Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65690
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant de mesurer avec précision et fiabilité les métabolites dans les types de cellules rares. Des améliorations techniques, y compris un fluide de gaine modifié pour le tri cellulaire et la génération d’échantillons à blanc pertinents, permettent une quantification complète des métabolites avec une entrée de seulement 5000 cellules par échantillon.

Abstract

La fonction cellulaire dépend de manière critique du métabolisme, et la fonction des réseaux métaboliques sous-jacents peut être étudiée en mesurant les intermédiaires de petites molécules. Cependant, l’obtention de mesures précises et fiables du métabolisme cellulaire, en particulier dans les types de cellules rares comme les cellules souches hématopoïétiques, a traditionnellement nécessité la mise en commun de cellules provenant de plusieurs animaux. Un protocole permet désormais aux chercheurs de mesurer les métabolites dans des types de cellules rares en utilisant une seule souris par échantillon tout en générant plusieurs répétitions pour des types de cellules plus abondants. Cela réduit le nombre d’animaux nécessaires pour un projet donné. Le protocole présenté ici comporte plusieurs différences clés par rapport aux protocoles métabolomiques traditionnels, telles que l’utilisation de 5 g/L de NaCl comme fluide de gaine, le tri directement dans l’acétonitrile et l’utilisation d’une quantification ciblée avec une utilisation rigoureuse d’étalons internes, permettant des mesures plus précises et plus complètes du métabolisme cellulaire. Malgré le temps nécessaire à l’isolement des cellules individuelles, à la coloration fluorescente et au tri, le protocole permet de préserver dans une large mesure les différences entre les types de cellules et les traitements médicamenteux.

Introduction

Le métabolisme est un processus biologique essentiel qui se produit dans toutes les cellules vivantes. Les processus métaboliques impliquent un vaste réseau de réactions biochimiques étroitement régulées et interconnectées, permettant aux cellules de produire de l’énergie et de synthétiser des biomolécules essentielles1. Pour comprendre la fonction des réseaux métaboliques, les chercheurs mesurent les niveaux de petites molécules intermédiaires dans les cellules. Ces intermédiaires servent d’indicateurs importants de l’activité métabolique et peuvent révéler des informations essentielles sur la fonction cellulaire.

La spectrométrie de masse (MS) est le choix le plus populaire pour la détection spécifique des métabolites dans des échantillons complexes 1,2. La résonance magnétique nucléaire (RMN) présente des avantages dans la quantification absolue des composés et l’élucidation de la structure, mais la spectrométrie de masse peut souvent résoudre davantage de composants dans des mélanges complexes tels que des biofluides ou des extraits cellulaires. Le plus souvent, la MS est associée à une séparation préalable du composé par électrophorèse capillaire (EC), chromatographie en phase gazeuse (GC) ou chromatographie liquide (LC)3. Le choix de la plate-forme de séparation est principalement motivé par la gamme de métabolites cibles et le type d’échantillon et, dans un contexte réel, par la disponibilité des machines et de l’expertise. Les trois plates-formes de séparation ont une gamme large et chevauchante de métabolites appropriés, mais des limites différentes. En bref, l’EC ne peut séparer que des molécules chargées et nécessite beaucoup d’expertise pour mettre en œuvre une analyse robuste d’un grand nombre d’échantillons4. La GC est limitée aux molécules suffisamment petites et apolaires pour s’évaporer avant de se décomposer3. Si l’on considère toutes les colonnes LC disponibles dans le commerce, deux métabolites quelconques peuvent être séparés par cette technologie5. Cependant, de nombreuses méthodes LC présentent un pouvoir de résolution inférieur à celui des méthodes CE ou GC de longueur similaire.

La quantité typique de matière première pour les mesures métabolomiques est généralement de l’ordre de 5 x 105 à 5 x 107 cellules par échantillon, 5 à 50 mg de tissu humide ou 5 à 50 μL de liquide corporel6. Cependant, il peut être difficile d’obtenir de telles quantités de matière première lorsque l’on travaille avec des cellules primaires de types cellulaires rares, comme par exemple les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ou les cellules tumorales circulantes. Ces cellules sont souvent présentes en très faible nombre et ne peuvent pas être cultivées sans compromettre les caractéristiques cellulaires critiques.

