Summary
Her præsenterer vi en protokol til nøjagtig og pålidelig måling af metabolitter i sjældne celletyper. Tekniske forbedringer, herunder en modificeret kappevæske til cellesortering og generering af relevante blindprøver, muliggør en omfattende kvantificering af metabolitter med et input på kun 5000 celler pr. prøve.
Abstract
Cellulær funktion afhænger kritisk af stofskiftet, og funktionen af de underliggende metaboliske netværk kan studeres ved måling af små molekyler mellemprodukter. Imidlertid har opnåelse af nøjagtige og pålidelige målinger af cellulær metabolisme, især i sjældne celletyper som hæmatopoietiske stamceller, traditionelt krævet pooling af celler fra flere dyr. En protokol gør det nu muligt for forskere at måle metabolitter i sjældne celletyper ved kun at bruge en mus pr. Prøve, mens de genererer flere replikater til mere rigelige celletyper. Dette reducerer antallet af dyr, der kræves til et givet projekt. Protokollen, der præsenteres her, involverer flere vigtige forskelle i forhold til traditionelle metabolomics-protokoller, såsom anvendelse af 5 g / L NaCl som kappevæske, sortering direkte i acetonitril og anvendelse af målrettet kvantificering med streng brug af interne standarder, hvilket giver mulighed for mere nøjagtige og omfattende målinger af cellulær metabolisme. På trods af den tid, der kræves til isolering af enkeltceller, fluorescerende farvning og sortering, kan protokollen i vid udstrækning bevare forskelle mellem celletyper og lægemiddelbehandlinger.
Introduction
Metabolisme er en væsentlig biologisk proces, der forekommer i alle levende celler. Metaboliske processer involverer et stort netværk af biokemiske reaktioner, der er tæt reguleret og sammenkoblet, hvilket gør det muligt for celler at producere energi og syntetisere essentielle biomolekyler1. For at forstå funktionen af metaboliske netværk måler forskere niveauerne af små molekylemellemprodukter i celler. Disse mellemprodukter tjener som vigtige indikatorer for metabolisk aktivitet og kan afsløre kritisk indsigt i cellulær funktion.
Massespektrometri (MS) er det mest populære valg til specifik påvisning af metabolitter i komplekse prøver 1,2. Kernemagnetisk resonans (NMR) har fordele ved absolut kvantificering af forbindelser og strukturbelysning, men MS kan ofte løse flere komponenter i komplekse blandinger såsom biofluider eller celleekstrakter. Oftere end ikke kombineres MS med forudgående adskillelse af forbindelsen ved kapillærelektroforese (CE), gaskromatografi (GC) eller væskekromatografi (LC)3. Valget af separationsplatform er for det meste drevet af rækken af målmetabolitter og prøvetypen og, i virkelige omgivelser, af tilgængeligheden af maskiner og ekspertise. Alle tre separationsplatforme har et bredt og overlappende udvalg af egnede metabolitter, men forskellige begrænsninger. Kort fortalt kan CE kun adskille ladede molekyler og kræver stor ekspertise for at gennemføre robust analyse af et stort antal prøver4. GC er begrænset til molekyler, der er små og apolære nok til at fordampe, før de nedbrydes3. I betragtning af alle kommercielt tilgængelige LC-kolonner kan to metabolitter adskilles ved hjælp af denne teknologi5. Imidlertid udviser mange LC-metoder mindre opløsningsevne end CE- eller GC-metoder af tilsvarende længde.
Den typiske mængde udgangsmateriale til metabolomics-målinger ligger normalt i området 5 x 105 til 5 x 107 celler pr. prøve, 5-50 mg vådt væv eller 5-50 μL kropsvæske6. Det kan dog være udfordrende at opnå sådanne mængder udgangsmateriale, når man arbejder med primære celler af sjældne celletyper, som for eksempel hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) eller cirkulerende tumorceller. Disse celler er ofte til stede i meget lavt antal og kan ikke dyrkes uden at gå på kompromis med kritiske cellulære egenskaber.
