Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.
Abstract
Die zelluläre Funktion hängt entscheidend vom Stoffwechsel ab, und die Funktion der zugrunde liegenden Stoffwechselnetzwerke kann durch die Messung von niedermolekularen Zwischenprodukten untersucht werden. Um genaue und zuverlässige Messungen des Zellstoffwechsels zu erhalten, insbesondere bei seltenen Zelltypen wie hämatopoetischen Stammzellen, war es jedoch traditionell erforderlich, Zellen von mehreren Tieren zu poolen. Ein Protokoll ermöglicht es Forschern nun, Metaboliten in seltenen Zelltypen mit nur einer Maus pro Probe zu messen und gleichzeitig mehrere Replikate für häufigere Zelltypen zu generieren. Dadurch reduziert sich die Anzahl der Tiere, die für ein bestimmtes Projekt benötigt werden. Das hier vorgestellte Protokoll weist mehrere wesentliche Unterschiede zu herkömmlichen Metabolomik-Protokollen auf, wie z. B. die Verwendung von 5 g/L NaCl als Mantelflüssigkeit, die direkte Sortierung in Acetonitril und die gezielte Quantifizierung unter strenger Verwendung interner Standards, die genauere und umfassendere Messungen des Zellstoffwechsels ermöglichen. Trotz des Zeitaufwands für die Isolierung einzelner Zellen, die Fluoreszenzfärbung und die Sortierung kann das Protokoll die Unterschiede zwischen Zelltypen und medikamentösen Behandlungen weitgehend erhalten.
Introduction
Der Stoffwechsel ist ein essentieller biologischer Prozess, der in allen lebenden Zellen abläuft. Stoffwechselprozesse umfassen ein riesiges Netzwerk biochemischer Reaktionen, die eng reguliert und miteinander verbunden sind und es den Zellen ermöglichen, Energie zu produzieren und essentielle Biomoleküle zu synthetisieren1. Um die Funktion von Stoffwechselnetzwerken zu verstehen, messen Forscher den Gehalt an niedermolekularen Zwischenprodukten in Zellen. Diese Zwischenprodukte dienen als wichtige Indikatoren für die Stoffwechselaktivität und können wichtige Erkenntnisse über die Zellfunktion liefern.
Die Massenspektrometrie (MS) ist die beliebteste Wahl für den spezifischen Nachweis von Metaboliten in komplexen Proben 1,2. Die Kernspinresonanz (NMR) hat Vorteile bei der absoluten Quantifizierung von Verbindungen und der Strukturaufklärung, aber die MS kann oft mehr Komponenten in komplexen Gemischen wie Bioflüssigkeiten oder Zellextrakten auflösen. In den meisten Fällen wird MS mit einer vorherigen Trennung der Verbindung durch Kapillarelektrophorese (CE), Gaschromatographie (GC) oder Flüssigkeitschromatographie (LC) kombiniert3. Die Wahl der Trennplattform hängt hauptsächlich von der Bandbreite der Zielmetaboliten und der Art der Probe sowie in einer realen Umgebung von der Verfügbarkeit von Maschinen und Fachwissen ab. Alle drei Trennplattformen haben ein breites und sich überschneidendes Spektrum geeigneter Metaboliten, aber unterschiedliche Einschränkungen. Kurz gesagt, CE kann nur geladene Moleküle trennen und erfordert viel Fachwissen, um eine robuste Analyse einer großen Anzahl von Proben durchzuführen4. GC ist auf Moleküle beschränkt, die klein und apolar genug sind, um zu verdampfen, bevor sie sich zersetzen3. Unter Berücksichtigung aller kommerziell erhältlichen LC-Säulen können zwei beliebige Metaboliten durch diese Technologie getrennt werden5. Viele LC-Methoden weisen jedoch ein geringeres Auflösungsvermögen auf als CE- oder GC-Methoden ähnlicher Länge.
Die typische Menge an Ausgangsmaterial für Metabolomics-Messungen liegt in der Regel im Bereich von 5 x 105 bis 5 x 107 Zellen pro Probe, 5-50 mg Nassgewebe oder 5-50 μl Körperflüssigkeit6. Bei der Arbeit mit Primärzellen seltener Zelltypen, wie z.B. hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) oder zirkulierenden Tumorzellen, kann es jedoch schwierig sein, solche Mengen an Ausgangsmaterial zu erhalten. Diese Zellen sind oft in sehr geringer Anzahl vorhanden und können nicht kultiviert werden, ohne kritische zelluläre Eigenschaften zu beeinträchtigen.
