéticas (CMH) o las células tumorales circulantes. Estas células a menudo están presentes en cantidades muy bajas y no se pueden cultivar sin comprometer las características celulares críticas.
Las HSC y las células progenitoras multipotentes (MPP) son las células menos diferenciadas del sistema hematopoyético y producen continuamente nuevas células sanguíneas a lo largo de la vida de un organismo. La regulación de la hematopoyesis es de relevancia clínica en afecciones como la leucemia y la anemia. A pesar de su importancia, las HSC y las MPP se encuentran entre las células más raras dentro del sistema hematopoyético. De un solo ratón, típicamente, se pueden aislar alrededor de 5000 HSC 7,8,9. Dado que los métodos metabolómicos tradicionales requieren más material de entrada, a menudo era necesario agrupar células de varios ratones para analizar tipos de células raras10,11.
Aquí, nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que permitiera la medición de metabolitos en tan solo 5000 células por muestra para permitir la generación de datos metabolómicos a partir de las HSC de un solo ratón12. Al mismo tiempo, este método permite generar múltiples réplicas a partir de un solo ratón para tipos celulares más abundantes como los linfocitos. Este enfoque reduce el número de animales necesarios para un proyecto determinado, contribuyendo así a las "3R" (reducción, reemplazo, refinamiento) de los experimentos con animales.
Los metabolitos en las células pueden tener tasas de renovación muy altas, a menudo del orden de segundos13. Sin embargo, la preparación de muestras para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede llevar horas, y la clasificación FACS en sí misma puede llevar de minutos a horas, lo que lleva a posibles alteraciones en el metaboloma debido a condiciones no fisiológicas. Algunos de los reactivos utilizados en este protocolo (como el tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio [ACK]) pueden tener efectos similares. Estas condiciones pueden causar estrés celular y afectar los niveles y proporciones de metabolitos dentro de las células, lo que lleva a mediciones inexactas o sesgadas del metabolismo celular 14,15,16. Los cambios metabólicos debidos a la preparación de la muestra a veces se denominan artefactos de clasificación. Los largos protocolos de digestión y los reactivos agresivos que pueden ser necesarios para producir suspensiones unicelulares a partir de tejidos duros o duros pueden agravar este problema. Es probable que los cambios que se pueden producir dependan del tipo de célula y de la condición de procesamiento. La naturaleza precisa de los cambios sigue siendo desconocida, ya que no se puede medir el estado metabólico de las células no perturbadas en el tejido vivo.
El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave en comparación con los métodos tradicionales, a saber, el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en tampón de extracción, la inyección de grandes volúmenes de muestra en cromatografía líquida de interacción hidrofílica-espectrometría de masas (HILIC-MS) y la utilización de cuantificación dirigida, el uso riguroso de patrones internos y controles de fondo (Figura 1). Este protocolo tiene el potencial de preservar en gran medida las diferencias entre los tipos celulares y entre el tratamiento farmacológico y el control vehicular12. Incluso en el caso de las células cultivadas, se compara favorablemente con los enfoques alternativos, como la centrifugación más establecida y la eliminación manual del sobrenadante. Sin embargo, dado que aún pueden producirse artefactos de ordenación, los datos deben interpretarse con precaución. A pesar de esta limitación, el protocolo representa una mejora significativa en el campo de los perfiles metabólicos, permitiendo mediciones más precisas y completas del metabolismo celular en células primarias raras12.