HSC'er og multipotente stamceller (MPP'er) er de mindst differentierede celler i det hæmatopoietiske system og producerer kontinuerligt nye blodlegemer gennem en organismes liv. Reguleringen af hæmatopoiesis er af klinisk relevans under tilstande som leukæmi og anæmi. På trods af deres betydning er HSC'er og MPP'er blandt de sjældneste celler i det hæmatopoietiske system. Fra en enkelt mus kan der typisk isoleres ca. 5000 HSC'er 7,8,9. Da traditionelle metabolomics-metoder kræver mere inputmateriale, var det ofte nødvendigt at samle celler fra flere mus for at analysere sjældne celletyper10,11.
Her havde vi til formål at udvikle en protokol, der muliggør måling af metabolitter i så lidt som 5000 celler pr. prøve for at muliggøre generering af metabolomics-data fra HSC'erne for en enkelt mus12. Samtidig gør denne metode det muligt at generere flere replikater fra en enkelt mus til mere rigelige celletyper som lymfocytter. Denne fremgangsmåde reducerer antallet af dyr, der kræves til et givet projekt, og bidrager således til "3R" (reduktion, erstatning, forfinelse) af dyreforsøg.
Metabolitter i celler kan have meget høje omsætningshastigheder, ofte i størrelsesordenensekunder 13. Imidlertid kan forberedelse af prøver til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) tage timer, og FACS-sortering i sig selv kan tage minutter til timer, hvilket fører til potentielle ændringer i metabolomet på grund af ikke-fysiologiske tilstande. Nogle af de reagenser, der anvendes i denne protokol (såsom ammoniumchlorid-kalium [ACK] lysisbuffer) kan have lignende virkninger. Disse tilstande kan forårsage cellulær stress og påvirke niveauerne og forholdet mellem metabolitter i celler, hvilket fører til unøjagtige eller partiske målinger af cellulær metabolisme 14,15,16. De metaboliske ændringer på grund af prøveforberedelse kaldes undertiden sorteringsartefakter. Lange fordøjelsesprotokoller og hårde reagenser, der kan være nødvendige for at producere enkeltcellesuspensioner fra hårdt eller hårdt væv, kan forværre dette problem. Hvilke ændringer der kan forekomme afhænger sandsynligvis af celletypen og behandlingstilstanden. Den præcise karakter af ændringerne er endnu ukendt, da stofskiftetilstanden af de uforstyrrede celler i det levende væv ikke kan måles.
Den protokol, der præsenteres her, involverer flere nøgleforskelle sammenlignet med traditionelle metoder, nemlig brugen af 5 g / L NaCl som kappevæske, sortering direkte i ekstraktionsbuffer, injektion af store prøvevolumener på hydrofil interaktion væskekromatografi-massespektrometri (HILIC-MS) og anvendelse af målrettet kvantificering, streng brug af interne standarder og baggrundskontrol (figur 1). Denne protokol har potentiale til at bevare forskelle mellem celletyper og mellem narkotikabehandling og køretøjskontrol i vid udstrækning12. Selv for dyrkede celler kan det sammenlignes positivt med alternative tilgange, såsom den mere etablerede centrifugering og manuel fjernelse af supernatant. Da sorteringsartefakter dog stadig kan forekomme, skal data fortolkes med forsigtighed. På trods af denne begrænsning repræsenterer protokollen en betydelig forbedring inden for metabolisk profilering, hvilket giver mulighed for mere nøjagtige og omfattende målinger af cellulær metabolisme i sjældne primære celler12.
