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Immunology and Infection

दुर्लभ प्राथमिक कोशिकाओं पर लक्षित चयापचय

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65690
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम दुर्लभ सेल प्रकारों में चयापचयों को सटीक और मज़बूती से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सेल छँटाई और प्रासंगिक रिक्त नमूनों की पीढ़ी के लिए एक संशोधित म्यान तरल पदार्थ सहित तकनीकी सुधार, नमूना प्रति केवल 5000 कोशिकाओं के इनपुट के साथ चयापचयों की एक व्यापक मात्रा का ठहराव सक्षम.

Abstract

सेलुलर फ़ंक्शन गंभीर रूप से चयापचय पर निर्भर करता है, और अंतर्निहित चयापचय नेटवर्क के कार्य का अध्ययन छोटे अणु मध्यवर्ती को मापकर किया जा सकता है। हालांकि, सेलुलर चयापचय के सटीक और विश्वसनीय माप प्राप्त करना, विशेष रूप से हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं जैसे दुर्लभ सेल प्रकारों में, पारंपरिक रूप से कई जानवरों से पूलिंग कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। एक प्रोटोकॉल अब शोधकर्ताओं को प्रति नमूना केवल एक माउस का उपयोग करके दुर्लभ सेल प्रकारों में चयापचयों को मापने में सक्षम बनाता है, जबकि अधिक प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के लिए कई प्रतिकृतियां उत्पन्न करता है। यह किसी दिए गए प्रोजेक्ट के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस तरह के एक म्यान तरल पदार्थ के रूप में 5 जी / एल NaCl का उपयोग करने, acetonitrile में सीधे छँटाई, और आंतरिक मानकों के कठोर उपयोग के साथ लक्षित मात्रा का ठहराव का उपयोग के रूप में पारंपरिक metabolomics प्रोटोकॉल पर कई महत्वपूर्ण मतभेद शामिल हैं, सेलुलर चयापचय के अधिक सटीक और व्यापक माप के लिए अनुमति देता है. एकल कोशिकाओं, फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना और छँटाई के अलगाव के लिए आवश्यक समय के बावजूद, प्रोटोकॉल काफी हद तक सेल प्रकार और दवा उपचार के बीच अंतर को संरक्षित कर सकता है।

Introduction

चयापचय एक आवश्यक जैविक प्रक्रिया है जो सभी जीवित कोशिकाओं में होती है। मेटाबोलिक प्रक्रियाओं में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का एक विशाल नेटवर्क शामिल होता है जो कसकर विनियमित और परस्पर जुड़े होते हैं, जिससे कोशिकाओं को ऊर्जा का उत्पादन करने और आवश्यक बायोमोलेक्यूल्सको संश्लेषित करने की अनुमति मिलती है। चयापचय नेटवर्क के कार्य को समझने के लिए, शोधकर्ता कोशिकाओं के भीतर छोटे अणु मध्यवर्ती के स्तर को मापते हैं। ये मध्यवर्ती चयापचय गतिविधि के महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में कार्य करते हैं और सेलुलर फ़ंक्शन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) जटिल नमूनों 1,2 में चयापचयों की विशिष्ट पहचान के लिए सबसे लोकप्रिय विकल्प है. परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) में यौगिकों और संरचना स्पष्टीकरण के पूर्ण परिमाणीकरण में फायदे हैं, लेकिन एमएस अक्सर जटिल मिश्रण जैसे बायोफ्लुइड या सेल अर्क में अधिक घटकों को हल कर सकता है। अधिक बार नहीं, एमएस को केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई), गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी), या तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी)3द्वारा यौगिक के पूर्व पृथक्करण के साथ जोड़ा जाता है। पृथक्करण मंच की पसंद ज्यादातर लक्ष्य चयापचयों की सीमा और नमूने के प्रकार से और वास्तविक दुनिया की सेटिंग में, मशीनों और विशेषज्ञता की उपलब्धता से प्रेरित होती है। सभी तीन पृथक्करण प्लेटफार्मों में उपयुक्त चयापचयों की एक व्यापक और अतिव्यापी सीमा है लेकिन विभिन्न सीमाएं हैं। संक्षेप में, सीई केवल चार्ज अणुओं को अलग कर सकता है और बड़ी संख्यामें नमूनों के मजबूत विश्लेषण को लागू करने के लिए बहुत सारी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। जीसी उन अणुओं तक सीमित है जो छोटे और एपोलर होते हैं जो3 को विघटित करने से पहले वाष्पित हो जाते हैं। सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलसी कॉलम को ध्यान में रखते हुए, किसी भी दो चयापचयों को इस तकनीक द्वारा अलग किया जा सकताहै 5. हालांकि, कई एलसी विधियां समान लंबाई के सीई या जीसी विधियों की तुलना में कम संकल्प शक्ति प्रदर्शित करती हैं।

मेटाबोलॉमिक्स माप के लिए प्रारंभिक सामग्री की विशिष्ट मात्रा आमतौर पर 5 x 105 से 5 x 107 कोशिकाओं प्रति नमूना, 5-50 मिलीग्राम गीले ऊतक, या शरीर के तरल पदार्थके 5-50 माइक्रोन की सीमा में होती है। हालांकि, दुर्लभ सेल प्रकारों की प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय ऐसी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जैसे कि हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) या ट्यूमर कोशिकाओं को प्रसारित करना। ये कोशिकाएं अक्सर बहुत कम संख्या में मौजूद होती हैं और महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताओं से समझौता किए बिना खेती नहीं की जा सकती हैं।