La capacidad de medir de forma robusta amplios perfiles metabólicos en células primarias raras abre la puerta a nuevos experimentos en la investigación biomédica que involucran estas células. Por ejemplo, se ha demostrado que la regulación metabólicamente mediada en las HSC tiene un impacto en la capacidad de autorrenovación de la latencia, con implicaciones para la anemia y la leucemia11,17. En las células tumorales circulantes derivadas de pacientes, se han demostrado diferencias en la expresión de genes metabólicos entre el tumor y las células adyacentes18,19. Este protocolo permite ahora a los investigadores estudiar estas diferencias de forma sistemática a nivel metabólico, que generalmente se considera más cercano al fenotipo celular que a la expresión génica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La cría y la cría de todos los ratones utilizados para este protocolo se llevaron a cabo en una instalación de animales convencionales en el Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética (MPI-IE) de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales (Regierungspräsidium Freiburg). Los ratones fueron sacrificados con CO2 y luxación cervical por personal capacitado en FELASA B siguiendo las directrices y regulaciones aprobadas por el comité de bienestar animal del MPI-IE y las autoridades locales. No se realizó ningún experimento con animales y los ratones no tuvieron problemas de salud.
NOTA: Los métodos analíticos de alta sensibilidad, como el método LC-MS utilizado en este protocolo, tienen el potencial de detectar incluso contaminaciones muy pequeñas en la muestra. Por lo tanto, es de suma importancia minimizar dichas contaminaciones. La medida más importante es usar guantes limpios cada vez que toque cualquier cosa que entre en contacto con las muestras. Esto incluye, por ejemplo, la preparación de tampones y líquido de vaina, el etiquetado de tubos de muestra y la limpieza de equipos de laboratorio. Además, siempre que sea posible, se debe utilizar material de laboratorio de un solo uso. La cristalería debe enjuagarse con solventes de grado LC-MS antes de su uso. Un entorno de trabajo limpio ayuda aún más a reducir la contaminación.
1. Preparativos generales
- Prepare la solución madre patrón interna: Prepare 6 mg/ml de clorofenilalanina (CLF) y 6 mg/ml de ácido aminotereftálico (ATA) en 2-propanol al 30% v/v en agua ultrapura.
- Prepare el tampón de resuspensión FACS: Agregue 0,9 g de NaCl, 99,5 ml de agua ultrapura y 0,5 ml de solución madre estándar interna. Preenfriar a 4 °C.
- Preparar el líquido de la vaina: En un tanque de líquido de la vaina, disuelva 30 g de NaCl en 6 L de agua desionizada y conéctelo a un clasificador de células.
NOTA: La concentración de NaCl en el fluido de la vaina se ha optimizado para permitir la desviación de las gotas en el clasificador que es tan robusta como cuando se utiliza PBS como fluido de la vaina y, al mismo tiempo, para minimizar los efectos negativos en la detección de metabolitos por LC-MS12. Las concentraciones más bajas de NaCl son ventajosas para la detección de metabolitos, pero perjudican la clasificación robusta de las células.
2. Aislamiento de las células B y T del bazo
- Enfriar previamente 90 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por ratón en una nevera o en hielo a 4 °C. Enfriar previamente una centrífuga a 4 °C.
- Aislamiento del bazo
NOTA: Es muy importante trabajar rápido, con hielo y con tampones fríos (4 °C) durante el aislamiento celular y los siguientes pasos de tinción. De lo contrario, el perfil metabólico de las células podría cambiar considerablemente.- Prepare 1,5 ml de PBS en un tubo de reacción de 2 ml sobre hielo.
- Sacrificar a un ratón C57BL6/J de acuerdo con las directrices y métodos aprobados por las autoridades locales.
- Esterilizar el pelaje con etanol al 70%.
- Abra el abdomen con unas tijeras y retire el bazo con pinzas finas sin romper el órgano. Coloque inmediatamente el bazo en PBS frío (4 °C).
- Generación de una suspensión unicelular
- Coloque un colador de células de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 ml y humedézcalo con PBS. Pase el bazo a través de la malla con el apoyo para el pulgar de un émbolo de jeringa y 30 ml de PBS frío (4 °C)
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de tampón de lisis ACK e incube durante 2 min a temperatura ambiente (RT; 20 °C).