Les CSH et les cellules progénitrices multipotentes (MPP) sont les cellules les moins différenciées du système hématopoïétique et produisent continuellement de nouvelles cellules sanguines tout au long de la vie d’un organisme. La régulation de l’hématopoïèse est d’une pertinence clinique dans des conditions telles que la leucémie et l’anémie. Malgré leur importance, les CSH et les MPP sont parmi les cellules les plus rares du système hématopoïétique. À partir d’une seule souris, en général, environ 5000 CSH peuvent être isolées 7,8,9. Comme les méthodes métabolomiques traditionnelles nécessitent plus de matériel d’entrée, la mise en commun de cellules de plusieurs souris était souvent nécessaire pour analyser des types de cellules rares10,11.

Ici, nous avons cherché à développer un protocole qui permet de mesurer les métabolites dans aussi peu que 5000 cellules par échantillon afin de permettre la génération de données métabolomiques à partir des CSH d’une seule souris12. En même temps, cette méthode permet de générer plusieurs répétitions à partir d’une seule souris pour des types de cellules plus abondants comme les lymphocytes. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux requis pour un projet donné, contribuant ainsi aux « 3R » (réduction, remplacement, raffinement) de l’expérimentation animale.

Les métabolites dans les cellules peuvent avoir des taux de renouvellement très élevés, souvent de l’ordre de quelques secondes13. Cependant, la préparation des échantillons pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut prendre des heures, et le tri FACS lui-même peut prendre de quelques minutes à quelques heures, ce qui entraîne des altérations potentielles du métabolome en raison de conditions non physiologiques. Certains des réactifs utilisés dans ce protocole (tels que le tampon de lyse de chlorure d’ammonium-potassium [ACK]) peuvent avoir des effets similaires. Ces conditions peuvent causer un stress cellulaire et avoir un impact sur les niveaux et les ratios de métabolites dans les cellules, ce qui conduit à des mesures inexactes ou biaisées du métabolisme cellulaire 14,15,16. Les changements métaboliques dus à la préparation des échantillons sont parfois appelés artefacts de tri. Les longs protocoles de digestion et les réactifs agressifs qui pourraient être nécessaires pour produire des suspensions unicellulaires à partir de tissus durs ou durs peuvent aggraver ce problème. Les changements qui peuvent se produire dépendent probablement du type de cellule et des conditions de traitement. La nature précise de ces changements reste inconnue, car l’état métabolique des cellules non perturbées dans les tissus vivants ne peut pas être mesuré.

Le protocole présenté ici comporte plusieurs différences clés par rapport aux méthodes traditionnelles, à savoir l’utilisation de 5 g/L de NaCl comme fluide de gaine, le tri directement dans le tampon d’extraction, l’injection de grands volumes d’échantillons sur la chromatographie liquide à interaction hydrophile-spectrométrie de masse (HILIC-MS), et l’utilisation d’une quantification ciblée, l’utilisation rigoureuse d’étalons internes et de contrôles de fond (Figure 1). Ce protocole a le potentiel de préserver les différences entre les types de cellules et entre le traitement médicamenteux et le contrôle des véhicules dans une large mesure12. Même pour les cellules en culture, elle se compare favorablement à d’autres approches, telles que la centrifugation plus établie et l’élimination manuelle du surnageant. Cependant, comme des artefacts de tri peuvent encore se produire, les données doivent être interprétées avec prudence. Malgré cette limitation, le protocole représente une amélioration significative dans le domaine du profilage métabolique, permettant des mesures plus précises et plus complètes du métabolisme cellulaire dans les cellules primaires rares12.

La capacité de mesurer de manière robuste de larges profils métaboliques dans des cellules primaires rares ouvre la porte à de nouvelles expériences de recherche biomédicale impliquant ces cellules. Par exemple, il a été démontré que la régulation à médiation métabolique dans les CSH a un impact sur la capacité d’auto-renouvellement de la dormance, avec des implications pour l’anémie et la leucémie11,17. Dans les cellules tumorales circulantes dérivées de patients, des différences dans l’expression des gènes métaboliques entre la tumeur et les cellules adjacentes ont été démontrées18,19. Ce protocole permet aujourd’hui aux chercheurs d’étudier systématiquement ces différences au niveau métabolique, généralement considéré comme plus proche du phénotype cellulaire que de l’expression des gènes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L’élevage et l’élevage de toutes les souris utilisées pour ce protocole ont été effectués dans une animalerie conventionnelle de l’Institut Max Planck d’immunobiologie et d’épigénétique (MPI-IE) conformément aux réglementations des autorités locales (Regierungspräsidium Freiburg). Les souris ont été euthanasiées avec du CO2 et une luxation du col de l’utérus par du personnel formé par FELASA B conformément aux directives et réglementations approuvées par le comité de protection des animaux du MPI-IE et les autorités locales. Aucune expérimentation animale n’a été effectuée et les souris n’ont pas été affectées à la santé.