HSCs und multipotente Vorläuferzellen (MPPs) sind die am wenigsten differenzierten Zellen des hämatopoetischen Systems und produzieren während des gesamten Lebens eines Organismus kontinuierlich neue Blutzellen. Die Regulation der Hämatopoese ist bei Erkrankungen wie Leukämie und Anämie von klinischer Relevanz. Trotz ihrer Bedeutung gehören HSCs und MPPs zu den seltensten Zellen innerhalb des hämatopoetischen Systems. Aus einer einzigen Maus können typischerweise etwa 5000 HSCs isoliert werden 7,8,9. Da herkömmliche Metabolomics-Methoden mehr Eingangsmaterial benötigen, war es oft notwendig, Zellen von mehreren Mäusen zu poolen, um seltene Zelltypen zu analysieren10,11.
Ziel war es, ein Protokoll zu entwickeln, das die Messung von Metaboliten in nur 5000 Zellen pro Probe ermöglicht, um die Generierung von Metabolomics-Daten aus den HSCs einer einzelnen Maus zu ermöglichen12. Gleichzeitig ermöglicht diese Methode die Generierung mehrerer Replikate aus einer einzigen Maus für häufigere Zelltypen wie Lymphozyten. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der Tiere, die für ein bestimmtes Projekt benötigt werden, und trägt so zur "3R" (Reduction, Replacement, Refinement) von Tierversuchen bei.
Metaboliten in Zellen können sehr hohe Umsatzraten aufweisen, oft in der Größenordnung von Sekunden13. Die Vorbereitung der Proben für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kann jedoch Stunden dauern, und die FACS-Sortierung selbst kann Minuten bis Stunden dauern, was zu möglichen Veränderungen des Metaboloms aufgrund nicht-physiologischer Bedingungen führt. Einige der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien (z. B. Ammoniumchlorid-Kalium-[ACK]-Lysepuffer) können ähnliche Wirkungen haben. Diese Bedingungen können zellulären Stress verursachen und die Konzentrationen und Verhältnisse von Metaboliten in den Zellen beeinflussen, was zu ungenauen oder verzerrten Messungen des Zellstoffwechsels führt 14,15,16. Die metabolischen Veränderungen durch die Probenvorbereitung werden manchmal auch als Sortierartefakte bezeichnet. Lange Verdauungsprotokolle und scharfe Reagenzien, die zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus hartem oder zähem Gewebe erforderlich sein können, können dieses Problem verschlimmern. Welche Veränderungen auftreten können, hängt wahrscheinlich vom Zelltyp und den Verarbeitungsbedingungen ab. Die genaue Art der Veränderungen ist noch unbekannt, da der Stoffwechselzustand der ungestörten Zellen im lebenden Gewebe nicht gemessen werden kann.
Das hier vorgestellte Protokoll weist mehrere wesentliche Unterschiede im Vergleich zu herkömmlichen Methoden auf, nämlich die Verwendung von 5 g/L NaCl als Mantelflüssigkeit, die Sortierung direkt in den Extraktionspuffer, die Injektion großer Probenvolumina bei der hydrophilen Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HILIC-MS) und die Verwendung einer gezielten Quantifizierung, die rigorose Verwendung interner Standards und Hintergrundkontrollen (Abbildung 1). Dieses Protokoll hat das Potenzial, Unterschiede zwischen Zelltypen und zwischen medikamentöser Behandlung und Vehikelkontrolle weitgehend zu erhalten12. Selbst für kultivierte Zellen ist es im Vergleich zu alternativen Ansätzen, wie der etablierteren Zentrifugation und der manuellen Entfernung des Überstandes, günstig. Da es jedoch immer noch zu Sortierartefakten kommen kann, müssen die Daten mit Vorsicht interpretiert werden. Trotz dieser Einschränkung stellt das Protokoll eine signifikante Verbesserung auf dem Gebiet der metabolischen Profilerstellung dar und ermöglicht genauere und umfassendere Messungen des Zellstoffwechsels in seltenen Primärzellen12.
Die Fähigkeit, breite Stoffwechselprofile in seltenen Primärzellen robust zu messen, öffnet die Tür zu neuen Experimenten in der biomedizinischen Forschung mit diesen Zellen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die metabolisch vermittelte Regulation in HSCs die Selbsterneuerungsfähigkeit der Dormanz beeinflusst, mit Auswirkungen auf Anämie und Leukämie11,17. In zirkulierenden Tumorzellen von Patienten wurden Unterschiede in der Expression von Stoffwechselgenen zwischen Tumor und benachbarten Zellen gezeigt18,19. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern nun, diese Unterschiede systematisch auf metabolischer Ebene zu untersuchen, die im Allgemeinen als näher am zellulären Phänotyp als an der Genexpression angesehen wird.