- Añadir 50 ml de PBS frío (4 °C). Centrifugar a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Tinción FACS
- Preparar el cóctel de anticuerpos en 500 μL de PBS frío (4 °C) por ratón: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Vuelva a suspender el gránulo celular en el cóctel de anticuerpos. Transfiera a un tubo FACS de 5 ml. Incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.
- Añadir 3 ml de PBS frío (4 °C). Centrifugar a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de tampón de resuspensión FACS frío (4 °C). Filtre las células a través de un tubo FACS con tapa de filtro. Las células están listas para la clasificación basada en citometría de flujo.
3. Aislamiento de HSCs y MPPs de la médula ósea
- Diseccionar y aislar la médula ósea.
NOTA: Es muy importante trabajar rápido y mantener los huesos aislados y las células frías (4 °C) durante todo el procedimiento para permitir resultados precisos. Además, para minimizar las señales de fondo, trabaje y utilice un espacio limpio y equipos de laboratorio.- Sacrificar ratones de acuerdo con las pautas y métodos aprobados por las autoridades locales.
- Rocíe etanol al 70% en la parte inferior de los ratones.
- Disecciona las patas y las espinas con unas tijeras. Haga una incisión en la espalda y extienda el corte alrededor del abdomen. Pela la piel de las extremidades traseras.
- Arranca o corta las extremidades traseras y asegúrate de que las piernas contengan la tibia, el fémur y la articulación de la cadera.
- Toma las tijeras y córtalas cerca de la columna vertebral hasta que las retires por completo.
- Distribuya las patas y las espinas en placas de 6 pocillos que contengan PBS frío (4 °C) y mantenga las placas en hielo.
- Limpie el fémur, la tibia, la articulación de la cadera y las vértebras de los tejidos blandos con un bisturí y unas tijeras.
- Triturar los huesos limpios con un mortero en 5 mL de PBS frío (4 °C).
- Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de 50 ml.
- Repita los pasos 3.1.8-3.1.9 hasta que los huesos aparezcan completamente blancos.
- Lisis de eritrocitos:
- Centrifugar la suspensión celular recolectada a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de tampón ACK frío (4 °C). Incubar durante 5 minutos en hielo.
- Agregue PBS frío (4 °C) para detener la reacción (opcional).
- Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Agotamiento del linaje:
NOTA: Para enriquecer las células de linaje negativo (Lin-), se utilizó un kit de selección de negativos para células CD4.- Prepara las cuentas magnéticas:
- Agregue 500 μL de perlas en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Coloque los tubos en un imán y deseche el sobrenadante.
- Lavar las perlas con 1 mL de PBS frío (4 °C) y desechar el sobrenadante.
- Añadir 500 μL de PBS frío (4 °C) y mantener las perlas frías (4 °C).
- Incubar las células con 500 μL de cóctel de linaje (50 μL de anticuerpos proporcionados por el kit + 450 μL de PBS) durante 25 min (agitación, 4 °C) en la oscuridad.
- Lavar las celdas con PBS frío (4 °C).
- Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en 1000 μL de PBS frío (4 °C) y transfiera la suspensión celular a la solución de perlas.
- Incubar durante 15 min en una rueda giratoria a 4 °C.
- Coloque los tubos en un imán y espere hasta que la solución se aclare. Transfiera el sobrenadante a un tubo FACS nuevo.
- Lavar las perlas con 500 μL de PBS.
- Coloque los tubos en un imán y espere hasta que la solución se aclare.
- Transfiera el sobrenadante al tubo FACS fresco.
- Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Prepara las cuentas magnéticas:
- Tinción para FACS
- Preparar 300 μL de mezcla de anticuerpos por ratón en PBS frío (4 °C).
- Mezcla de anticuerpos para células madre/progenitoras: HSC: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
- Incubar las células durante 40 min en la oscuridad a 4 °C.
- Lavar con 1 ml de PBS frío (4 °C). Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo de la célula en 1 ml de tampón de resuspensión FACS y filtre las células a través de un tubo FACS con tapa de filtro.