Evnen til robust at måle brede metaboliske profiler i sjældne primære celler åbner døren for nye eksperimenter inden for biomedicinsk forskning, der involverer disse celler. For eksempel har metabolisk medieret regulering i HSC'er vist sig at påvirke hvilende selvfornyelseskapacitet med konsekvenser for anæmi og leukæmi11,17. I patientafledte cirkulerende tumorceller er forskelle i ekspression af metaboliske gener mellem tumor og tilstødende celler blevet vist18,19. Denne protokol giver nu forskere mulighed for systematisk at studere disse forskelle på et metabolisk niveau, som generelt betragtes som tættere på den cellulære fænotype end genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avl og opdræt af alle mus, der anvendes til denne protokol, blev udført i et konventionelt dyreanlæg ved Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics (MPI-IE) i henhold til de lokale myndigheders regler (Regierungspräsidium Freiburg). Mus blev aflivet med CO2 og cervikal dislokation af FELASA B-uddannet personale efter retningslinjer og regler godkendt af dyrevelfærdsudvalget i MPI-IE og de lokale myndigheder. Der blev ikke udført dyreforsøg, og mus var uden sundhedsmæssige byrder.
BEMÆRK: Meget følsomme analysemetoder såsom LC-MS-metoden, der anvendes i denne protokol, har potentiale til at detektere selv meget små kontamineringer i prøven. Derfor er det yderst vigtigt at minimere sådanne forureninger. Den vigtigste foranstaltning er at bære rene handsker, når du rører ved noget, der kommer i kontakt med prøverne. Dette omfatter for eksempel forberedelse af buffere og kappevæske, mærkning af prøverør og rengøring af laboratorieudstyr. Desuden bør engangslabware anvendes, når det er muligt. Glasvarer skal skylles med opløsningsmidler af LC-MS-kvalitet før brug. Et rent arbejdsmiljø hjælper yderligere med at reducere forureninger.
1. Generelle præparater
- Forbered intern standardstamopløsning: Forbered 6 mg/ml chlorphenylalanin (CLF) og 6 mg/ml aminoterephtalsyre (ATA) i 30% v/v 2-propanol i ultrarent vand.
- Forbered FACS-resuspensionsbuffer: Tilsæt 0,9 g NaCl, 99,5 ml ultrarent vand og 0,5 ml intern standardstamopløsning. Forafkøles til 4 °C.
- Forbered kappevæske: I en kappevæsketank opløses 30 g NaCl i 6 liter deioniseret vand og tilsluttes en cellesorterer.
BEMÆRK: Koncentrationen af NaCl i kappevæsken er optimeret til at tillade afbøjning af dråber i sorteren, der er lige så robust som ved brug af PBS som kappevæske og samtidig for at minimere negative virkninger på metabolitdetektion ved LC-MS12. Lavere koncentrationer af NaCl er fordelagtige for metabolitdetektion, men forringer den robuste sortering af celler.
2. Isolering af B- og T-celler fra milten
- 90 ml fosfatbufret saltvand (PBS) forkøles pr. mus i køleskab eller på is til 4 °C. Centrifugen forafkøles til 4 °C.
- Isolering af milt
BEMÆRK: Det er mest vigtigt at arbejde hurtigt, på is og med kolde (4 °C) buffere under celleisolering og de følgende farvningstrin. Ellers kan cellernes metaboliske profil ændre sig betydeligt.- Forbered 1,5 ml PBS i et 2 ml reaktionsrør på is.
- Aflive en C57BL6/J-mus i henhold til de retningslinjer og metoder, der er godkendt af lokale myndigheder.
- Steriliser pels med 70% ethanol.
- Åbn maven med en saks og fjern milten ved hjælp af fine tang uden at sprænge organet. Milten anbringes straks i kold PBS (4 °C).
- Generering af en enkeltcellesuspension
- Anbring en 70 μm cellesi på et 50 ml centrifugerør og våd det med PBS. Milten ledes gennem masken ved hjælp af tommelfingerstøtten på et sprøjtestempel og 30 ml kold PBS (4 °C)
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min. Supernatanten fjernes.
- Pellet resuspenderes i 1 ml ACK-lysisbuffer og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur (RT; 20 °C).
- Tilsæt 50 ml kold PBS (4 °C). Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min, og supernatanten kasseres.