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Protocol
Die Zucht und Haltung aller für dieses Protokoll verwendeten Mäuse erfolgte in einer konventionellen Tiereinrichtung am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik (MPI-IE) gemäß den Vorschriften des Regierungspräsidiums Freiburg. Die Mäuse wurden mit CO2 und Gebärmutterhalsverrenkungen von FELASA B-geschultem Personal nach Richtlinien und Vorschriften eingeschläfert, die vom Tierschutzkomitee des MPI-IE und den lokalen Behörden genehmigt wurden. Es wurden keine Tierversuche durchgeführt und die Mäuse waren gesundheitlich unbedenklich.
HINWEIS: Hochempfindliche Analysemethoden wie die in diesem Protokoll verwendete LC-MS-Methode haben das Potenzial, selbst sehr geringe Verunreinigungen in der Probe nachzuweisen. Daher ist es von größter Bedeutung, solche Kontaminationen zu minimieren. Die wichtigste Maßnahme ist das Tragen sauberer Handschuhe, wenn Sie etwas berühren, das mit den Proben in Berührung kommt. Dazu gehören zum Beispiel die Vorbereitung von Puffern und Mantelflüssigkeit, die Beschriftung von Probenröhrchen und die Reinigung von Laborgeräten. Darüber hinaus sollten nach Möglichkeit Einweg-Laborgeräte verwendet werden. Glaswaren sollten vor dem Gebrauch mit LC-MS-Lösungsmitteln gespült werden. Eine saubere Arbeitsumgebung trägt außerdem dazu bei, Kontaminationen zu reduzieren.
1. Allgemeine Vorbereitungen
- Interne Standard-Stammlösung vorbereiten: 6 mg/ml Chlorphenylalanin (CLF) und 6 mg/ml Aminoterephtalsäure (ATA) in 30 % v/v 2-Propanol in Reinstwasser herstellen.
- FACS-Resuspensionspuffer vorbereiten: 0,9 g NaCl, 99,5 ml Reinstwasser und 0,5 ml interne Standardstammlösung hinzufügen. Auf 4 °C vorkühlen.
- Scheidenflüssigkeit vorbereiten: In einem Mantelflüssigkeitstank 30 g NaCl in 6 l deionisiertem Wasser auflösen und an einen Zellsortierer anschließen.
HINWEIS: Die Konzentration von NaCl in der Mantelflüssigkeit wurde optimiert, um eine Umlenkung der Tröpfchen im Sortierer zu ermöglichen, die so robust ist wie bei der Verwendung von PBS als Mantelflüssigkeit, und gleichzeitig negative Auswirkungen auf den Metabolitennachweis durch LC-MS12 zu minimieren. Niedrigere Konzentrationen von NaCl sind vorteilhaft für den Nachweis von Metaboliten, beeinträchtigen aber die robuste Sortierung von Zellen.
2. Isolierung von B- und T-Zellen aus der Milz
- 90 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Maus im Kühlschrank oder auf Eis auf 4 °C vorkühlen. Eine Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
- Isolierung der Milz
HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, während der Zellisolierung und der folgenden Färbeschritte schnell, auf Eis und mit kalten (4 °C) Puffern zu arbeiten. Andernfalls kann sich das Stoffwechselprofil der Zellen erheblich verändern.- Bereiten Sie 1,5 ml PBS in einem 2-ml-Reaktionsröhrchen auf Eis vor.
- Euthanasie einer C57BL6/J-Maus gemäß den Richtlinien und Methoden, die von den örtlichen Behörden genehmigt wurden.
- Sterilisieren Sie das Fell mit 70% Ethanol.
- Öffnen Sie den Bauch mit einer Schere und entfernen Sie die Milz mit einer feinen Pinzette, ohne das Organ zu reißen. Die Milz sofort in kaltes PBS (4 °C) legen.
- Erzeugung einer einzelligen Suspension
- Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und befeuchten Sie es mit PBS. Die Milz wird mit der Daumenstütze eines Spritzenkolbens und 30 ml kaltem PBS (4 °C) durch das Netz geführt
- Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
- Das Pellet wird in 1 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert und 2 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT; 20 °C) inkubiert.