एचएससी और मल्टीपोटेंट पूर्वज कोशिकाएं (एमपीपी) हेमटोपोइएटिक प्रणाली की कम से कम विभेदित कोशिकाएं हैं और एक जीव के पूरे जीवन में लगातार नई रक्त कोशिकाओं का उत्पादन करती हैं। हेमटोपोइजिस का विनियमन ल्यूकेमिया और एनीमिया जैसी स्थितियों में नैदानिक प्रासंगिकता का है। उनके महत्व के बावजूद, एचएससी और एमपीपी हेमटोपोइएटिक प्रणाली के भीतर सबसे दुर्लभ कोशिकाओं में से हैं। एक माउस से, आमतौर पर, लगभग 5000 एचएससी को 7,8,9 से अलग किया जा सकता है। पारंपरिक metabolomics तरीकों के रूप में अधिक इनपुट सामग्री की आवश्यकता होती है, कई चूहों से पूलिंग कोशिकाओं अक्सर दुर्लभ सेल प्रकार10,11 का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक था.

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक माउस12 के एचएससी से metabolomics डेटा की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए नमूना प्रति 5000 कोशिकाओं के रूप में कम में चयापचयों के माप सक्षम बनाता है विकसित करने का लक्ष्य रखा. इसी समय, यह विधि लिम्फोसाइटों जैसे अधिक प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के लिए एक माउस से कई प्रतिकृतियां उत्पन्न करने की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण किसी दिए गए परियोजना के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है, इस प्रकार पशु प्रयोगों के "3R" (कमी, प्रतिस्थापन, शोधन) में योगदान देता है।

कोशिकाओं में चयापचयों में बहुत अधिक कारोबार दर हो सकती है, अक्सर सेकंड13 के क्रम में। हालांकि, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के लिए नमूने तैयार करने में घंटों लग सकते हैं, और एफएसीएस खुद को सॉर्ट करने में मिनटों से लेकर घंटों तक लग सकते हैं, जिससे गैर-शारीरिक स्थितियों के कारण मेटाबोलोम में संभावित परिवर्तन हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कुछ अभिकर्मकों (जैसे अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम [एके] लाइसिस बफर) के समान प्रभाव हो सकते हैं। इन स्थितियों सेलुलर तनाव पैदा कर सकता है और स्तर और कोशिकाओं के भीतर चयापचयों के अनुपात को प्रभावित, सेलुलर चयापचय 14,15,16 के गलत या पक्षपाती माप के लिए अग्रणी. नमूना तैयार करने के कारण चयापचय परिवर्तन को कभी-कभी सॉर्टिंग कलाकृतियों के रूप में जाना जाता है। लंबे पाचन प्रोटोकॉल और कठोर अभिकर्मकों कि कठिन या कठिन ऊतकों से एकल सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हो सकता है इस मुद्दे को बढ़ा सकते हैं. क्या परिवर्तन हो सकते हैं संभावना सेल प्रकार और प्रसंस्करण की स्थिति पर निर्भर करता है। परिवर्तनों की सटीक प्रकृति अज्ञात बनी हुई है, क्योंकि जीवित ऊतक में अबाधित कोशिकाओं की चयापचय स्थिति को मापा नहीं जा सकता है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक म्यान तरल पदार्थ के रूप में 5 ग्राम / एल NaCl का उपयोग, निष्कर्षण बफर में सीधे छँटाई, हाइड्रोफिलिक बातचीत तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआईएलआईसी-एमएस) पर बड़े नमूना संस्करणों इंजेक्शन, पारंपरिक तरीकों की तुलना में कई महत्वपूर्ण मतभेद शामिल हैं, और लक्षित परिमाणीकरण, आंतरिक मानकों और पृष्ठभूमि नियंत्रण के कठोर उपयोग का उपयोग(चित्रा 1)). इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार के बीच और दवा उपचार और वाहन नियंत्रण के बीच एक काफी हद तक12 मतभेद को संरक्षित करने की क्षमता है. यहां तक कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, यह वैकल्पिक दृष्टिकोणों के अनुकूल तुलना करता है, जैसे कि अधिक स्थापित सेंट्रीफ्यूजेशन और सुपरनेटेंट के मैनुअल हटाने। हालाँकि, चूंकि कलाकृतियों को छाँटना अभी भी हो सकता है, डेटा की सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। इस सीमा के बावजूद, प्रोटोकॉल चयापचय रूपरेखा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, दुर्लभ प्राथमिक कोशिकाओं12 में सेलुलर चयापचय के अधिक सटीक और व्यापक माप के लिए अनुमति देता है.