- FACS-farvning
- Forbered antistofcocktailen i 500 μL kold PBS (4 °C) pr. mus: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Resuspender cellepillen i antistofcocktailen. Overfør til et 5 ml FACS-rør. Der inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
- Tilsæt 3 ml kold PBS (4 °C). Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min, og supernatanten kasseres.
- Cellepelletsen resuspenderes igen i 1 ml kold FACS-resuspensionsbuffer (4 °C). Filtrer cellerne gennem et FACS-rør med filterhætte. Celler er klar til flowcytometribaseret sortering.
3. Isolering af HSC'er og MPP'er fra knoglemarv
- Disseker og isoler knoglemarven.
BEMÆRK: Det er mest vigtigt at arbejde hurtigt og holde isolerede knogler og celler kolde (4 ° C) under hele proceduren for at give nøjagtige resultater. For at minimere baggrundssignaler skal du desuden arbejde og bruge et rent rum og laboratorieudstyr.- Aflive mus i henhold til retningslinjer og metoder, der er godkendt af lokale myndigheder.
- Spray 70% ethanol på den nederste del af musene.
- Disseker benene og rygsøjlerne ved hjælp af en saks. Lav et snit på ryggen og stræk snittet rundt til maven. Skræl huden fra bagbenene.
- Rip eller skær bagbenene af, og sørg for, at benene indeholder skinnebenet, lårbenet og hofteleddet.
- Tag saksen og klip dem tæt langs rygsøjlen, indtil den er helt fjernet.
- Ben og rygsøjler fordeles i plader med 6 brønde indeholdende koldt PBS (4 °C), og pladerne lægges på is.
- Rens lårbenet, skinnebenet, hofteleddet og ryghvirvlerne i blødt væv ved hjælp af en skalpel og saks.
- De rensede knogler knuses med mørtel og støderen i 5 ml koldt PBS (4 °C).
- Cellesuspensionen filtreres gennem en 40 μm cellesi over i et 50 ml rør.
- Gentag trin 3.1.8-3.1.9, indtil knoglerne ser helt hvide ud.
- Lysis af erythrocytter:
- Den høstede cellesuspension centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Cellepellet resuspenderes i 1 ml kold ACK-buffer (4 °C). Inkuber i 5 minutter på is.
- Der tilsættes kold PBS (4 °C) for at standse reaktionen (valgfrit).
- Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Udtømning af afstamning:
BEMÆRK: For at berige for afstamningsnegative (Lin-) celler blev der brugt et negativt selektionssæt til CD4-celler.- Forbered de magnetiske perler:
- Tilsæt 500 μL perler i 2 ml mikrocentrifugeglas. Rørene anbringes på en magnet, og supernatanten kasseres.
- Perlerne vaskes med 1 ml koldt PBS (4 °C), og supernatanten kasseres.
- Tilsæt 500 μL kold PBS (4 °C) og hold perlerne kolde (4 °C).
- Inkuber cellerne med 500 μL afstamningscocktail (50 μL antistof leveret af kittet + 450 μL PBS) i 25 minutter (omrystning, 4 °C) i mørke.
- Cellerne vaskes med koldt PBS (4 °C).
- Centrifuger glasset ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kassér supernatanten.
- Cellerne resuspenderes i 1000 μL kold PBS (4 °C), og cellesuspensionen overføres til perleopløsningen.
- Der inkuberes i 15 minutter på et roterende hjul ved 4 °C.
- Placer rørene på en magnet, og vent, indtil opløsningen rydder. Supernatanten overføres til et frisk FACS-rør.
- Puds perlerne med 500 μL PBS.
- Placer rørene på en magnet, og vent, indtil opløsningen rydder.
- Supernatanten overføres til det friske FACS-rør.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Forbered de magnetiske perler:
- Farvning til FACS
- Der fremstilles 300 μL antistofblanding pr. mus i kold PBS (4 °C).
- Antistofblanding til stamceller/stamceller: HSC'er: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
- Cellerne inkuberes i 40 minutter i mørke ved 4 °C.