- Fügen Sie 50 ml kaltes PBS (4 °C) hinzu. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- FACS-Färbung
- Bereiten Sie den Antikörpercocktail in 500 μl kaltem PBS (4 °C) pro Maus vor: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
- Resuspendieren Sie das Zellpellet im Antikörpercocktail. In ein 5-ml-FACS-Röhrchen überführen. 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 3 ml kaltes PBS (4 °C) hinzu. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml kaltem FACS-Resuspensionspuffer (4 °C). Filtern Sie die Zellen durch ein FACS-Röhrchen mit Filterkappe. Die Zellen sind bereit für die durchflusszytometrische Sortierung.
3. Isolierung von HSCs und MPPs aus dem Knochenmark
- Sezieren und isolieren Sie das Knochenmark.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, schnell zu arbeiten und isolierte Knochen und Zellen während des gesamten Eingriffs kalt zu halten (4 °C), um genaue Ergebnisse zu erzielen. Um Hintergrundsignale zu minimieren, arbeiten und verwenden Sie außerdem einen Reinraum und Laborgeräte.- Euthanasie von Mäusen nach Richtlinien und Methoden, die von den örtlichen Behörden genehmigt wurden.
- Sprühen Sie 70% Ethanol auf den unteren Teil der Mäuse.
- Sezieren Sie die Beine und die Wirbelsäule mit einer Schere. Machen Sie einen Schnitt auf der Rückseite und verlängern Sie den Schnitt bis zum Bauch. Schäle die Haut von den Hintergliedmaßen.
- Reißen oder schneiden Sie die Hintergliedmaßen ab und stellen Sie sicher, dass die Beine das Schienbein, den Oberschenkelknochen und das Hüftgelenk enthalten.
- Nimm die Schere und schneide sie dicht an der Wirbelsäule ab, bis sie vollständig entfernt ist.
- Verteilen Sie die Beine und Stacheln auf 6-Well-Platten mit kaltem PBS (4 °C) und lassen Sie die Platten auf Eis.
- Reinigen Sie den Oberschenkelknochen, das Schienbein, das Hüftgelenk und die Wirbel mit einem Skalpell und einer Schere von Weichteilen.
- Zerkleinern Sie die gereinigten Knochen mit einem Mörser und Stößel in 5 ml kaltem PBS (4 °C).
- Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.8-3.1.9, bis die Knochen vollständig weiß erscheinen.
- Lyse von Erythrozyten:
- Die geerntete Zellsuspension wird bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml kaltem ACK-Puffer (4 °C). 5 Minuten auf Eis inkubieren.
- Kaltes PBS (4 °C) hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen (optional).
- Bei 400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Erschöpfung der Abstammungslinie:
HINWEIS: Zur Anreicherung für liniennegative (Lin-) Zellen wurde ein negatives Selektionskit für CD4-Zellen verwendet.- Bereiten Sie die Magnetperlen vor:
- Geben Sie 500 μl Kügelchen in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magneten und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie die Perlen mit 1 ml kaltem PBS (4 °C) und entsorgen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 500 μl kaltes PBS (4 °C) hinzu und halten Sie die Kügelchen kalt (4 °C).
- Inkubieren Sie die Zellen mit 500 μl Abstammungscocktail (50 μl Antikörper aus dem Kit + 450 μl PBS) für 25 Minuten (Schütteln, 4 °C) im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS (4 °C).
- Das Röhrchen wird bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1000 μl kaltem PBS (4 °C) und überführen Sie die Zellsuspension in die Kügelchenlösung.
- 15 min auf einem rotierenden Rad bei 4 °C inkubieren.
- Legen Sie die Röhrchen auf einen Magneten und warten Sie, bis die Lösung geklärt ist. Den Überstand in ein frisches FACS-Röhrchen überführen.
- Waschen Sie die Perlen mit 500 μl PBS.
- Legen Sie die Röhrchen auf einen Magneten und warten Sie, bis die Lösung geklärt ist.
- Den Überstand in das frische FACS-Röhrchen überführen.
- Bei 400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Bereiten Sie die Magnetperlen vor:
- Färbung für FACS
- Bereiten Sie 300 μl Antikörpermischung pro Maus in kaltem PBS (4 °C) vor.
- Antikörpermischung für Stamm-/Vorläuferzellen: HSCs: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
- Inkubieren Sie die Zellen für 40 min im Dunkeln bei 4 °C.
- Mit 1 ml kaltem PBS (4 °C) waschen. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml FACS-Resuspensionspuffer und filtern Sie die Zellen durch ein FACS-Röhrchen mit Filterkappe.
4. FACS-Sortierung
- Richten Sie die Zellsortierung ein.
- 70 μm Düsenspitze einsetzen. Aktivieren Sie 405-nm-, 488-nm-, 561-nm- und 633-nm-Laser.