दुर्लभ प्राथमिक कोशिकाओं में व्यापक चयापचय प्रोफाइल को मजबूती से मापने की क्षमता इन कोशिकाओं से जुड़े जैव चिकित्सा अनुसंधान में नए प्रयोगों के लिए द्वार खोलती है। उदाहरण के लिए, एचएससी में चयापचय मध्यस्थता विनियमन को निष्क्रिय आत्म-नवीकरण क्षमता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, एनीमिया और ल्यूकेमिया 11,17के लिए निहितार्थ के साथ। रोगी व्युत्पन्न परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं में, ट्यूमर और आसन्न कोशिकाओं के बीच चयापचय जीन की अभिव्यक्ति में मतभेद 18,19दिखाया गया है. यह प्रोटोकॉल अब शोधकर्ताओं को चयापचय स्तर पर व्यवस्थित रूप से इन मतभेदों का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिसे आमतौर पर जीन अभिव्यक्ति की तुलना में सेलुलर फेनोटाइप के करीब माना जाता है।

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Protocol

प्रजनन और इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया सभी चूहों के पति स्थानीय अधिकारियों (Regierungspräsidium फ्रीबर्ग) के नियमों के अनुसार इम्यूनोबायोलॉजी और Epigenetics के लिए मैक्स प्लैंक संस्थान में एक पारंपरिक पशु सुविधा में आयोजित किए गए थे (Regierungspräsidium Freiburg). एमपीआई-आईई और स्थानीय अधिकारियों की पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों और नियमों के बाद फेलासा बी-प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा सीओ2 और ग्रीवा अव्यवस्था के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी। कोई पशु प्रयोग नहीं किया गया था, और चूहे स्वास्थ्य बोझ के बिना थे।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एलसी-एमएस विधि जैसे अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषणात्मक तरीकों में नमूने में भी बहुत मामूली संदूषण का पता लगाने की क्षमता है। इसलिए, इस तरह के संदूषण को कम करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। सबसे महत्वपूर्ण उपाय यह है कि नमूनों के संपर्क में आने वाली किसी भी चीज को छूते समय साफ दस्ताने पहनें। इसमें उदाहरण के लिए, बफ़र्स और म्यान तरल पदार्थ की तैयारी, नमूना ट्यूबों की लेबलिंग और प्रयोगशाला उपकरणों की सफाई शामिल है। इसके अलावा, जब भी संभव हो एकल-उपयोग लैबवेयर का उपयोग किया जाना चाहिए। कांच के बने पदार्थ का उपयोग करने से पहले एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स के साथ rinsed किया जाना चाहिए। एक स्वच्छ कार्य वातावरण आगे संदूषण को कम करने में मदद करता है।

1. सामान्य तैयारी

  1. आंतरिक मानक स्टॉक समाधान तैयार करें: अल्ट्राप्योर पानी में 30% वी/वी 2-प्रोपेनॉल में 6 मिलीग्राम/एमएल क्लोरो-फेनिलएलनिन (सीएलएफ) और 6 मिलीग्राम/एमएल एमिनोटेरेफेलिक एसिड (एटीए) तैयार करें।
  2. FACS resuspension बफर तैयार करें: NaCl के 0.9 ग्राम, अल्ट्राप्योर पानी के 99.5 एमएल, और आंतरिक मानक स्टॉक समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस के लिए प्री-कूल।
  3. म्यान द्रव तैयार करें: एक म्यान द्रव टैंक में, 6 एल विआयनीकृत पानी में 30 ग्राम NaCl भंग और एक सेल सॉर्टर से कनेक्ट.
    नोट: म्यान तरल पदार्थ में NaCl की एकाग्रता को सॉर्टर में बूंदों के विक्षेपण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है जो कि शीथ तरल पदार्थ के रूप में पीबीएस का उपयोग करते समय मजबूत होता है और साथ ही एलसी-एमएस12 द्वारा मेटाबोलाइट का पता लगाने पर नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए। NaCl की कम सांद्रता metabolite का पता लगाने के लिए फायदेमंद हैं, लेकिन कोशिकाओं की मजबूत छँटाई ख़राब है.

2. प्लीहा से बी और टी कोशिकाओं का अलगाव

  1. प्री-कूल 90 एमएल फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) प्रति माउस एक फ्रिज में या बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस तक। एक अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-कूल करें।
  2. प्लीहा का अलगाव
    नोट: यह तेजी से काम करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण है, बर्फ पर, और ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) बफ़र्स के साथ सेल अलगाव और निम्नलिखित धुंधला चरणों के दौरान. अन्यथा, कोशिकाओं की चयापचय प्रोफ़ाइल काफी बदल सकती है।
    1. बर्फ पर एक 2 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में पीबीएस के 1.5 एमएल तैयार करें.
    2. स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों और विधियों के अनुसार C57BL6/J माउस को इच्छामृत्यु दें।
    3. 70% इथेनॉल के साथ फर जीवाणु।
    4. कैंची के साथ पेट खोलें और अंग को तोड़ने के बिना ठीक संदंश का उपयोग तिल्ली को हटा दें। तुरंत ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) में तिल्ली जगह.
  3. एकल-कोशिका निलंबन की पीढ़ी
    1. एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी रखें और पीबीएस के साथ गीला करें। एक सिरिंज सवार और ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 30 एमएल के अंगूठे आराम का उपयोग कर जाल के माध्यम से तिल्ली पास
    2. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    3. एसीके लाइसिस बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान (आरटी; 20 डिग्री सेल्सियस) पर 2 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 50 एमएल जोड़ें. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. FACS धुंधला हो जाना
    1. प्रति माउस ठंडे पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 500 माइक्रोन में एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें: सीडी 3-पीई (1: 200), बी 220-ए 647 (1: 200)।
    2. एंटीबॉडी कॉकटेल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एक 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरण। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 3 एमएल जोड़ें. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. ठंड FACS निलंबन बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल में सेल गोली resuspended resuspension. एक फिल्टर कैप FACS ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। कोशिकाएं प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित छँटाई के लिए तैयार हैं।