- Vask med 1 ml kold PBS (4 °C). Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml FACS-resuspensionsbuffer og filtrer cellerne gennem et FACS-rør med filterhætte.
4. FACS-sortering
- Konfigurer cellesorteringen.
- Isæt 70 μm dysespids. Aktivér 405 nm, 488 nm, 561 nm og 633 nm lasere.
- Indstil sorteringstilstand til 4-vejs renhed: flydemaske 0, renhedsmaske 32, fasemaske 0
- Indstil faldfrekvensen til 90.400 Hz, og juster amplitude og faldforsinkelse i henhold til producentens anvisninger. Indstil pladespændingen til 5000 V.
- Definer sorteringsportene i henhold til producentens anvisninger.
- For alle celletyper skal du først markere enkelte celler baseret på fremadrettet spredningssignal og sideværts spredningssignal efterfulgt af markering baseret på celletypespecifik farvning.
- For B-celler skal du vælge den AF647-positive, PE-negative population.
- For T-celler skal du vælge den PE-positive, AF647-negative population.
- For HSC'er skal du vælge populationen PE-Cy7-lav, PE-positiv, APC-Cy7-positiv, BV605-positiv, BV421-negativ.
- For MPP'er skal du vælge populationen PE-Cy7-lav, PE-positiv, APC-Cy7-positiv, BV421-positiv, BV605-negativ.
- For vragrestprøver skal du vælge hændelser, der er for små til at repræsentere intakte celler baseret på fremadrettet spredning og sideværts spredningssignal. Typiske FACS-plots, der viser disse gating-strategier, er vist i figur 2 og figur 3.
- Juster flowhastigheden for at opnå mindre end 15.000 hændelser/s.
- Klargør opsamlingsplade
- Forbered stamopløsning af gærekstrakt: Resuspender 1 prøve 13C gærekstrakt i 7,5 ml ultraren H2O og 2,5 ml methanol.
- Forbered ekstraktionsbuffer: Tilsæt 10 μL 13C gærekstraktstamopløsning til 10 ml acetonitril og bland.
- Forbered opsamlingsplade: Tilsæt 25 μL ekstraktionsbuffer til hvert hul i en 96 brønds PCR-plade, der vil blive brugt til at indsamle prøven. For at minimere fordampning skal du dække brønde med PCR-låg (striber skåret i singlets).
- Udfør cellesorteringen.
- Åbn opsamlingsbrøndene efter behov for at indsamle sorterede celler og luk dem så hurtigt som muligt for at minimere fordampning.
- Hvis prøverne ikke kan måles med det samme, opbevares de i forseglede beholdere ved -80 °C i flere dage. Efter optøning sonikeres prøverne i 5 minutter for at sikre fuldstændig resuspension af metabolitter.
5. LC-QQQ-MS-måling
- Forbered LC-opløsningsmidler
- Forbered medronsyrestamopløsning (100 mM): 17,6 mg medronsyre opløses i 1 ml ultrarenH2O.
- Forbered buffer A: Opløs 1,92 g ammoniumcarbonat i 1 liter ultraren H2O, og tilsæt 50 μL medronsyrestamopløsning.
- Forbered buffer B: Bland 50 ml buffer med 450 ml acetonitril.
- Forbered LC-testblanding: Bland 1 ppm hver af leucin, isoleucin, AMP, ADP og ATP i 80:20 acetonitril: ultrarenH2O.
BEMÆRK: Medronsyre kan opbevares ved -20 °C i flere måneder; andre buffere kan opbevares på RT i 2 dage.
- Program LC-QQQ-MS metode
- Optimer stofspecifikke MS-indstillinger (f.eks. kollisionsenergi) i henhold til producentens anvisninger. For instrumenter i Agilent 6495-serien skal du bruge indstillingerne i tillægstabel 1.