4. Clasificación FACS
- Configure el clasificador de celdas.
- Inserte la punta de la boquilla de 70 μm. Active láseres de 405 nm, 488 nm, 561 nm y 633 nm.
- Establezca el modo de clasificación en Pureza de 4 vías: máscara de rendimiento 0, máscara de pureza 32, máscara de fase 0
- Establezca la frecuencia de caída en 90,400 Hz y ajuste la amplitud y el retardo de caída de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ajuste el voltaje de la placa a 5000 V.
- Defina las puertas de clasificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para todos los tipos de células, en primer lugar, seleccione células individuales en función de la señal de dispersión directa y de dispersión lateral, seguida de una selección basada en la tinción específica del tipo de célula.
- En el caso de los linfocitos B, seleccione la población AF647 positiva y PE negativa.
- En el caso de los linfocitos T, seleccione la población positiva para PE y negativa para AF647.
- En el caso de las HSC, seleccione la población con PE-Cy7 bajo, PE-positivo, APC-Cy7-positivo, BV605-positivo, BV421-negativo.
- En el caso de los MPP, seleccione la población PE-Cy7-low, PE-positive, APC-Cy7-positive, BV421-positive, BV605-negative.
- En el caso de las muestras de residuos, seleccione eventos que sean demasiado pequeños para representar celdas intactas en función de la señal de dispersión directa y de dispersión lateral. En la Figura 2 y la Figura 3 se muestran gráficos FACS típicos que muestran estas estrategias de compuerta.
- Ajuste el caudal para obtener menos de 15.000 eventos/s.
- Preparar la placa de recolección
- Preparar la solución madre de extracto de levadura: Resuspender 1 alícuota de extracto de levadura 13C en 7,5 mL de H2O ultrapuro y 2,5 mL de metanol.
- Preparar el tampón de extracción: Añadir 10 μL de solución madre de extracto de levadura 13C a 10 mL de acetonitrilo y mezclar.
- Preparar la placa de recolección: Agregue 25 μL del tampón de extracción a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos que se utilizará para recolectar la muestra. Para minimizar la evaporación, cubra los pocillos con tapas de PCR (rayas cortadas en singletes).
- Realice la ordenación de celdas.
- Abra los pozos de recolección según sea necesario para recolectar las celdas clasificadas y ciérrelos lo antes posible para minimizar la evaporación.
- Si las muestras no se pueden medir inmediatamente, guárdelas en recipientes sellados a -80 °C durante varios días. Después de la descongelación, sonicar las muestras durante 5 minutos para garantizar la resuspensión completa de los metabolitos.
5. Medición LC-QQQ-MS
- Preparación de disolventes LC
- Preparar solución madre de ácido medrónico (100 mM): Disolver 17,6 mg de ácido medrónico en 1 mL de H2O ultrapuro.
- Preparar el tampón A: Disolver 1,92 g de carbonato de amonio en 1 L deH2Oultrapuro y añadir 50 μL de solución madre de ácido medrónico.
- Prepare el tampón B: Mezcle 50 ml de tampón con 450 ml de acetonitrilo.
- Prepare la mezcla de prueba de LC: Mezcle 1 ppm de leucina, isoleucina, AMP, ADP y ATP en acetonitrilo 80:20: H2O ultrapuro.
NOTA: El caldo de ácido medrónico puede almacenarse a -20 °C durante varios meses; otros tampones se pueden mantener en RT durante 2 días.
- Programa Método LC-QQQ-MS
- Optimice los ajustes de MS específicos del compuesto (por ejemplo, la energía de colisión) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los instrumentos de la serie Agilent 6495, utilice los ajustes de la Tabla complementaria 1.
- Optimice la configuración de MS específica de la fuente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para instrumentos con fuente ESI calentada JetStream, utilice los siguientes parámetros: temperatura del gas: 240 °C, flujo de gas: 15 L/min, nebulizador: 50 psi, temperatura del gas de la vaina: 400 °C, flujo de gas de la vaina: 11 L/min, tensión capilar: 2000 V, tensión de la boquilla: 300 V.