3. अस्थि मज्जा से एचएससी और एमपीपी का अलगाव

  1. अस्थि मज्जा को काटना और अलग करना।
    नोट: सटीक परिणाम की अनुमति देने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान तेजी से काम करना और पृथक हड्डियों और कोशिकाओं को ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) रखना सबसे महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, पृष्ठभूमि संकेतों को कम करने के लिए, एक स्वच्छ स्थान और प्रयोगशाला उपकरण का काम और उपयोग करें।
    1. स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों और विधियों के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    2. चूहों के निचले हिस्से पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें।
    3. कैंची का उपयोग करके पैरों और रीढ़ को काटना। पीठ पर एक चीरा बनाएं और कट को पेट के चारों ओर बढ़ाएं। हिंद अंगों से त्वचा छीलें।
    4. हिंद अंगों को चीर या काट लें, और सुनिश्चित करें कि पैरों में टिबिया, फीमर और कूल्हे के जोड़ हैं।
    5. कैंची लें और पूरी तरह से हटाए जाने तक उन्हें रीढ़ के साथ काट लें।
    6. पैरों और रीढ़ को ठंडे पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेटों में वितरित करें और प्लेटों को बर्फ पर रखें।
    7. फीमर, टिबिया, कूल्हे के जोड़, और एक स्केलपेल और कैंची का उपयोग कर नरम ऊतक के कशेरुकाओं को साफ करें।
    8. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 5 एमएल में मोर्टार और मूसल के साथ साफ हड्डियों को क्रश करें।
    9. एक 50 एमएल ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर.
    10. 3.1.8-3.1.9 कदम दोहराएँ जब तक हड्डियों पूरी तरह से सफेद दिखाई देते हैं.
  2. एरिथ्रोसाइट्स का लसीका:
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर काटा सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    2. ठंड एसीके बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. प्रतिक्रिया (वैकल्पिक) को रोकने के लिए ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. वंश की कमी:
    नोट: वंश नकारात्मक (लिन-) कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए, सीडी 4 कोशिकाओं के लिए एक नकारात्मक चयन किट का उपयोग किया गया था।
    1. चुंबकीय मोती तैयार करें:
      1. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में मोतियों के 500 माइक्रोन जोड़ें। एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
      2. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल के साथ मोती धो लें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
      3. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 500 माइक्रोन जोड़ें और मोतियों को ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) रखें।
    2. अंधेरे में 25 मिनट (मिलाते हुए, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए वंश कॉकटेल के 500 माइक्रोन (किट + पीबीएस के 450 माइक्रोन द्वारा प्रदान किए गए एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें।
    5. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 1000 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को मनका समाधान में स्थानांतरित करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
    7. ट्यूबों को चुंबक पर रखें और समाधान साफ होने तक प्रतीक्षा करें। सतह पर तैरनेवाला एक ताजा FACS ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    8. पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ मोती धो लें।
    9. ट्यूबों को चुंबक पर रखें और समाधान साफ होने तक प्रतीक्षा करें।
    10. सतह पर तैरनेवाला ताजा FACS ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. FACS के लिए धुंधला हो जाना
    1. ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) में माउस प्रति एंटीबॉडी मिश्रण के 300 माइक्रोन तैयार करें।
    2. स्टेम/पूर्वज कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी मिश्रण: एचएससी: सीडी4(1:1000)/सीडी8ए(1:1000)/बी220(1:1000)/टेर119(1:500)/जीआर-1(1:1000)/सीडी11बी - पेसी7(1:1000), सी-किट - पीई(1:1000), एससीए1 - एपीसी-सीवाई7(1:500), सीडी48 - बीवी421(1:1000), सीडी150 - बीवी605(1:300)
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 40 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    4. ठंडे पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल के साथ धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. FACS resuspension बफर के 1 एमएल में सेल गोली resuspended और एक फिल्टर कैप FACS ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं को फिल्टर.