- Optimer kildespecifikke MS-indstillinger i henhold til producentens instruktioner. For instrumenter med JetStream opvarmet ESI-kilde skal du bruge følgende parametre: gastemperatur: 240 °C, gasstrøm: 15 l / min, forstøver: 50 psi, kappegastemperatur: 400 ° C, kappegasstrøm: 11 l / min, kapillærspænding: 2000 V, dysespænding: 300 V.
- Optimer indstillingerne for ionoverførselsoptik i henhold til producentens anvisninger. For Agilent-instrumenter med iFunnel-ionoptik skal du bruge følgende parametre: højtryks RF-positiv: 110 V, højtryks RF-negativ: 90 V, lavtryks RF-positiv: 80 V, lavtryks RF-negativ: 60 V.
- Programmér LC-gradienten: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μL/min; Stoptid 28 min. Kolonnetemperatur: 35 °C.
- Konfigurer LC-MS-instrumentet.
- Tilslut den kromatografiske søjle i det temperaturstyrede søjlerum.
- Tilslut bufferne, og ryd alle linjer.
- Kør mindst 4 blindprøver eller poolprøver for at afbalancere kolonnen.
- Kør LC-testmix for at kontrollere kromatografisk ydeevne. Sørg for, at følgende kriterier er opfyldt. Hvis ikke, skal du rengøre eller fejlfinde instrumentet, før du kører prøverne.
- Bekræft, at det indledende modtryk er <150 bar, og det maksimale modtryk er <400 bar.
- Bekræft, at retentionstiderne er i et ±1 min. vindue som følger: isoleucin 6,0 min, leucin 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min og ATP 12,7 min.
- Sørg for, at dalen mellem leucin og isoleucin i overgangen +132->86 er < 20 % af tophøjden.
- Sørg for, at forskellen i retentionstid AMP til ADP er 1,5 til 1,9 min, og forskellen i retentionstid ADP til ATP er 1,1 til 1,9 min.
- Oprette arbejdsliste
- Start med en blindprøve for at minimere overførsel fra LC-testblandingen.
- Kør prøverne i randomiseret rækkefølge.
- Afslut med en tom prøve for at rense kolonnen til fremtidige eksperimenter.
6. Forbehandling af data i automRm
BEMÆRK: Følgende trin diskuterer konvertering fra .d til .mzML i msconvert, forberedelse af metabdb, indlæsning af data og modeller og metabdb og generelle strategier for manuel peakgennemgang.
- Konverter rådata fra .d-format til .mzML-format ved hjælp af ProteoWizard20 med følgende indstillinger: binær kodningspræcision: 32-bit, MS-niveau 1-2, Skriveindeks valgt, Brug zlib-komprimering valgt.
- Start R.
- Installer automRm21 i henhold til pakkedokumentationen (kræves kun én gang før første brug).
- Start automRm GUI i R: automRm::automrm_gui()
- Behandl batchen af .d-filer under fanen Behandl > Behandl batch.
- Vælg .xlsx fil, der indeholder metabolitoplysninger. Denne fil skal svare til LC-QQQ-MS-metoden.
- Markere. RData-fil med ML-model med spidsbelastning.
- Markere. RData-fil, der indeholder ML-modellen til spidsrapportering.
- Vælg den projektmappe, der indeholder .mzML-filer.
- Start dataforbehandling ved at klikke på Behandl batch.
- Når forbehandlingen er afsluttet, skal du åbne peakoverview.pdf for at kontrollere den korrekte påvisning af kromatografiske toppe. Du kan også indlæse automRmdata_Review.RData fra fanen Gennemse i automRm GUI for manuelt at ændre spidsbelastningsfiltrering og spidsbelastningsintegration.
- Åbn peakinfo.xlsx fra projektmappen, og kontroller dataene.
- Kontroller 13C internt standardsignal i fanen 13CArea: Sørg for, at der ikke er systematiske forskelle i intensitetsværdierne mellem eksperimentelle grupper og mellem celleprøver og snavsprøver. Hvis sådanne forskelle findes, skal du kun bruge data fra fanerne NormArea eller NormHeight til efterfølgende analyse; Ellers skal du bruge data fra fanerne RawArea eller RawHeight.