REMARQUE : Les méthodes analytiques très sensibles telles que la méthode LC-MS utilisée dans ce protocole ont le potentiel de détecter même des contaminations très mineures dans l’échantillon. Par conséquent, il est de la plus haute importance de minimiser ces contaminations. La mesure la plus importante est de porter des gants propres chaque fois que vous touchez quelque chose qui entre en contact avec les échantillons. Cela inclut, par exemple, la préparation des tampons et du liquide de gaine, l’étiquetage des tubes d’échantillons et le nettoyage de l’équipement de laboratoire. De plus, le matériel de laboratoire à usage unique doit être utilisé dans la mesure du possible. La verrerie doit être rincée avec des solvants de qualité LC-MS avant utilisation. Un environnement de travail propre contribue également à réduire les contaminations.

1. Préparatifs généraux

  1. Préparer la solution mère étalon interne : Préparer 6 mg/mL de chlorophénylalanine (CLF) et 6 mg/mL d’acide aminotéréphtalique (ATA) dans 30 % v/v de 2-propanol dans de l’eau ultrapure.
  2. Préparer le tampon de remise en suspension FACS : Ajouter 0,9 g de NaCl, 99,5 mL d’eau ultrapure et 0,5 mL de solution mère étalon interne. Pré-refroidir à 4 °C.
  3. Préparer le liquide de la gaine : Dans un réservoir de fluide de la gaine, dissoudre 30 g de NaCl dans 6 L d’eau déminéralisée et le connecter à un trieur de cellules.
    REMARQUE : La concentration de NaCl dans le liquide de la gaine a été optimisée pour permettre la déviation des gouttelettes dans le trieur qui est aussi robuste que lors de l’utilisation du PBS comme fluide de gaine et simultanément pour minimiser les effets négatifs sur la détection des métabolites par LC-MS12. Des concentrations plus faibles de NaCl sont avantageuses pour la détection des métabolites, mais nuisent au tri robuste des cellules.

2. Isolement des lymphocytes B et T de la rate

  1. Pré-refroidir 90 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par souris au réfrigérateur ou sur de la glace à 4 °C. Pré-refroidir une centrifugeuse à 4 °C.
  2. Isolement de la rate
    REMARQUE : Il est essentiel de travailler rapidement, sur de la glace et avec des tampons froids (4 °C) pendant l’isolement des cellules et les étapes de coloration suivantes. Sinon, le profil métabolique des cellules pourrait changer considérablement.
    1. Préparer 1,5 mL de PBS dans un tube de réaction de 2 mL sur de la glace.
    2. Euthanasier une souris C57BL6/J selon les directives et méthodes approuvées par les autorités locales.
    3. Stériliser la fourrure avec 70 % d’éthanol.
    4. Ouvrez l’abdomen avec des ciseaux et retirez la rate à l’aide d’une pince fine sans rompre l’organe. Placer immédiatement la rate dans du PBS froid (4 °C).
  3. Génération d’une suspension unicellulaire
    1. Placez une crépine de 70 μm sur un tube à centrifuger de 50 ml et mouillez-le avec du PBS. Passez la rate à travers le filet à l’aide du repose-pouce d’un piston de seringue et de 30 mL de PBS froid (4 °C)
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant.
    3. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lyse ACK et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT ; 20 °C).
    4. Ajouter 50 mL de PBS froid (4 °C). Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
  4. Coloration FACS
    1. Préparer le cocktail d’anticorps dans 500 μL de PBS froid (4 °C) par souris : CD3-PE (1 :200), B220-A647 (1 :200).
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le cocktail d’anticorps. Transférer dans un tube FACS de 5 ml. Incuber pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
    3. Ajouter 3 mL de PBS froid (4 °C). Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
    4. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de remise en suspension FACS à froid (4 °C). Filtrez les cellules à l’aide d’un tube FACS à capuchon filtrant. Les cellules sont prêtes pour le tri par cytométrie en flux.