4. FACS छँटाई

  1. कक्ष सॉर्टर सेट करें.
    1. 70 माइक्रोन नोजल टिप डालें। 405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम और 633 एनएम लेजर सक्रिय करें।
    2. सॉर्ट मोड को 4 वे शुद्धता पर सेट करें: उपज मास्क 0, शुद्धता मास्क 32, चरण मास्क 0
    3. ड्रॉप आवृत्ति को 90,400 हर्ट्ज पर सेट करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार आयाम और ड्रॉप देरी को समायोजित करें। प्लेट वोल्टेज को 5000 वी पर सेट करें।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सॉर्टिंग गेट्स को परिभाषित करें।
      1. सभी सेल प्रकारों के लिए, पहले, आगे स्कैटर और साइडवर्ड स्कैटर सिग्नल के आधार पर एकल कोशिकाओं का चयन करें, इसके बाद सेल प्रकार-विशिष्ट धुंधला के आधार पर चयन करें।
      2. बी कोशिकाओं के लिए, AF647-पॉजिटिव, पीई-नकारात्मक आबादी का चयन करें।
      3. टी कोशिकाओं के लिए, पीई-पॉजिटिव, AF647-नकारात्मक जनसंख्या का चयन करें।
      4. एचएससी के लिए, पीई-सीवाई7-लो, पीई-पॉजिटिव, एपीसी-सीवाई7-पॉजिटिव, बीवी605-पॉजिटिव, बीवी421-नेगेटिव आबादी का चयन करें।
      5. MPPs के लिए, PE-Cy7-लो, PE-पॉजिटिव, APC-Cy7-पॉजिटिव, BV421-पॉजिटिव, BV605-नेगेटिव, जनसंख्या का चयन करें।
      6. मलबे के नमूनों के लिए, आगे बिखराव और sideward तितर बितर संकेत के आधार पर बरकरार कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए बहुत छोटे हैं कि घटनाओं का चयन करें. इन गेटिंग रणनीतियों को दिखाने वाले विशिष्ट एफएसीएस भूखंडों को चित्र 2 और चित्र 3 में दिखाया गया है।
    5. 15,000 से कम घटनाओं/घटनाओं को प्राप्त करने के लिए प्रवाह दर को समायोजित करें।
  2. संग्रह प्लेट तैयार करें
    1. खमीर निकालने स्टॉक समाधान तैयार करें: अल्ट्राप्योर एच2ओ के 7.5 एमएल और मेथनॉल के 2.5 एमएल में 13सी खमीर निकालने के 1 विभाज्य को फिर से निलंबित करें।
    2. निष्कर्षण बफर तैयार करें: एसीटोनिट्राइल के 10 एमएल के लिए 13सी खमीर निकालने स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण करें।
    3. संग्रह प्लेट तैयार करें: नमूना एकत्र करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में निष्कर्षण बफर के 25 माइक्रोन जोड़ें। वाष्पीकरण को कम करने के लिए, पीसीआर ढक्कन (एकल में कटौती धारियों) के साथ कुओं को कवर करें।
  3. कक्ष सॉर्ट निष्पादित करें.
    1. सॉर्ट की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए आवश्यकतानुसार संग्रह कुओं को खोलें और वाष्पीकरण को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके उन्हें बंद करें।
  4. यदि नमूने तुरंत मापा नहीं जा सकता है, तो उन्हें कई दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सील कंटेनर में स्टोर करें। विगलन के बाद, चयापचयों का पूरा resuspension सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट के लिए नमूने sonicate.

5. LC-QQQ-MS माप

  1. एलसी सॉल्वैंट्स तैयार करें
    1. मेड्रोनिक एसिड स्टॉक समाधान (100 मिमी) तैयार करें: अल्ट्राप्योर एच2ओ के 1 एमएल में 17.6 मिलीग्राम मेड्रोनिक एसिड भंग करें।
    2. बफर ए तैयार करें: अल्ट्राप्योर एच2ओ के 1 एल में 1.92 ग्राम अमोनियम कार्बोनेट को भंग करें, और मेड्रोनिक एसिड स्टॉक समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें।
    3. बफर बी तैयार करें: एसीटोनिट्राइल के 450 एमएल के साथ बफर के 50 एमएल मिलाएं।
    4. एलसी टेस्ट मिक्स तैयार करें: 80:20 एसीटोनिट्राइल में ल्यूसीन, आइसोल्यूसीन, एएमपी, एडीपी और एटीपी में से प्रत्येक 1 पीपीएम मिलाएं: अल्ट्राप्योर एच2ओ।
      नोट: मेड्रोनिक एसिड स्टॉक को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; अन्य बफ़र्स को 2 दिनों के लिए आरटी पर रखा जा सकता है।
  2. कार्यक्रम LC-QQQ-MS विधि
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार यौगिक-विशिष्ट एमएस सेटिंग्स (जैसे, टकराव ऊर्जा) का अनुकूलन करें। एगिलेंट 6495-श्रृंखला उपकरणों के लिए, पूरक तालिका 1 में सेटिंग्स का उपयोग करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्रोत-विशिष्ट एमएस सेटिंग्स का अनुकूलन करें। जेटस्ट्रीम तातो ESI स्रोत भएका उपकरणहरूको लागि, निम्न प्यारामीटरहरू प्रयोग गर्नुहोस्: ग्यास अस्थायी: 240 °C, ग्यास प्रवाह: 15 L/min, छिटकानेवाला: 50 साई, म्यान ग्यास अस्थायी: 400 °C, म्यान ग्यास प्रवाह: 11 L/मिनट, केशिका भोल्युमtage: 2000 V, नोजल भोल्युमtage: 300 V।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आयन ट्रांसफर ऑप्टिक्स की सेटिंग्स का अनुकूलन करें। iFunnel आयन ऑप्टिक्स वाले एगिलेंट उपकरणों के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: उच्च दबाव आरएफ सकारात्मक: 110 वी, उच्च दबाव आरएफ नकारात्मक: 90 वी, कम दबाव आरएफ सकारात्मक: 80 वी, कम दबाव आरएफ नकारात्मक: 60 वी।
    4. एलसी ढाल कार्यक्रम: 0 मिनट, 95% बी, 150 माइक्रोन / मिनट; 18 मिनट, 55% बी, 150 माइक्रोन / मिनट; 19 मिनट, 30% बी, 150 माइक्रोन / मिनट; 21.5 मिनट, 30% बी, 150 माइक्रोन / मिनट; 22 मिनट, 95% बी, 150 माइक्रोन / मिनट; 22.7 मिनट, 95% बी, 200 माइक्रोन / मिनट, 23.5 मिनट, 95% बी, 400 माइक्रोन / मिनट; स्टॉप टाइम 28 मिनट। कॉलम तापमान: 35 डिग्री सेल्सियस।
  3. एलसी-एमएस उपकरण सेट करें।
    1. तापमान नियंत्रित स्तंभ डिब्बे में क्रोमैटोग्राफिक कॉलम कनेक्ट करें।
    2. बफ़र्स कनेक्ट करें और सभी लाइनों को शुद्ध करें।
    3. कॉलम को संतुलित करने के लिए कम से कम 4 रिक्त नमूने या पूल नमूने चलाएं।
  4. क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन की जांच करने के लिए एलसी परीक्षण मिश्रण चलाएं। सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित मानदंड पूरे हुए हैं। यदि नहीं, तो नमूने चलाने से पहले उपकरण को साफ या समस्या निवारण करें।
    1. पुष्टि करें कि प्रारंभिक बैकप्रेशर <150 बार है और अधिकतम बैकप्रेशर <400 बार है।
    2. पुष्टि करें कि अवधारण समय निम्नानुसार ±1 मिनट की खिड़की में हैं: आइसोलेकिन 6.0 मिनट, ल्यूसीन 6.4 मिनट, एएमपी 9.5 मिनट, एडीपी 11.2 मिनट, और एटीपी 12.7 मिनट।
    3. सुनिश्चित करें कि +132->86 संक्रमण में ल्यूसीन और आइसोलेकिन के बीच की घाटी चोटी की ऊंचाई का < 20% है।
    4. सुनिश्चित करें कि प्रतिधारण समय एएमपी से एडीपी में अंतर 1.5 से 1.9 मिनट है, और एटीपी के लिए प्रतिधारण समय एडीपी में अंतर 1.1 से 1.9 मिनट है।
  5. कार्यसूची सेट करें
    1. एलसी परीक्षण मिश्रण से कैरी-ओवर को कम करने के लिए एक खाली नमूने से शुरू करें।
    2. यादृच्छिक क्रम में नमूने चलाएँ.
    3. भविष्य के प्रयोगों के लिए स्तंभ को साफ करने के लिए एक खाली नमूने के साथ समाप्त करें।