- Kontroller signalintensiteten af interne standarder ATA og CLF i fanen RawArea. Sørg for, at der ikke er systematiske forskelle i intensiteten af nogen af forbindelserne blandt eksperimentelle grupper.
- For hver metabolit sammenlignes signalintensiteten af prøver, der indeholder celler, med affaldsprøverne fra den samme cellesuspension. Brug en passende statistisk test til at identificere metabolitter, hvor prøver, der indeholder celler, har højere intensiteter end affaldsprøver. Medtag kun metabolitter, der består denne test, i efterfølgende dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-sortering muliggør isolering af rene populationer af forskellige celletyper fra den samme cellesuspension (figur 2 og figur 3). Specificiteten af denne metode afhænger af farvningen af de forskellige celletyper med specifikke overflademarkører (for eksempel B-celler og T-celler fra milten) eller specifikke kombinationer af overflademarkører (for eksempel HSC'er og MPP'er). Farvning af intracellulære markører kræver typisk permeabilisering af cellemembranen. Dette kan forårsage lækage af metabolitter, og derfor er denne type farvning ikke egnet til at blive brugt i denne protokol.
LC tilvejebringer adskillelse af metabolitter før påvisning af MS (figur 4). Metabolitter eluerer fra HILIC-søjlen omtrent sorteret efter polaritet, med mindre polære forbindelser, der eluerer tidligt, og flere polære metabolitter, der eluerer senere. Signalintensiteten bestemmes af mængden af en målmetabolit i prøven og en metabolitspecifik responsfaktor. Derfor kan signalintensiteter ikke meningsfuldt sammenlignes på tværs af metabolitter, men kun for én metabolit på tværs af prøver. De 3 toppe, der er fremhævet i figur 4 , repræsenterer 1: niacinamid detekteres i både affald og celleekstrakt, omend på forskellige niveauer, 2: acetylcarnitin, der næsten udelukkende detekteres i celleekstrakter, og 3: den interne standard aminoterephatalinsyre, der detekteres på samme niveau i affaldsprøver og celleekstrakter.
Metaboliske forskelle mellem celletyper fra samme væv bevares ved hjælp af den kombinerede FACS-LC-MS-protokol (figur 5). For HSC'er og MPP'er skulle celler fra 6 mus generere 6 prøver, hvilket førte til en større variabilitet inden for hver gruppe sammenlignet med B-celler og T-celler, som blev sorteret fra den samme murinmilt. Affaldsprøver, der repræsenterer procesblindprøveprøver, er klart adskilt fra prøver, der indeholder celleekstrakter. Inden for affaldsprøverne er en klar adskillelse af de to eksperimenter synlig, hvilket fremhæver forskellen i metabolisk miljø, som cellerne oplever før sorteringen. Når de er repræsenteret i et grupperet varmekort (figur 6), bliver yderligere oplysninger synlige, såsom de relative niveauer af metabolitter på tværs af prøver.