- Stellen Sie den Sortiermodus auf 4-Wege-Reinheit ein: Ergiebigkeitsmaske 0, Reinheitsmaske 32, Phasenmaske 0
- Stellen Sie die Abfallfrequenz auf 90.400 Hz ein und stellen Sie die Amplitude und die Abfallverzögerung gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Stellen Sie die Plattenspannung auf 5000 V ein.
- Definieren Sie Sortiertore gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Wählen Sie für alle Zelltypen zunächst einzelne Zellen basierend auf der Vorwärtsstreuung und dem seitwärts gerichteten Streusignal aus, gefolgt von einer Auswahl auf der Grundlage der zelltypspezifischen Färbung.
- Wählen Sie für B-Zellen die AF647-positive, PE-negative Population aus.
- Wählen Sie für T-Zellen die PE-positive, AF647-negative Population aus.
- Wählen Sie für HSCs die PE-Cy7-niedrige, PE-positive, APC-Cy7-positive, BV605-positive, BV421-negative Population aus.
- Wählen Sie für MPPs die PE-Cy7-niedrige, PE-positive, APC-Cy7-positive, BV421-positive, BV605-negative Population aus.
- Wählen Sie für Trümmerproben Ereignisse aus, die zu klein sind, um intakte Zellen basierend auf dem Vorwärtsstreu- und Seitwärtsstreusignal darzustellen. Typische FACS-Diagramme, die diese Gating-Strategien zeigen, sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt.
- Passen Sie die Durchflussrate an, um weniger als 15.000 Ereignisse/s zu erhalten.
- Sammelteller vorbereiten
- Bereiten Sie die Hefeextrakt-Stammlösung vor: Resuspendieren Sie 1 Aliquot von 13C Hefeextrakt in 7,5 ml hochreinemH2Ound 2,5 ml Methanol.
- Extraktionspuffer vorbereiten: 10 μl 13C Hefeextrakt-Stammlösung zu 10 ml Acetonitril geben und mischen.
- Entnahmeplatte vorbereiten: Geben Sie 25 μl des Extraktionspuffers in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte, die zur Entnahme der Probe verwendet wird. Um die Verdunstung zu minimieren, decken Sie die Vertiefungen mit PCR-Deckeln (in Singuletts geschnittene Streifen) ab.
- Führen Sie die Zellsortierung durch.
- Öffnen Sie die Sammelschächte nach Bedarf, um sortierte Zellen zu sammeln, und schließen Sie sie so schnell wie möglich, um die Verdunstung zu minimieren.
- Wenn Proben nicht sofort gemessen werden können, lagern Sie sie mehrere Tage in verschlossenen Behältern bei -80 °C. Nach dem Auftauen werden die Proben 5 Minuten lang beschallt, um eine vollständige Resuspension der Metaboliten zu gewährleisten.
5. LC-QQQ-MS-Messung
- LC-Lösungsmittel vorbereiten
- Medronsäure-Stammlösung (100 mM) vorbereiten: 17,6 mg Medronsäure in 1 ml hochreinemH2Oauflösen.
- Puffer A vorbereiten: 1,92 g Ammoniumcarbonat in 1 l hochreinemH2Oauflösen und 50 μl Medronsäure-Stammlösung hinzufügen.
- Bereiten Sie Puffer B vor: Mischen Sie 50 ml Puffer mit 450 ml Acetonitril.
- LC-Testmischung vorbereiten: Mischen Sie je 1 ppm Leucin, Isoleucin, AMP, ADP und ATP in 80:20 Acetonitril: hochreinesH2O.
HINWEIS: Medronsäure kann bei -20 °C mehrere Monate gelagert werden. andere Puffer können 2 Tage lang bei RT aufbewahrt werden.
- Programm LC-QQQ-MS-Methode
- Optimieren Sie verbindungsspezifische MS-Einstellungen (z. B. Kollisionsenergie) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie für Geräte der Agilent Serie 6495 die Einstellungen in der Zusatztabelle 1.
- Optimieren Sie quellenspezifische MS-Einstellungen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für Geräte mit JetStream beheizter ESI-Quelle sind folgende Parameter zu verwenden: Gastemperatur: 240 °C, Gasdurchfluss: 15 L/min, Vernebler: 50 psi, Mantelgastemperatur: 400 °C, Mantelgasstrom: 11 L/min, Kapillarspannung: 2000 V, Düsenspannung: 300 V.
- Optimieren Sie die Einstellungen der Ionentransferoptik gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie für Agilent-Geräte mit iFunnel-Ionenoptik die folgenden Parameter: Hochdruck-HF-positiv: 110 V, Hochdruck-HF-negativ: 90 V, Niederdruck-HF-positiv: 80 V, Niederdruck-HF-negativ: 60 V.