6. automRm में डेटा प्री-प्रोसेसिंग

नोट: निम्नलिखित चरणों में msconvert में .d से .mzML में रूपांतरण, मेटाबडीबी की तैयारी, डेटा और मॉडल लोड करना और मेटाबडीबी और मैनुअल पीक रिव्यू के लिए सामान्य रणनीतियों पर चर्चा की गई है।

  1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ ProteoWizard20 का उपयोग करके कच्चे डेटा को .d प्रारूप से .mzML प्रारूप में कनवर्ट करें: बाइनरी एन्कोडिंग परिशुद्धता: 32-बिट, MS स्तर 1-2, सूचकांक लिखें चयनित, zlib संपीड़न का उपयोग करें चयनित।
  2. आर शुरू करें।
  3. पैकेज दस्तावेज़ीकरण के अनुसार automRm21 स्थापित करें (पहले उपयोग से पहले केवल एक बार आवश्यक)।
  4. आर में automRm जीयूआई प्रारंभ करें: automRm::automrm_gui()
  5. टैब में .d फ़ाइलों के बैच को संसाधित करें प्रक्रिया > प्रक्रिया बैच।
    1. मेटाबोलाइट जानकारी रखने वाली .xlsx फ़ाइल का चयन करें। यह फ़ाइल LC-QQQ-MS विधि से मेल खाना चाहिए।
    2. चुनना। RData फ़ाइल होल्डिंग पीक पिकिंग ML मॉडल।
    3. चुनना। RData फ़ाइल पीक रिपोर्टिंग ML मॉडल को पकड़े हुए है।
    4. .mzML फ़ाइलों वाले प्रोजेक्ट फ़ोल्डर का चयन करें।
    5. प्रक्रिया बैच क्लिक करके डेटा प्री-प्रोसेसिंग प्रारंभ करें.
  6. प्री-प्रोसेसिंग समाप्त होने के बाद, क्रोमैटोग्राफिक चोटियों का सही पता लगाने की जांच करने के लिए peakoverview.pdf खोलें। वैकल्पिक रूप से, automRmdata_Review.RData को मैन्युअल रूप से पीक फ़िल्टरिंग और पीक एकीकरण को संशोधित करने के लिए automRm GUI के समीक्षा टैब से लोड करें।
  7. प्रोजेक्ट फ़ोल्डर से peakinfo.xlsx खोलें और डेटा की जांच करें।
    1. टैब 13CArea में 13C आंतरिक मानक संकेत की जाँच करें: सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक समूहों के बीच और सेल नमूनों और मलबे के नमूनों के बीच तीव्रता मूल्यों में कोई व्यवस्थित अंतर नहीं हैं। यदि ऐसे अंतर मौजूद हैं, तो बाद के विश्लेषण के लिए केवल NormArea या NormHeight टैब से डेटा का उपयोग करें; अन्यथा, टैब से डेटा का उपयोग करें RawArea या RawHeight.
    2. टैब RawArea में आंतरिक मानकों ATA और CLF की सिग्नल तीव्रता की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक समूहों के बीच या तो यौगिक की तीव्रता में कोई व्यवस्थित मतभेद नहीं हैं।
    3. प्रत्येक metabolite के लिए, एक ही सेल निलंबन से मलबे के नमूने के लिए कोशिकाओं युक्त नमूनों की संकेत तीव्रता की तुलना. चयापचयों की पहचान करने के लिए एक उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करें जिसमें कोशिकाओं वाले नमूनों में मलबे के नमूनों की तुलना में अधिक तीव्रता होती है। केवल उन चयापचयों को शामिल करें जो बाद के डेटा विश्लेषण में इस परीक्षण को पास करते हैं।