3. Isolement des CSH et des MPP de la moelle osseuse

  1. Disséquer et isoler la moelle osseuse.
    REMARQUE : Il est essentiel de travailler rapidement et de garder les os et les cellules isolés froids (4 °C) pendant toute la procédure pour permettre des résultats précis. De plus, pour minimiser les signaux de fond, travaillez et utilisez un espace propre et des équipements de laboratoire.
    1. Euthanasiez les souris selon les directives et les méthodes approuvées par les autorités locales.
    2. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la partie inférieure des souris.
    3. Disséquez les pattes et les épines à l’aide de ciseaux. Faites une incision dans le dos et prolongez la coupure jusqu’à l’abdomen. Décollez la peau des membres postérieurs.
    4. Déchirez ou coupez les membres postérieurs et assurez-vous que les pattes contiennent le tibia, le fémur et l’articulation de la hanche.
    5. Prenez les ciseaux et coupez-les le long de la colonne vertébrale jusqu’à ce qu’ils soient complètement retirés.
    6. Répartissez les pattes et les épines dans des plaques à 6 puits contenant du PBS froid (4 °C) et gardez les plaques sur de la glace.
    7. Nettoyez le fémur, le tibia, l’articulation de la hanche et les vertèbres des tissus mous à l’aide d’un scalpel et de ciseaux.
    8. Écraser les os nettoyés à l’aide d’un mortier et d’un pilon dans 5 mL de PBS froid (4 °C).
    9. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube de 50 ml.
    10. Répétez les étapes 3.1.8 à 3.1.9 jusqu’à ce que les os apparaissent complètement blancs.
  2. Lyse des érythrocytes :
    1. Centrifuger la suspension cellulaire récoltée à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon ACK froid (4 °C). Incuber 5 minutes sur glace.
    3. Ajouter du PBS froid (4 °C) pour arrêter la réaction (facultatif).
    4. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  3. Épuisement de la lignée :
    NOTA : Pour enrichir les cellules de lignée négative (Lin-), on a utilisé une trousse de sélection négative pour les cellules CD4.
    1. Préparez les billes magnétiques :
      1. Ajouter 500 μL de billes dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL. Placez les tubes sur un aimant et jetez le surnageant.
      2. Lavez les billes avec 1 mL de PBS froid (4 °C) et jetez le surnageant.
      3. Ajouter 500 μL de PBS froid (4 °C) et garder les billes froides (4 °C).
    2. Incuber les cellules avec 500 μL de cocktail de lignage (50 μL d’anticorps fournis par le kit + 450 μL de PBS) pendant 25 min (agitation, 4 °C) dans l’obscurité.
    3. Lavez les cellules avec du PBS froid (4 °C).
    4. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    5. Remettre les cellules en suspension dans 1000 μL de PBS froid (4 °C) et transférer la suspension cellulaire dans la solution de billes.
    6. Incuber pendant 15 min sur une roue tournante à 4 °C.
    7. Placez les tubes sur un aimant et attendez que la solution s’éclaircisse. Transférez le surnageant dans un tube FACS frais.
    8. Lavez les billes avec 500 μL de PBS.
    9. Placez les tubes sur un aimant et attendez que la solution s’éclaircisse.
    10. Transférez le surnageant dans le tube FACS frais.
    11. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  4. Coloration pour FACS
    1. Préparer 300 μL de mélange d’anticorps par souris dans du PBS froid (4 °C).
    2. Mélange d’anticorps pour cellules souches/progénitrices : CSH : CD4 (1 :1000)/ CD8a (1 :1000)/ B220(1 :1000)/ Ter119(1 :500)/ Gr-1(1 :1000)/ CD11b - PeCy7(1 :1000), c-Kit - PE(1 :1000), Sca1 - APC-Cy7(1 :500), CD48 - BV421(1 :1000), CD150 - BV605(1 :300)
    3. Incuber les cellules pendant 40 min dans l’obscurité à 4 °C.
    4. Laver avec 1 mL de PBS froid (4 °C). Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    5. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de remise en suspension FACS et filtrer les cellules à travers un tube FACS à capuchon filtrant.