- Optimice la configuración de la óptica de transferencia de iones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los instrumentos Agilent con óptica iFunnel ion, utilice los siguientes parámetros: RF positivo de alta presión: 110 V, RF negativo de alta presión: 90 V, RF positivo de baja presión: 80 V, RF negativo de baja presión: 60 V.
- Programe el gradiente LC: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μL/min; Tiempo de parada 28 min. Temperatura de la columna: 35 °C.
- Configure el instrumento LC-MS.
- Conecte la columna cromatográfica en el compartimento de la columna con control de temperatura.
- Conecte los búferes y purgue todas las líneas.
- Ejecute al menos 4 muestras en blanco o muestras de grupo para equilibrar la columna.
- Ejecute la mezcla de prueba LC para comprobar el rendimiento cromatográfico. Asegúrese de que se cumplen los siguientes criterios. De lo contrario, limpie o solucione los problemas del instrumento antes de ejecutar las muestras.
- Confirme que la contrapresión inicial es de <150 bar y la contrapresión máxima es de <400 bar.
- Confirme que los tiempos de retención están en una ventana de ±1 min de la siguiente manera: isoleucina 6,0 min, leucina 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min y ATP 12,7 min.
- Asegúrese de que el valle entre la leucina y la isoleucina en la transición +132->86 esté < del 20 % de la altura máxima.
- Asegúrese de que la diferencia en el tiempo de retención de AMP a ADP sea de 1,5 a 1,9 min, y la diferencia en el tiempo de retención de ADP a ATP sea de 1,1 a 1,9 min.
- Configurar pool de trabajo
- Comience con una muestra en blanco para minimizar el arrastre de la mezcla de prueba de LC.
- Ejecute las muestras en orden aleatorio.
- Termine con una muestra en blanco para limpiar la columna para futuros experimentos.
6. Preprocesamiento de datos en automRm
NOTA: En los siguientes pasos se describe la conversión de .d a .mzML en msconvert, la preparación de metabdb, la carga de datos y modelos y metabdb, y las estrategias generales para la revisión manual de picos.
- Convierta datos sin procesar de formato .d a formato .mzML usando ProteoWizard20 con la siguiente configuración: precisión de codificación binaria: 32 bits, niveles MS 1-2, índice de escritura seleccionado, usar compresión zlib seleccionado.
- Iniciar R.
- Instale automRm21 de acuerdo con la documentación del paquete (solo se requiere una vez antes del primer uso).
- Inicie la GUI de automRm en R: automRm::automrm_gui()
- Procese el lote de archivos .d en la pestaña Procesar > procesar lote.
- Seleccione .xlsx archivo que contiene la información de los metabolitos. Este archivo debe coincidir con el método LC-QQQ-MS.
- Escoger. Archivo RData que contiene el modelo ML de selección de picos.
- Escoger. RData que contiene el modelo de ML de informes máximos.
- Seleccione la carpeta del proyecto que contiene los archivos .mzML.
- Inicie el preprocesamiento de datos haciendo clic en Procesar lote.
- Una vez finalizado el preprocesamiento, abra peakoverview.pdf para comprobar la correcta detección de picos cromatográficos. Opcionalmente, cargue el automRmdata_Review.RData desde la pestaña Revisar de la GUI de automRm para modificar manualmente el filtrado de picos y la integración de picos.
- Abra el peakinfo.xlsx de la carpeta del proyecto y compruebe los datos.
- Compruebe la señal estándar interna 13C en la pestaña 13CArea: Asegúrese de que no haya diferencias sistemáticas en los valores de intensidad entre los grupos experimentales y entre las muestras celulares y las muestras de residuos. Si existen tales diferencias, utilice solo los datos de las pestañas NormArea o NormHeight para el análisis posterior; de lo contrario, utilice los datos de las pestañas RawArea o RawHeight.