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Representative Results

एफएसीएस छँटाई एक ही सेल निलंबन (चित्रा 2 और चित्रा 3) से विभिन्न सेल प्रकार की स्वच्छ आबादी के अलगाव को सक्षम बनाता है। इस विधि की विशिष्टता विशिष्ट सतह मार्करों (उदाहरण के लिए, तिल्ली से बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं) या सतह मार्करों (उदाहरण के लिए एचएससी और एमपीपी) के विशिष्ट संयोजनों के साथ विभिन्न सेल प्रकारों के धुंधला होने पर निर्भर करती है। इंट्रासेल्युलर मार्करों के धुंधला होने के लिए आमतौर पर कोशिका झिल्ली के पारगम्यता की आवश्यकता होती है। यह चयापचयों के रिसाव का कारण बन सकता है, और इसलिए इस प्रकार का धुंधला इस प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए उपयुक्त नहीं है।

एलसी एमएस (चित्रा 4) द्वारा पता लगाने से पहले चयापचयों को अलग करता है। मेटाबोलाइट्स एचआईएलआईसी कॉलम से लगभग ध्रुवीयता द्वारा क्रमबद्ध होते हैं, जिसमें कम ध्रुवीय यौगिक जल्दी और अधिक ध्रुवीय चयापचयों को बाद में उत्सर्जित करते हैं। सिग्नल की तीव्रता नमूने में एक लक्ष्य मेटाबोलाइट की मात्रा और एक मेटाबोलाइट-विशिष्ट प्रतिक्रिया कारक द्वारा निर्धारित की जाती है। नतीजतन, सिग्नल तीव्रता को मेटाबोलाइट्स में सार्थक रूप से तुलना नहीं की जा सकती है, लेकिन नमूनों में केवल एक मेटाबोलाइट के लिए। चित्रा 4 में हाइलाइट किए गए 3 चोटियों का प्रतिनिधित्व 1: नियासिनमाइड मलबे और सेल निकालने दोनों में पाया जाता है, यद्यपि विभिन्न स्तरों पर, 2: एसिटाइल-कार्निटाइन जो लगभग विशेष रूप से सेल अर्क में पाया जाता है, और 3: आंतरिक मानक एमिनोटेरेफैलिक एसिड जो मलबे के नमूनों और सेल अर्क में समान स्तर पर पाया जाता है।

एक ही ऊतक से सेल प्रकारों के बीच चयापचय अंतर संयुक्त एफएसीएस-एलसी-एमएस प्रोटोकॉल(चित्रा 5)का उपयोग करके संरक्षित किया जाता है। एचएससी और एमपीपी के लिए, 6 चूहों की कोशिकाओं को 6 नमूने उत्पन्न करने की आवश्यकता थी, जिससे बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं की तुलना में प्रत्येक समूह के भीतर एक बड़ी परिवर्तनशीलता हुई, जिन्हें एक ही मुराइन प्लीहा से हल किया गया था। प्रक्रिया रिक्त नियंत्रण नमूनों का प्रतिनिधित्व करने वाले मलबे के नमूने स्पष्ट रूप से सेल अर्क युक्त नमूनों से अलग होते हैं। मलबे के नमूनों के भीतर, दो प्रयोगों का एक स्पष्ट पृथक्करण दिखाई देता है, जो चयापचय वातावरण में अंतर को उजागर करता है जो कोशिकाओं को सॉर्ट से पहले अनुभव करता है। जब एक क्लस्टर हीटमैप (चित्रा 6) में प्रतिनिधित्व किया जाता है, तो अतिरिक्त जानकारी दिखाई देती है, जैसे नमूनों में चयापचयों के सापेक्ष स्तर।