4. Tri FACS

  1. Configurez le trieur de cellules.
    1. Insérez l’embout de la buse de 70 μm. Activez les lasers 405 nm, 488 nm, 561 nm et 633 nm.
    2. Définissez le mode de tri sur Pureté à 4 voies : masque de rendement 0, masque de pureté 32, masque de phase 0
    3. Réglez la fréquence de chute sur 90 400 Hz et ajustez l’amplitude et le délai de chute conformément aux instructions du fabricant. Réglez la tension de la plaque sur 5000 V.
    4. Définissez les portes de tri selon les instructions du fabricant.
      1. Pour tous les types de cellules, sélectionnez d’abord des cellules individuelles en fonction du signal de diffusion vers l’avant et vers le côté, puis sélectionnez des cellules en fonction de la coloration spécifique au type de cellule.
      2. Pour les lymphocytes B, sélectionnez la population AF647 positive et PE négative.
      3. Pour les lymphocytes T, sélectionnez la population PE positive et AF647 négative.
      4. Pour les CSH, sélectionnez la population PE-Cy7-faible, PE-positive, APC-Cy7-positive, BV605-positive, BV421-négative.
      5. Pour les MPP, sélectionnez la population PE-Cy7-faible, PE-positive, APC-Cy7-positive, BV421-positive, BV605-négative.
      6. Pour les échantillons de débris, sélectionnez les événements qui sont trop petits pour représenter les cellules intactes en fonction du signal de diffusion vers l’avant et du signal de diffusion latérale. Les diagrammes FACS typiques illustrant ces stratégies de déclenchement sont présentés à la figure 2 et à la figure 3.
    5. Ajustez le débit pour obtenir moins de 15 000 événements/s.
  2. Préparer la plaque de collecte
    1. Préparer la solution mère d’extrait de levure : Remettre en suspension 1 aliquote d’extrait de levure 13C dans 7,5 mL de H2O ultrapur et 2,5 mL de méthanol.
    2. Préparer le tampon d’extraction : Ajouter 10 μL de solution mère d’extrait de levure 13C à 10 mL d’acétonitrile et mélanger.
    3. Préparer la plaque de prélèvement : Ajouter 25 μL du tampon d’extraction à chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits qui sera utilisée pour prélever l’échantillon. Pour minimiser l’évaporation, couvrez les puits avec des couvercles PCR (bandes découpées en maillots).
  3. Effectuez le tri des cellules.
    1. Ouvrez les puits de collecte au besoin pour recueillir les cellules triées et fermez-les dès que possible pour minimiser l’évaporation.
  4. Si les échantillons ne peuvent pas être mesurés immédiatement, conservez-les dans des récipients hermétiques à -80 °C pendant plusieurs jours. Après décongélation, soniser les échantillons pendant 5 min pour assurer une remise en suspension complète des métabolites.