Figur 1: Oversigt over vigtige trin i den præsenterede protokol. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Schönberger et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isolering af rene populationer af B-celler og T-celler fra milten. Celler og snavshændelser blev valgt baseret på fremadrettede scatter (FSC) og sideward scatter (SSC) signaler. B-celler og T-celler blev valgt baseret på celletypespecifikke farvningssignaler. Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Schönberger et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dyrkning af HSC og MPP fra knoglemarv. Celler og snavshændelser blev valgt baseret på fremadrettede scatter (FSC) og sideward scatter (SSC) signaler. HSC- og MPP-populationer blev udvalgt ud fra flere stadier af celletypespecifikke farvningssignaler. Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Schönberger et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempel på kromatogrammer. Prøver med (A) 5000 HSC'er og (B) 5000 vragrester af samme slags. Bemærk, at aksen deler samme skala i begge paneler. Fremhævede metabolitter er 1: nikotinamid, 2: acetylcarnitin, 3: aminoterephtalsyre (ATA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Hovedkomponentanalyse (PCA) af metaboliske profiler af forskellige celletyper og baggrundsprøver af affald fra de samme forsøg. Større adskillelse observeres mellem de forskellige organer og baggrundsprøver fra affald fra ethvert organ. Derudover er celletyper tydeligt adskilt i cellerne i hvert organ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Heatmap, der repræsenterer metabolitter målt på tværs af forskellige celletyper og matchende baggrundskontrolprøver (affald). Manglende værdier blev imputeret med den halve minimumsværdi af den samme metabolit på tværs af alle prøver. Til plotning blev data normaliseret til maksimum separat i hver række. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Tabellen viser de stofspecifikke indstillinger for de valgte metabolitter, herunder retentionstid (RT), polaritet (Pol), forløber m/z (Q1), fragment m/z (Q3) og kollisionsenergi (CE). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin for en vellykket implementering af målrettet metabolomics ved hjælp af denne protokol er 1) en robust farvnings- og gatingstrategi, der giver rene cellepopulationer, 2) præcis håndtering af væskevolumener, 3) reproducerbar timing af alle eksperimentelle trin, især alle trin før metabolitekstraktion. Ideelt set bør alle prøver, der tilhører et forsøg, behandles og måles i en batch for at minimere batcheffekter22. Ved større forsøg foreslår vi, at man samler celleekstrakter ved -80 °C og derefter måler alle ekstrakter i én batch.
Ved arbejde med lavinputprøver skal der lægges vægt på ren håndtering af alle materialer, der anvendes i løbet af forsøgene23. Almindelige forureninger er restbuffer, rengøringsmidler og hudplejeprodukter. Den vigtigste foranstaltning for at minimere kontaminering er brugen af egnede handsker under hele eksperimentet.
For at minimere potentielle ændringer i metabolitsammensætningen som følge af cellernes eksponering for ufysiologiske tilstande er det afgørende at forberede prøverne på is og med kolde reagenser (4 °C) er afgørende. Hvis du er så hurtig som muligt før FACS-trinnet, øges kvaliteten af måling2. De angivne tider for antistoffarvning er så korte som rimelige for god farvningseffektivitet. Et yderligere trin til blokering af den uspecifikke binding af antistoffer til Fc-receptorer ved anvendelse af Fc-blokantistoffer kunne tilføjes før FACS-farvningsproceduren24,25. Dette forhindrer kontaminering af målcellepopulationerne og er især tilrådeligt, når man arbejder med cellesuspensioner, der omfatter mange Fc-receptor høje celletyper (som monocytter eller makrofager) eller celler, der blev dyrket uden serum. Det vil dog øge den samlede håndteringstid med 10-15 minutter og kan derfor tilføje yderligere ikke-fysiologisk variation til resultaterne.
Ved brug af dynamiske MRM-metoder på moderne massespektrometre kan alle metabolitter, der er opført i stofspecifikke indstillinger, registreres med en enkelt injektion. Begrænsning af antallet af målmetabolitter gør det muligt at implementere den beskrevne protokol på ældre massespektrometre og fremskynder dataforbehandling og dataanalyse.
Et vist niveau af baggrundssignal i LC-MS-dataene er uundgåeligt. Derfor skal man være meget omhyggelig med at identificere de metabolitter, der kan påvises over baggrunden. Sorteringshændelser, der er for små til at repræsentere intakte celler (affald), genererer relevante procesblindprøver, der repræsenterer matrixafhængige baggrundssignalintensiteter. Desuden gør interne standarder det muligt at identificere problematiske prøver, der bør udelukkes fra yderligere dataanalyse26. Begge kvalitetssikringsforanstaltninger fungerer bedst, hvis der er et tilstrækkeligt stort antal replikater til rådighed. Vi anbefaler, at du bruger mindst seks replikater pr. gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke dyreanlægget ved Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics for at levere de dyr, der anvendes i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