- Programmieren Sie den LC-Gradienten: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30 % B, 150 μl/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95 % B, 200 μl/min, 23,5 min, 95 % B, 400 μl/min; Stoppzeit 28 Min. Säulentemperatur: 35 °C.
- LC-MS-Gerät einrichten.
- Schließen Sie die chromatographische Säule an das temperierte Säulenfach an.
- Schließen Sie die Puffer an und spülen Sie alle Leitungen.
- Führen Sie mindestens 4 Leerproben oder Poolproben durch, um die Säule auszugleichen.
- Führen Sie eine LC-Testmischung durch, um die chromatographische Leistung zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die folgenden Kriterien erfüllt sind. Ist dies nicht der Fall, reinigen Sie das Gerät oder beheben Sie Fehler, bevor Sie die Proben ausführen.
- Vergewissern Sie sich, dass der anfängliche Gegendruck <150 bar und der maximale Gegendruck <400 bar beträgt.
- Vergewissern Sie sich, dass die Retentionszeiten in einem Zeitfenster von ±1 Minute wie folgt liegen: Isoleucin 6,0 min, Leucin 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min und ATP 12,7 min.
- Stellen Sie sicher, dass das Tal zwischen Leucin und Isoleucin im Übergang +132->86 < 20 % der Gipfelhöhe beträgt.
- Stellen Sie sicher, dass die Differenz in der Retentionszeit von AMP zu ADP 1,5 bis 1,9 Minuten und die Differenz zwischen ADP und ATP 1,1 bis 1,9 Minuten beträgt.
- Arbeitsvorrat einrichten
- Beginnen Sie mit einer Leerprobe, um die Verschleppung aus der LC-Testmischung zu minimieren.
- Führen Sie die Stichproben in zufälliger Reihenfolge aus.
- Beenden Sie mit einer leeren Probe, um die Säule für zukünftige Experimente zu reinigen.
6. Datenvorverarbeitung in automRm
Hinweis: In den folgenden Schritten werden die Konvertierung von .d in .mzML in msconvert, die Vorbereitung von metabdb, das Laden von Daten und Modellen und metabdb sowie allgemeine Strategien für die manuelle Peaküberprüfung erläutert.
- Konvertieren Sie Rohdaten aus dem .d-Format in das .mzML-Format mit ProteoWizard20 mit den folgenden Einstellungen: binäre Codierungsgenauigkeit: 32-Bit, MS-Stufen 1-2, Schreibindex ausgewählt, zlib-Komprimierung verwenden ausgewählt.
- Starten Sie R.
- Installieren Sie automRm21 gemäß der Paketdokumentation (nur einmal vor der ersten Verwendung erforderlich).
- Starten Sie die automRm-GUI in R: automRm::automrm_gui()
- Verarbeiten Sie den Stapel von .d-Dateien im Reiter Verarbeiten > Stapel verarbeiten.
- Wählen Sie .xlsx Datei aus, die Metaboliteninformationen enthält. Diese Datei muss mit der LC-QQQ-MS-Methode übereinstimmen.
- Auswählen. RData-Datei mit dem ML-Modell für die Spitzenkommissionierung.
- Auswählen. RData-Datei, die das ML-Modell für die Spitzenberichterstattung enthält.
- Wählen Sie den Projektordner aus, der MZML-Dateien enthält.
- Starten Sie die Datenvorverarbeitung, indem Sie auf Batch verarbeiten klicken.
- Öffnen Sie nach Abschluss der Vorverarbeitung peakoverview.pdf , um die korrekte Detektion chromatographischer Peaks zu überprüfen. Optional können Sie die automRmdata_Review.RData über die Registerkarte "Überprüfen " der automRm-GUI laden, um die Peak-Filterung und die Peak-Integration manuell zu ändern.
- Öffnen Sie die peakinfo.xlsx aus dem Projektordner und überprüfen Sie die Daten.
- Internes Standardsignal 13C auf der Registerkarte 13CArea prüfen: Stellen Sie sicher, dass es keine systematischen Unterschiede in den Intensitätswerten zwischen den Versuchsgruppen und zwischen Zellproben und Trümmerproben gibt. Wenn solche Unterschiede vorhanden sind, verwenden Sie nur Daten aus den Registerkarten NormArea oder NormHeight für die nachfolgende Analyse. Andernfalls verwenden Sie Daten aus den Registerkarten RawArea oder RawHeight.