Figure 1
चित्रा 1: प्रस्तुत प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों का अवलोकन। इस आंकड़े को स्कोनबर्गर एट अल.12 की अनुमति से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्लीहा से बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं की शुद्ध आबादी का अलगाव। कोशिकाओं और मलबे की घटनाओं को फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइडवर्ड स्कैटर (एसएससी) संकेतों के आधार पर चुना गया था। बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं सेल प्रकार विशिष्ट धुंधला संकेतों के आधार पर चुना गया. यह आंकड़ा स्कोनबर्गर एट अल.12से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अस्थि मज्जा से एचएससी और एमपीपी का अलगाव। कोशिकाओं और मलबे की घटनाओं को फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइडवर्ड स्कैटर (एसएससी) संकेतों के आधार पर चुना गया था। एचएससी और एमपीपी आबादी सेल प्रकार विशिष्ट धुंधला संकेतों के कई चरणों के आधार पर चुना गया. यह आंकड़ा स्कोनबर्गर एट अल.12से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उदाहरण क्रोमैटोग्राम। (ए) 5000 एचएससी और (बी) 5000 मलबे की घटनाओं के साथ नमूने एक ही प्रकार से। ध्यान दें कि अक्ष दोनों पैनलों में समान पैमाने को साझा करते हैं। हाइलाइट किए गए मेटाबोलाइट्स 1: निकोटिनामाइड, 2: एसिटाइल-कार्निटाइन, 3: एमिनोटेरेफेलिक एसिड (एटीए) हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक ही प्रयोगों से विभिन्न सेल प्रकारों और मलबे पृष्ठभूमि के नमूनों के चयापचय प्रोफाइल के प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए)। किसी भी अंग से विभिन्न अंगों और मलबे की पृष्ठभूमि के नमूनों के बीच प्रमुख अलगाव मनाया जाता है। इसके अलावा, प्रत्येक अंग की कोशिकाओं के भीतर सेल प्रकार स्पष्ट रूप से अलग होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: हीटमैप विभिन्न सेल प्रकारों और मिलान पृष्ठभूमि नियंत्रण नमूने (मलबे) में मापा चयापचयों का प्रतिनिधित्व करता है। लापता मूल्यों को सभी नमूनों में एक ही मेटाबोलाइट के आधे-न्यूनतम मूल्य के साथ लगाया गया था। प्लॉटिंग के लिए, डेटा को प्रत्येक पंक्ति में अलग-अलग अधिकतम करने के लिए सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: तालिका चयनित चयापचयों के लिए यौगिक-विशिष्ट सेटिंग्स को सूचीबद्ध करती है, जिसमें प्रतिधारण समय (RT), ध्रुवीयता (Pol), अग्रदूत m/z (Q1), टुकड़ा m/z (Q3), और टक्कर ऊर्जा (CE) शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग लक्षित metabolomics के सफल कार्यान्वयन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं 1) एक मजबूत धुंधला और गेटिंग रणनीति है कि स्वच्छ सेल आबादी उपज जाएगा 2) तरल मात्रा की सटीक हैंडलिंग, 3) सभी प्रयोगात्मक चरणों के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समय, विशेष रूप से मेटाबोलाइट निष्कर्षण से पहले सभी कदम. आदर्श रूप में, एक प्रयोग से संबंधित सभी नमूनों को संसाधित किया जाना चाहिए और बैच प्रभाव22 को कम करने के लिए एक बैच में मापा जाना चाहिए। बड़े प्रयोगों के लिए, हम -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल अर्क एकत्र करने और फिर एक बैच में सभी अर्क को मापने का सुझाव देते हैं।

कम इनपुट नमूने के साथ काम करते समय, प्रयोगों के पाठ्यक्रम में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों की स्वच्छ हैंडलिंग पर जोर दिया जाना चाहिए23. सामान्य संदूषण अवशिष्ट बफर, डिटर्जेंट और त्वचा देखभाल उत्पाद हैं। संदूषण को कम करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण उपाय प्रयोग के दौरान उपयुक्त दस्ताने का उपयोग है.

अभौतिक स्थितियों के लिए कोशिकाओं के जोखिम के कारण मेटाबोलाइट संरचना में संभावित परिवर्तन को कम करने के लिए, बर्फ पर नमूने तैयार करना महत्वपूर्ण है और ठंड अभिकर्मकों (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, FACS चरण से पहले जितना संभव हो उतना तेज़ होने से माप2 की गुणवत्ता में वृद्धि होगी। एंटीबॉडी धुंधला के लिए संकेतित समय अच्छा धुंधला दक्षता के लिए उचित के रूप में कम कर रहे हैं. एफसी-ब्लॉक एंटीबॉडी का उपयोग करके एफसी रिसेप्टर्स के लिए एंटीबॉडी के अनिर्दिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए एक अतिरिक्त कदम एफएसीएस धुंधला प्रक्रिया24,25 से पहले जोड़ा जा सकता है। यह लक्ष्य सेल आबादी के संदूषण को रोकता है और विशेष रूप से सलाह दी जाती है जब सेल निलंबन के साथ काम करते समय कई एफसी-रिसेप्टर उच्च सेल प्रकार (जैसे मोनोसाइट्स या मैक्रोफेज) या कोशिकाएं जो सीरम के बिना सुसंस्कृत थीं। हालांकि, यह 10-15 मिनट से समग्र हैंडलिंग समय में वृद्धि करेगा और इसलिए परिणामों में अतिरिक्त गैर-शारीरिक परिवर्तनशीलता जोड़ सकता है।

आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर गतिशील एमआरएम विधियों के उपयोग के साथ, यौगिक-विशिष्ट सेटिंग्स में सूचीबद्ध सभी चयापचयों को एक इंजेक्शन के साथ दर्ज किया जा सकता है। लक्ष्य चयापचयों की संख्या को सीमित करना पुराने द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर वर्णित प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन की अनुमति देता है और डेटा प्री-प्रोसेसिंग और डेटा विश्लेषण को तेज करता है।

एलसी-एमएस डेटा में पृष्ठभूमि संकेत का कुछ स्तर अपरिहार्य है। इसलिए, उन चयापचयों की पहचान करने के लिए बहुत सावधानी बरतनी चाहिए जिन्हें पृष्ठभूमि के ऊपर पता लगाया जा सकता है। सॉर्टिंग घटनाओं है कि भी बरकरार कोशिकाओं (मलबे) का प्रतिनिधित्व करने के लिए छोटे हैं प्रासंगिक प्रक्रिया रिक्त नमूने मैट्रिक्स-निर्भर पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है उत्पन्न करता है. इसके अलावा, आंतरिक मानकों समस्याग्रस्त नमूनों है कि आगे डेटा विश्लेषण26 से बाहर रखा जाना चाहिए की पहचान की अनुमति. दोनों गुणवत्ता आश्वासन उपाय सबसे अच्छा काम करते हैं यदि पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में प्रतिकृतियां उपलब्ध हैं। हम प्रति समूह कम से कम छह प्रतिकृतियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जानवरों को प्रदान करने के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोबायोलॉजी और एपिजेनेटिक्स की पशु सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

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References

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