- Compruebe la intensidad de la señal de los patrones internos ATA y CLF en la pestaña RawArea. Asegúrese de que no haya diferencias sistemáticas en la intensidad de ninguno de los compuestos entre los grupos experimentales.
- Para cada metabolito, compare la intensidad de la señal de las muestras que contienen células con las muestras de restos de la misma suspensión celular. Utilice una prueba estadística apropiada para identificar los metabolitos en los que las muestras que contienen células tienen intensidades más altas que las muestras de desechos. Solo incluya los metabolitos que pasen esta prueba en el análisis de datos posterior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La clasificación FACS permite aislar poblaciones limpias de diferentes tipos celulares a partir de la misma suspensión celular (Figura 2 y Figura 3). La especificidad de este método se basa en la tinción de los diferentes tipos de células con marcadores de superficie específicos (por ejemplo, células B y células T del bazo) o combinaciones específicas de marcadores de superficie (por ejemplo, HSC y MPP). La tinción de marcadores intracelulares suele requerir la permeabilización de la membrana celular. Esto puede provocar fugas de metabolitos y, por lo tanto, este tipo de tinción no es adecuada para ser utilizada en este protocolo.
La LC proporciona la separación de los metabolitos antes de su detección por MS (Figura 4). Los metabolitos eluyen de la columna HILIC aproximadamente ordenados por polaridad, con menos compuestos polares que eluyen temprano y más metabolitos polares que eluyen más tarde. La intensidad de la señal está determinada por la cantidad de un metabolito diana en la muestra y un factor de respuesta específico del metabolito. En consecuencia, las intensidades de la señal no pueden compararse de forma significativa entre metabolitos, sino solo para un metabolito entre muestras. Los 3 picos que se destacan en la Figura 4 representan 1: la niacinamida se detecta tanto en los restos como en el extracto celular, aunque a diferentes niveles, 2: la acetil-carnitina que se detecta casi exclusivamente en extractos celulares, y 3: el ácido aminoterefatálico estándar interno que se detecta al mismo nivel en muestras de residuos y extractos celulares.
Las diferencias metabólicas entre los tipos de células del mismo tejido se conservan utilizando el protocolo combinado FACS-LC-MS (Figura 5). En el caso de las HSC y las MPP, se requirió que las células de 6 ratones generaran 6 muestras, lo que llevó a una mayor variabilidad dentro de cada grupo en comparación con las células B y las células T, que se clasificaron a partir del mismo bazo murino. Las muestras de residuos que representan las muestras de control en blanco del proceso se separan claramente de las muestras que contienen extractos celulares. Dentro de las muestras de escombros, es visible una clara separación de los dos experimentos, lo que pone de manifiesto la diferencia en el entorno metabólico que experimentan las células antes de la clasificación. Cuando se representa en un mapa de calor agrupado (Figura 6), se hace visible información adicional, como los niveles relativos de metabolitos en las muestras.