- Überprüfen Sie die Signalintensität der internen Standards ATA und CLF auf der Registerkarte RawArea. Stellen Sie sicher, dass es keine systematischen Unterschiede in der Intensität einer der beiden Verbindungen zwischen den Versuchsgruppen gibt.
- Vergleichen Sie für jeden Metaboliten die Signalintensität von Proben, die Zellen enthalten, mit den Trümmerproben derselben Zellsuspension. Verwenden Sie einen geeigneten statistischen Test, um Metaboliten zu identifizieren, bei denen Proben, die Zellen enthalten, eine höhere Intensität aufweisen als Trümmerproben. Nehmen Sie nur Metaboliten in die anschließende Datenanalyse auf, die diesen Test bestehen.
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Representative Results
Die FACS-Sortierung ermöglicht die Isolierung sauberer Populationen verschiedener Zelltypen aus derselben Zellsuspension (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Spezifität dieser Methode beruht auf der Färbung der verschiedenen Zelltypen mit spezifischen Oberflächenmarkern (z. B. B-Zellen und T-Zellen aus der Milz) oder spezifischen Kombinationen von Oberflächenmarkern (z. B. HSCs und MPPs). Die Färbung intrazellulärer Marker erfordert typischerweise eine Permeabilisierung der Zellmembran. Dies kann zu einem Austritt von Metaboliten führen, weshalb diese Art der Färbung nicht für die Verwendung in diesem Protokoll geeignet ist.
LC ermöglicht die Trennung von Metaboliten vor dem Nachweis durch MS (Abbildung 4). Metaboliten eluieren aus der HILIC-Säule annähernd nach Polarität sortiert, wobei weniger polare Verbindungen früh und mehr polare Metaboliten später eluieren. Die Signalintensität wird durch die Menge eines Zielmetaboliten in der Probe und einen metabolitspezifischen Antwortfaktor bestimmt. Folglich können Signalintensitäten nicht aussagekräftig zwischen Metaboliten verglichen werden, sondern nur für einen Metaboliten über Proben hinweg. Die 3 Peaks, die in Abbildung 4 hervorgehoben sind, stehen für 1: Niacinamid wird sowohl in Trümmern als auch in Zellextrakten nachgewiesen, wenn auch in unterschiedlichen Konzentrationen, 2: Acetyl-Carnitin, das fast ausschließlich in Zellextrakten nachgewiesen wird, und 3: die interne Standard-Aminoterephatalsäure, die in Trümmerproben und Zellextrakten in der gleichen Menge nachgewiesen wird.
Metabolische Unterschiede zwischen Zelltypen aus demselben Gewebe werden mit dem kombinierten FACS-LC-MS-Protokoll erhalten (Abbildung 5). Für HSCs und MPPs mussten Zellen von 6 Mäusen 6 Proben erzeugen, was zu einer größeren Variabilität innerhalb jeder Gruppe im Vergleich zu B-Zellen und T-Zellen führte, die aus derselben murinen Milz sortiert wurden. Rückstandsproben, die Prozess-Leerkontrollproben darstellen, werden klar von Proben getrennt, die Zellextrakte enthalten. Innerhalb der Trümmerproben ist eine klare Trennung der beiden Experimente sichtbar, was den Unterschied in der metabolischen Umgebung hervorhebt, die die Zellen vor der Sortierung erfahren. Bei der Darstellung in einer geclusterten Heatmap (Abbildung 6) werden zusätzliche Informationen sichtbar, wie z. B. die relativen Konzentrationen von Metaboliten in den Proben.
Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Schritte des vorgestellten Protokolls. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Schoenberger et al.12 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Isolierung von reinen Populationen von B-Zellen und T-Zellen aus der Milz. Zell- und Trümmerereignisse wurden auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) ausgewählt. B-Zellen und T-Zellen wurden anhand von zelltypspezifischen Färbesignalen ausgewählt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Schoenberger et al.12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Isolierung von HSC und MPP aus dem Knochenmark. Zell- und Trümmerereignisse wurden auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) ausgewählt. HSC- und MPP-Populationen wurden auf der Grundlage mehrerer Stadien zelltypspezifischer Färbesignale ausgewählt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Schoenberger et al.12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispielchromatogramme. Proben mit (A) 5000 HSCs und (B) 5000 Trümmerereignissen der gleichen Sorte. Beachten Sie, dass die Achsen in beiden Bereichen den gleichen Maßstab haben. Hervorgehobene Metaboliten sind 1: Nicotinamid, 2: Acetyl-Carnitin, 3: Aminoterephtalsäure (ATA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Hauptkomponentenanalyse (PCA) von Stoffwechselprofilen verschiedener Zelltypen und Trümmerhintergrundproben aus denselben Experimenten. Es wird eine große Trennung zwischen den verschiedenen Organen und Trümmern von jedem Organ beobachtet. Darüber hinaus sind die Zelltypen innerhalb der Zellen jedes Organs klar voneinander getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Heatmap, die Metaboliten darstellt, die über verschiedene Zelltypen hinweg gemessen wurden, und übereinstimmende Hintergrundkontrollproben (Trümmer). Fehlende Werte wurden mit dem halben Minimalwert desselben Metaboliten über alle Proben hinweg imputiert. Für die Darstellung wurden die Daten in jeder Zeile separat auf das Maximum normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Die Tabelle listet die verbindungsspezifischen Einstellungen für die ausgewählten Metaboliten auf, einschließlich Retentionszeit (RT), Polarität (Pol), Vorläufer m/z (Q1), Fragment m/z (Q3) und Kollisionsenergie (CE). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Implementierung einer gezielten Metabolomik mit diesem Protokoll sind 1) eine robuste Färbe- und Gating-Strategie, die saubere Zellpopulationen liefert, 2) eine präzise Handhabung von Flüssigkeitsvolumina, 3) ein reproduzierbares Timing aller experimentellen Schritte, insbesondere aller Schritte vor der Metabolitenextraktion. Im Idealfall sollten alle Proben, die zu einem Experiment gehören, in einem Batch verarbeitet und gemessen werden, um Batch-Effekte zu minimieren22. Für größere Experimente empfehlen wir, Zellextrakte bei -80 °C zu sammeln und dann alle Extrakte in einer Charge zu messen.
Bei der Arbeit mit Low-Input-Proben muss der saubere Umgang mit allen Materialien, die im Rahmen der Versuche verwendet werden, hervorgehoben werden23. Häufige Verunreinigungen sind Restpuffer, Reinigungsmittel und Hautpflegeprodukte. Die wichtigste Maßnahme zur Minimierung der Kontamination ist die Verwendung geeigneter Handschuhe während des gesamten Experiments.
Um mögliche Veränderungen in der Zusammensetzung der Metaboliten aufgrund der Exposition von Zellen gegenüber unphysiologischen Bedingungen zu minimieren, ist es wichtig, die Proben auf Eis und mit kalten Reagenzien (4 °C) vorzubereiten. Wenn Sie so schnell wie möglich vor dem FACS-Schritt sind, erhöht sich die Qualität der Messung2. Die angegebenen Zeiten für die Antikörperfärbung sind so kurz wie möglich, um eine gute Färbeeffizienz zu erzielen. Ein zusätzlicher Schritt zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren unter Verwendung von Fc-Block-Antikörpern könnte vor dem FACS-Färbeverfahren hinzugefügt werden24,25. Dies verhindert eine Kontamination der Zielzellpopulationen und ist besonders ratsam, wenn mit Zellsuspensionen gearbeitet wird, die viele Zelltypen mit hohem Fc-Rezeptor-Anteil (wie Monozyten oder Makrophagen) oder Zellen enthalten, die ohne Serum kultiviert wurden. Es erhöht jedoch die Gesamtbehandlungszeit um 10-15 Minuten und kann daher zu einer zusätzlichen nicht-physiologischen Variabilität der Ergebnisse führen.
Durch den Einsatz dynamischer MRM-Methoden auf modernen Massenspektrometern können alle Metaboliten, die in verbindungsspezifischen Einstellungen aufgeführt sind, mit einer einzigen Injektion erfasst werden. Die Begrenzung der Anzahl der Zielmetaboliten ermöglicht die Implementierung des beschriebenen Protokolls auf älteren Massenspektrometern und beschleunigt die Datenvorverarbeitung und Datenanalyse.
Ein gewisses Maß an Hintergrundsignal in den LC-MS-Daten ist unvermeidlich. Daher muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, diejenigen Metaboliten zu identifizieren, die über dem Hintergrund nachgewiesen werden können. Die Sortierung von Ereignissen, die zu klein sind, um intakte Zellen (Trümmer) darzustellen, erzeugt relevante Prozessleerproben, die matrixabhängige Hintergrundsignalintensitäten darstellen. Darüber hinaus ermöglichen interne Standards die Identifizierung problematischer Proben, die von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen werden sollten26. Beide Qualitätssicherungsmaßnahmen funktionieren am besten, wenn eine ausreichend große Anzahl von Replikaten zur Verfügung steht. Es wird empfohlen, mindestens sechs Replikate pro Gruppe zu verwenden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Tiereinrichtung des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie und Epigenetik für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Tiere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