5. Mesure LC-QQQ-MS

  1. Préparer les solvants LC
    1. Préparer la solution mère d’acide médronique (100 mM) : Dissoudre 17,6 mg d’acide médronique dans 1 mL de H2O ultrapur.
    2. Préparer le tampon A : Dissoudre 1,92 g de carbonate d’ammonium dans 1 L de H2O ultrapur et ajouter 50 μL de solution mère d’acide médronique.
    3. Préparer le tampon B : Mélanger 50 mL de tampon avec 450 mL d’acétonitrile.
    4. Préparer le mélange d’essai LC : Mélanger 1 ppm de leucine, d’isoleucine, d’AMP, d’ADP et d’ATP dans de l’acétonitrile 80 :20 : H2O ultrapur.
      REMARQUE : Le stock d’acide Medronic peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs mois ; d’autres tampons peuvent être conservés à RT pendant 2 jours.
  2. Méthode LC-QQQ-MS du programme
    1. Optimisez les paramètres MS spécifiques au composé (par exemple, l’énergie de collision) conformément aux instructions du fabricant. Pour les instruments de la série Agilent 6495, utilisez les paramètres du tableau supplémentaire 1.
    2. Optimisez les paramètres MS spécifiques à la source conformément aux instructions du fabricant. Pour les instruments avec source ESI chauffée par JetStream, utilisez les paramètres suivants : température du gaz : 240 °C, débit de gaz : 15 L/min, nébuliseur : 50 psi, température du gaz de la gaine : 400 °C, débit du gaz de la gaine : 11 L/min, tension capillaire : 2000 V, tension de la buse : 300 V.
    3. Optimisez les réglages de l’optique à transfert d’ions selon les instructions du fabricant. Pour les instruments Agilent équipés d’une optique ionique iFunnel, utilisez les paramètres suivants : haute pression RF positive : 110 V, haute pression RF négative : 90 V, basse pression RF positive : 80 V, basse pression RF négative : 60 V.
    4. Programmez le gradient LC : 0 min, 95% B, 150 μL/min ; 18 min, 55 % B, 150 μL/min ; 19 min, 30 % B, 150 μL/min ; 21,5 min, 30 % B, 150 μL/min ; 22 min, 95 % B, 150 μL/min ; 22,7 min, 95 % B, 200 μL/min, 23,5 min, 95 % B, 400 μL/min ; Temps d’arrêt 28 min. Température de la colonne : 35 °C.
  3. Configurez l’instrument LC-MS.
    1. Raccordez la colonne chromatographique dans le compartiment de la colonne à température contrôlée.
    2. Connectez les tampons et purgez toutes les lignes.
    3. Exécutez au moins 4 échantillons vierges ou regroupez des échantillons pour équilibrer la colonne.
  4. Exécutez le mélange de test LC pour vérifier les performances chromatographiques. Assurez-vous que les critères suivants sont remplis. Si ce n’est pas le cas, nettoyez ou dépannez l’instrument avant d’exécuter les échantillons.
    1. Confirmez que la contre-pression initiale est de <150 bar et que la contre-pression maximale est de <400 bar.
    2. Confirmez que les temps de rétention se situent dans une fenêtre de ±1 min comme suit : isoleucine 6,0 min, leucine 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min et ATP 12,7 min.
    3. S’assurer que la vallée entre la leucine et l’isoleucine dans la transition +132->86 est < 20 % de la hauteur du pic.
    4. Assurez-vous que la différence de temps de rétention AMP à ADP est de 1,5 à 1,9 min, et que la différence de temps de rétention ADP à ATP est de 1,1 à 1,9 min.
  5. Configurer la liste de travail
    1. Commencez avec un échantillon vierge pour minimiser le transfert du mélange d’essai LC.
    2. Exécutez les échantillons dans un ordre aléatoire.
    3. Terminez par un échantillon vierge pour nettoyer la colonne en vue de futures expériences.

6. Pré-traitement des données dans automRm

REMARQUE : Les étapes suivantes traitent de la conversion de .d en .mzML dans msconvert, de la préparation de metabdb, du chargement des données et des modèles et de metabdb, ainsi que des stratégies générales pour l’examen manuel des pics.

  1. Convertissez les données brutes du format .d au format .mzML à l’aide de ProteoWizard20 avec les paramètres suivants : précision de l’encodage binaire : 32 bits, niveaux MS 1-2, index d’écriture sélectionné, utilisation de la compression zlib sélectionnée.
  2. Démarrez R.
  3. Installez automRm21 conformément à la documentation du paquet (requis une seule fois avant la première utilisation).
  4. Démarrez l’interface graphique d’automRm dans R : automRm ::automrm_gui()
  5. Traitez le lot de fichiers .d dans l’onglet Traiter > Traiter le lot.
    1. Sélectionnez .xlsx fichier contenant des informations sur les métabolites. Ce fichier doit correspondre à la méthode LC-QQQ-MS.
    2. Choisir. Modèle ML de prélèvement de pics de données de fichier RData.
    3. Choisir. Fichier RData contenant le modèle ML de création de rapports de pointe.
    4. Sélectionnez le dossier du projet contenant les fichiers .mzML.
    5. Démarrez le prétraitement des données en cliquant sur Traiter le lot.
  6. Une fois le prétraitement terminé, ouvrez peakoverview.pdf pour vérifier la détection correcte des pics chromatographiques. Vous pouvez également charger le fichier automRmdata_Review.RData à partir de l’onglet Review (Révision ) de l’interface graphique d’automRm pour modifier manuellement le filtrage et l’intégration des pics.
  7. Ouvrez le peakinfo.xlsx à partir du dossier du projet et vérifiez les données.
    1. Vérifier le signal étalon interne 13C dans l’onglet 13CArea : S’assurer qu’il n’y a pas de différences systématiques dans les valeurs d’intensité entre les groupes expérimentaux et entre les échantillons de cellules et les échantillons de débris. Si de telles différences existent, n’utilisez que les données des onglets NormArea ou NormHeight pour une analyse ultérieure ; sinon, utilisez les données des onglets RawArea ou RawHeight.
    2. Vérifiez l’intensité du signal des normes internes ATA et CLF dans l’onglet RawArea. S’assurer qu’il n’y a pas de différences systématiques dans l’intensité de l’un ou l’autre composé entre les groupes expérimentaux.
    3. Pour chaque métabolite, comparez l’intensité du signal des échantillons contenant des cellules à celle des échantillons de débris de la même suspension cellulaire. Utiliser un test statistique approprié pour identifier les métabolites dans lesquels les échantillons contenant des cellules ont des intensités plus élevées que les échantillons de débris. N’incluez que les métabolites qui réussissent ce test dans l’analyse ultérieure des données.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le tri FACS permet d’isoler des populations propres de différents types cellulaires à partir d’une même suspension cellulaire (Figure 2 et Figure 3). La spécificité de cette méthode repose sur la coloration des différents types de cellules avec des marqueurs de surface spécifiques (par exemple, les lymphocytes B et les lymphocytes T de la rate) ou des combinaisons spécifiques de marqueurs de surface (par exemple les CSH et les MPP). La coloration des marqueurs intracellulaires nécessite généralement une perméabilisation de la membrane cellulaire. Cela peut provoquer une fuite de métabolites et, par conséquent, ce type de coloration ne convient pas à ce protocole.