Figura 1: Descripción general de los pasos clave del protocolo presentado. Esta figura ha sido reimpresa con permiso de Schoenberger et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislamiento de poblaciones puras de linfocitos B y T del bazo. Las celdas y los eventos de escombros se seleccionaron en función de las señales de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Los linfocitos B y T se seleccionaron en función de las señales de tinción específicas del tipo de célula. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Schoenberger et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aislamiento de HSC y MPP de la médula ósea. Las celdas y los eventos de escombros se seleccionaron en función de las señales de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Las poblaciones de HSC y MPP se seleccionaron en función de múltiples etapas de señales de tinción específicas del tipo de célula. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Schoenberger et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de cromatogramas. Muestras con (A) 5000 HSC y (B) 5000 eventos de escombros del mismo tipo. Tenga en cuenta que los ejes comparten la misma escala en ambos paneles. Los metabolitos destacados son 1: nicotinamida, 2: acetil-carnitina, 3: ácido aminotereftálico (ATA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de componentes principales (PCA) de perfiles metabólicos de diferentes tipos de células y muestras de fondo de escombros de los mismos experimentos. Se observa una separación importante entre los diferentes órganos y muestras de fondo de restos de cualquier órgano. Además, los tipos de células están claramente separados dentro de las células de cada órgano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Mapa de calor que representa los metabolitos medidos en diferentes tipos de células y las muestras de control de fondo (escombros) coincidentes. Los valores faltantes se imputaron con el valor mínimo medio del mismo metabolito en todas las muestras. Para el trazado, los datos se normalizaron al máximo por separado en cada fila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla complementaria 1: La tabla enumera los ajustes específicos del compuesto para los metabolitos seleccionados, incluido el tiempo de retención (RT), la polaridad (Pol), el precursor m/z (Q1), el fragmento m/z (Q3) y la energía de colisión (CE). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los pasos más críticos para la implementación exitosa de la metabolómica dirigida utilizando este protocolo son: 1) una estrategia robusta de tinción y compuerta que produzca poblaciones celulares limpias, 2) el manejo preciso de los volúmenes líquidos, 3) el tiempo reproducible de todos los pasos experimentales, en particular todos los pasos previos a la extracción del metabolito. Idealmente, todas las muestras que pertenecen a un experimento deben procesarse y medirse en un lote para minimizar los efectos del lote22. Para experimentos más grandes, sugerimos recolectar extractos celulares a -80 °C y luego medir todos los extractos en un lote.
Cuando se trabaja con muestras de bajos insumos, se debe hacer hincapié en el manejo limpio de todos los materiales que se utilizan en el curso de los experimentos23. Las contaminaciones más comunes son los tampones residuales, los detergentes y los productos para el cuidado de la piel. La medida más importante para minimizar la contaminación es el uso de guantes adecuados durante todo el experimento.
Para minimizar las posibles alteraciones en la composición de los metabolitos debido a la exposición de las células a condiciones no fisiológicas, es crucial preparar las muestras en hielo y con reactivos fríos (4 °C). Además, ser lo más rápido posible antes del paso FACS aumentará la calidad de la medición2. Los tiempos indicados para la tinción de anticuerpos son tan cortos como sea razonable para una buena eficacia de la tinción. Un paso adicional para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos a los receptores Fc utilizando anticuerpos de bloqueo Fc podría añadirse antes del procedimiento de tinción FACS24,25. Esto evita la contaminación de las poblaciones celulares diana y es especialmente recomendable cuando se trabaja con suspensiones celulares que incluyen muchos tipos de células con alto contenido de receptores Fc (como monocitos o macrófagos) o células que se cultivaron sin suero. Sin embargo, aumentará el tiempo total de manipulación en 10-15 minutos y, por lo tanto, puede agregar variabilidad no fisiológica adicional a los resultados.
Con el uso de métodos dinámicos de MRM en espectrómetros de masas modernos, todos los metabolitos enumerados en configuraciones específicas de compuestos se pueden registrar con una sola inyección. La limitación del número de metabolitos objetivo permite la implementación del protocolo descrito en espectrómetros de masas más antiguos y acelera el preprocesamiento y el análisis de datos.
Es inevitable cierto nivel de señal de fondo en los datos LC-MS. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado para identificar aquellos metabolitos que se pueden detectar por encima del fondo. La clasificación de eventos que son demasiado pequeños para representar celdas intactas (escombros) genera muestras en blanco de proceso relevantes que representan intensidades de señal de fondo dependientes de la matriz. Además, las normas internas permiten la identificación de muestras problemáticas que deben excluirse de un análisis posterior de los datos26. Ambas medidas de control de calidad funcionan mejor si se dispone de un número suficientemente grande de réplicas. Se recomienda usar al menos seis réplicas por grupo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la instalación de animales del Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética por proporcionar los animales utilizados en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