La LC assure la séparation des métabolites avant leur détection par SEP (Figure 4). Les métabolites éluent à partir de la colonne HILIC approximativement triés par polarité, avec moins de composés polaires éluant tôt et plus de métabolites polaires éluant plus tard. L’intensité du signal est déterminée par la quantité d’un métabolite cible dans l’échantillon et un facteur de réponse spécifique au métabolite. Par conséquent, les intensités des signaux ne peuvent pas être comparées de manière significative entre les métabolites, mais seulement pour un métabolite dans les échantillons. Les 3 pics mis en évidence dans la figure 4 représentent 1 : la niacinamide est détectée à la fois dans les débris et les extraits cellulaires, bien qu’à des niveaux différents, 2 : l’acétyl-carnitine qui est presque exclusivement détectée dans les extraits cellulaires, et 3 : l’acide aminotéréphatalique standard interne qui est détecté au même niveau dans les échantillons de débris et les extraits cellulaires.

Les différences métaboliques entre les types de cellules d’un même tissu sont préservées à l’aide du protocole combiné FACS-LC-MS (Figure 5). Pour les CSH et les MPP, les cellules de 6 souris ont été nécessaires pour générer 6 échantillons, ce qui a conduit à une plus grande variabilité au sein de chaque groupe par rapport aux cellules B et aux cellules T, qui ont été triées à partir de la même rate murine. Les échantillons de débris représentant des échantillons témoins à blanc sont clairement séparés des échantillons contenant des extraits cellulaires. Dans les échantillons de débris, une séparation claire des deux expériences est visible, mettant en évidence la différence d’environnement métabolique que les cellules subissent avant le tri. Lorsqu’elles sont représentées dans une carte thermique groupée (Figure 6), des informations supplémentaires deviennent visibles, telles que les niveaux relatifs de métabolites dans les échantillons.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble des étapes clés du protocole présenté. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Schoenberger et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Isolement de populations pures de lymphocytes B et de lymphocytes T de la rate. Les événements de cellules et de débris ont été sélectionnés en fonction des signaux de diffusion vers l’avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC). Les lymphocytes B et les lymphocytes T ont été sélectionnés en fonction des signaux de coloration spécifiques au type de cellule. Cette figure a été adaptée avec la permission de Schoenberger et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Isolement de la CSH et de la MPP de la moelle osseuse. Les événements de cellules et de débris ont été sélectionnés en fonction des signaux de diffusion vers l’avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC). Les populations HSC et MPP ont été sélectionnées en fonction de plusieurs stades de signaux de coloration spécifiques au type de cellule. Cette figure a été adaptée avec la permission de Schoenberger et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemples de chromatogrammes. Échantillons avec (A) 5000 HSC et (B) 5000 débris du même type. Notez que les axes partagent la même échelle dans les deux panneaux. Les métabolites mis en évidence sont 1 : nicotinamide, 2 : acétyl-carnitine, 3 : acide aminotéréphtalique (ATA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Analyse en composantes principales (ACP) des profils métaboliques de différents types cellulaires et d’échantillons de fond de débris provenant des mêmes expériences. Une séparation importante est observée entre les différents organes et des échantillons de fond de débris de n’importe quel organe. De plus, les types de cellules sont clairement séparés à l’intérieur des cellules de chaque organe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Carte thermique représentant les métabolites mesurés dans différents types de cellules et correspondant aux échantillons témoins de fond (débris). Les valeurs manquantes ont été imputées avec la demi-valeur minimale du même métabolite dans tous les échantillons. Pour le traçage, les données ont été normalisées au maximum séparément dans chaque ligne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Le tableau répertorie les paramètres spécifiques au composé pour les métabolites sélectionnés, y compris le temps de rétention (RT), la polarité (Pol), le précurseur m/z (Q1), le fragment m/z (Q3) et l’énergie de collision (CE). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les étapes les plus critiques pour une mise en œuvre réussie de la métabolomique ciblée à l’aide de ce protocole sont 1) une stratégie robuste de coloration et de déclenchement qui permettra d’obtenir des populations cellulaires propres 2) une manipulation précise des volumes liquides, 3) un calendrier reproductible de toutes les étapes expérimentales, en particulier toutes les étapes précédant l’extraction des métabolites. Idéalement, tous les échantillons appartenant à une expérience devraient être traités et mesurés en un seul lot afin de minimiser les effets de lot22. Pour les expériences de plus grande envergure, nous suggérons de collecter des extraits cellulaires à -80 °C, puis de mesurer tous les extraits en un seul lot.

Lorsque l’on travaille avec des échantillons à faible intrant, il faut mettre l’accent sur la manipulation propre de tous les matériaux utilisés au cours des expériences23. Les contaminations courantes sont les tampons résiduels, les détergents et les produits de soins de la peau. La mesure la plus importante pour minimiser la contamination est l’utilisation de gants appropriés tout au long de l’expérience.

Pour minimiser les altérations potentielles de la composition des métabolites dues à l’exposition des cellules à des conditions non physiologiques, il est crucial de préparer les échantillons sur de la glace et avec des réactifs froids (4 °C). De plus, le fait d’être le plus rapide possible avant l’étape FACS augmentera la qualité de la mesure2. Les temps indiqués pour la coloration des anticorps sont aussi courts que raisonnables pour une bonne efficacité de coloration. Une étape supplémentaire pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps aux récepteurs Fc à l’aide d’anticorps Fc-block pourrait être ajoutée avant la procédure de coloration FACS24,25. Cela permet d’éviter la contamination des populations de cellules cibles et est particulièrement conseillé lorsque l’on travaille avec des suspensions cellulaires qui comprennent de nombreux types de cellules à récepteur Fc élevé (comme les monocytes ou les macrophages) ou des cellules qui ont été cultivées sans sérum. Cependant, cela augmentera le temps de traitement global de 10 à 15 minutes et peut donc ajouter une variabilité non physiologique supplémentaire aux résultats.

Grâce à l’utilisation de méthodes MRM dynamiques sur les spectromètres de masse modernes, tous les métabolites répertoriés dans des paramètres spécifiques au composé peuvent être enregistrés avec une seule injection. La limitation du nombre de métabolites cibles permet la mise en œuvre du protocole décrit sur les spectromètres de masse plus anciens et accélère le prétraitement et l’analyse des données.

Un certain niveau de signal de fond dans les données LC-MS est inévitable. Par conséquent, il faut faire très attention à identifier les métabolites qui peuvent être détectés au-dessus du bruit de fond. Le tri des événements qui sont trop petits pour représenter des cellules intactes (débris) génère des échantillons à blanc pertinents qui représentent les intensités du signal de fond dépendantes de la matrice. De plus, les normes internes permettent d’identifier les échantillons problématiques qui devraient être exclus d’une analyse ultérieure des données26. Les deux mesures d’assurance de la qualité fonctionnent mieux si un nombre suffisant de répétitions est disponible. Nous vous recommandons d’utiliser au moins six répétitions par groupe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier l’animalerie de l’Institut Max Planck d’immunobiologie et d’épigénétique pour avoir fourni les animaux utilisés dans cette étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).

Tags

Immunologie et infection numéro 204
Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S.,… More

Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter