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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65690
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、希少な細胞タイプの代謝物を正確かつ確実に測定するためのプロトコルを紹介します。細胞選別用の改良シース液や関連するブランクサンプルの生成などの技術的改善により、サンプルあたりわずか5000細胞のインプットで代謝物の包括的な定量が可能になりました。

Abstract

細胞機能は代謝に大きく依存しており、その根底にある代謝ネットワークの機能は、低分子中間体を測定することで研究することができます。しかし、特に造血幹細胞のような希少な細胞種において、細胞代謝の正確で信頼性の高い測定値を得るには、従来、複数の動物の細胞をプールする必要がありました。プロトコルにより、研究者は、サンプルごとに1つのマウスのみを使用して希少な細胞タイプの代謝物を測定し、より豊富な細胞タイプに対して複数の複製を生成することができます。これにより、特定のプロジェクトに必要な動物の数が減ります。ここで紹介するプロトコールには、5 g/L NaClをシース液として使用する、アセトニトリルに直接選別する、内部標準を厳密に使用してターゲット定量を利用するなど、従来のメタボロミクスプロトコルとはいくつかの重要な違いがあり、細胞代謝のより正確で包括的な測定を可能にします。単一細胞の単離、蛍光染色、選別に時間がかかるにもかかわらず、このプロトコルは細胞タイプ間および薬物治療の違いを大幅に保持することができます。

Introduction

代謝は、すべての生細胞で発生する重要な生物学的プロセスです。代謝プロセスには、緊密に制御され相互接続された生化学反応の広大なネットワークが含まれており、細胞がエネルギーを生成し、必須の生体分子を合成することを可能にします1。代謝ネットワークの機能を理解するために、研究者は細胞内の低分子中間体のレベルを測定します。これらの中間体は、代謝活性の重要な指標として機能し、細胞機能に関する重要な洞察を明らかにすることができます。

質量分析(MS)は、複雑なサンプル中の代謝物を特異的に検出するための最も一般的な選択肢です1,2。核磁気共鳴(NMR)は、化合物の絶対定量や構造解明に有利ですが、多くの場合、MSは生体液や細胞抽出物などの複雑な混合物中のより多くの成分を分離できます。多くの場合、MSは、キャピラリー電気泳動(CE)、ガスクロマトグラフィー(GC)、または液体クロマトグラフィー(LC)による化合物の事前分離と組み合わされます3。分離プラットホームの選択は、主にターゲット代謝物の範囲とサンプルの種類によって左右され、実際の環境では、機械と専門知識の可用性によって決まります。3つの分離プラットホームはすべて、適切な代謝産物の範囲が広く重複していますが、制限は異なります。簡単に言うと、CEは荷電した分子しか分離できず、多数のサンプルの堅牢な分析を実施するには多くの専門知識が必要です4。GCは、分解する前に蒸発するのに十分なほど小さく、無極性の分子に限定されます3。市販されているすべてのLCカラムを考慮すると、この技術によって任意の2つの代謝物を分離することができます5。ただし、多くの LC 分析法は、同程度の長さの CE 分析法や GC 分析法よりも分離能が低くなります。

メタボロミクス測定のための出発物質の典型的な量は、通常、サンプルあたり5×105 〜5×107 細胞、5〜50mgの湿潤組織、または5〜50μLの体液の範囲である6。しかし、造血幹細胞(HSC)や循環腫瘍細胞など、希少細胞タイプの初代細胞を扱う場合、このような量の出発物質を得ることは困難な場合があります。これらの細胞は、多くの場合、非常に少ない数しか存在せず、重要な細胞の特徴を損なうことなく培養することはできません。

造血幹細胞と多能性前駆細胞(MPP)は、造血系の中で最も分化の少ない細胞であり、生物の生涯を通じて継続的に新しい血液細胞を産生します。造血の調節は、白血病や貧血などの状態において臨床的に関連性があります。その重要性にもかかわらず、造血幹細胞とMPPは造血系内で最も希少な細胞の一つです。1匹のマウスから、典型的には、約5000個のHSCを単離することができる7,8,9。従来のメタボロミクス法ではより多くのインプット材料を必要とするため、希少な細胞タイプを解析するには、複数のマウスの細胞をプールすることが必要になることがよくありました10,11。

ここでは、1匹のマウスの造血幹細胞からメタボロミクスデータを生成できるように、1サンプルあたりわずか5000細胞の代謝物を測定できるプロトコルの開発を目指しました12。同時に、この方法では、リンパ球などのより豊富な細胞タイプに対して、1匹のマウスから複数の複製を生成することができます。このアプローチは、プロジェクトに必要な動物の数を減らし、動物実験の「3R(削減、代替、精緻化)」に貢献します。

細胞内の代謝産物は非常に高い代謝回転率を持つことがあり、多くの場合、秒単位です13。しかし、蛍光活性化細胞選別(FACS)用のサンプルの調製には数時間かかることがあり、FACSの選別自体には数分から数時間かかることがあり、非生理学的条件によるメタボロームの変化につながる可能性があります。このプロトコルで使用される試薬の一部(アンモニウム-塩化物-カリウム[ACK]溶解緩衝液など)は、同様の効果をもたらす可能性があります。これらの状態は細胞ストレスを引き起こし、細胞内の代謝産物のレベルと比率に影響を与える可能性があり、細胞代謝の不正確または偏った測定につながる可能性があります14,15,16。サンプル調製による代謝の変化は、ソーティングアーチファクトと呼ばれることもあります。硬組織または硬い組織から単一細胞懸濁液を産生するために必要となる可能性のある長時間の消化プロトコルと過酷な試薬は、この問題を悪化させる可能性があります。どのような変化が起こり得るかは、細胞の種類や処理条件によって異なる可能性があります。生体組織内の乱れていない細胞の代謝状態を測定できないため、変化の正確な性質は不明のままです。

ここで紹介するプロトコールには、従来の方法と比較していくつかの重要な違いがあり、すなわち、シース液として 5 g/L NaCl を使用すること、抽出バッファーに直接選別すること、親水性相互作用液体クロマトグラフィー質量分析(HILIC-MS)で大量のサンプルを注入すること、ターゲット定量、内部標準の厳密な使用、およびバックグラウンドコントロールを利用すること(図 1)).このプロトコルは、細胞タイプ間および薬物治療と車両制御の違いを大幅に維持する可能性を秘めています12。培養細胞の場合でも、より確立された遠心分離や上清の手動除去などの代替アプローチと比較しても遜色ありません。ただし、並べ替えアーティファクトが発生する可能性があるため、データの解釈には注意が必要です。この制限にもかかわらず、プロトコルは新陳代謝の図表を描くことの分野の重要な改善を表し、まれな初代細胞の細胞新陳代謝のより正確で、広範囲の測定を可能にする12。

希少な初代細胞の幅広い代謝プロファイルを頑健に測定できることで、これらの細胞を含む生物医学研究における新しい実験への扉が開かれます。例えば、造血幹細胞における代謝媒介性調節は、休眠期の自己複製能力に影響を与えることが示されており、貧血や白血病にも影響します11,17。患者由来の循環腫瘍細胞では、腫瘍と隣接細胞との間の代謝遺伝子の発現の違いが示されています18,19。このプロトコルは研究者が遺伝子発現より細胞表現型に近いと一般にみなされる新陳代謝のレベルでこれらの相違を組織的に調査することを可能にする。

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Protocol

このプロトコルに使用されたすべてのマウスの繁殖と飼育は、地方自治体(Regierungspräsidium Freiburg)の規制に従って、免疫生物学およびエピジェネティクス(MPI-IE)のマックスプランク研究所の従来の動物施設で行われました。マウスは、MPI-IEの動物福祉委員会および地方自治体によって承認されたガイドラインと規制に従って、FELASA Bの訓練を受けた職員によってCO2 および子宮頸部脱臼で安楽死させられました。動物実験は行われておらず、マウスは健康上の負担がなかった。

注:このプロトコルで使用される LC-MS 法などの高感度分析法では、サンプル中のごくわずかな汚染でも検出できる可能性があります。したがって、このような汚染を最小限に抑えることが最も重要です。最も重要な対策は、サンプルと接触するものに触れるときはいつでも清潔な手袋を着用することです。これには、例えば、緩衝液やシース液の調製、サンプルチューブのラベリング、実験装置の洗浄などが含まれます。さらに、可能な限りシングルユースの実験器具を使用する必要があります。ガラス器具は、使用前にLC-MSグレードの溶媒ですすぐ必要があります。クリーンな作業環境は、汚染の低減にさらに役立ちます。

1. 一般的な準備

  1. 内部標準原液の調製:6 mg/mL のクロロフェニルアラニン(CLF)と 6 mg/mL のアミノテレフタル酸(ATA)を 30% v/v 2-プロパノール中で超純水に調製します。
  2. FACS再懸濁バッファーの調製:NaCl 0.9 g、超純水99.5 mL、内部標準原液0.5 mLを添加します。4°Cに予冷します。
  3. シース液の調製:シース液タンクに、30 gのNaClを6 Lの脱イオン水に溶解し、セルソーターに接続します。
    注:シース液中の NaCl 濃度は、シース液として PBS を使用する場合と同等の堅牢性を備えたソーターでの液滴の偏向を可能にすると同時に、LC-MS12 による代謝物検出への悪影響を最小限に抑えるように最適化されています。低濃度のNaClは代謝物検出に有利ですが、細胞の頑健な選別を損ないます。

2. 脾臓からのB細胞とT細胞の単離

  1. マウス1匹あたり90 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を冷蔵庫または氷上で4°Cに予冷します。 遠心分離機を4°Cに予冷します。
  2. 脾臓の分離
    注:細胞単離および以下の染色ステップでは、氷上および低温(4°C)バッファーを使用して迅速に作業することが最も重要です。そうしないと、細胞の代謝プロファイルが大幅に変化する可能性があります。
    1. 氷上で2 mLの反応チューブに1.5 mLのPBSを調製します。
    2. C57BL6/Jマウスは、地方自治体が承認したガイドラインと方法に従って安楽死させます。
    3. 70%エタノールで毛皮を殺菌します。
    4. ハサミで腹部を開き、臓器を破裂させずに細かい鉗子を使用して脾臓を取り除きます。すぐに脾臓を冷たいPBS(4°C)に入れます。
  3. シングルセル懸濁液の生成
    1. 70 μmのセルストレーナーを50 mLの遠心チューブに置き、PBSで湿らせます。シリンジプランジャーのサムレストと30 mLの冷たいPBS(4°C)を使用して、脾臓をメッシュに通します
    2. 300 x g で5分間遠心分離します。上澄みを取り除きます。
    3. ペレットを1 mLのACK溶解バッファーに再懸濁し、室温(室温;20°C)で2分間インキュベートします。
    4. 50 mLのコールドPBS(4°C)を加えます。300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  4. FACS染色
    1. マウス1匹あたり500 μLの冷たいPBS(4°C)で抗体カクテルを調製します:CD3-PE(1:200)、B220-A647(1:200)。
    2. 細胞ペレットを抗体カクテルに再懸濁します。5 mL FACS チューブに移します。暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
    3. 3 mLの冷たいPBS(4°C)を加えます。300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    4. 細胞ペレットを1 mLの低温FACS再懸濁バッファー(4°C)に再懸濁します。フィルターキャップFACSチューブで細胞をろ過します。細胞は、フローサイトメトリーによる選別の準備が整っています。

3. 骨髄からの造血幹細胞およびMPPの単離

  1. 骨髄を解剖して分離します。
    注:正確な結果を得るためには、手順全体を通して、分離された骨と細胞を冷たく(4°C)保つことが最も重要です。さらに、バックグラウンド信号を最小限に抑えるために、クリーンなスペースと実験装置を作業および使用してください。
    1. 地方自治体が承認したガイドラインと方法に従ってマウスを安楽死させます。
    2. マウスの下部に70%エタノールをスプレーします。
    3. ハサミを使って脚と脊椎を解剖します。背中を切開し、切り込みを腹部まで伸ばします。後肢の皮をむきます。
    4. 後肢を引き裂くか切り落とし、脚に脛骨、大腿骨、股関節が含まれていることを確認します。
    5. はさみを取り、完全に取り除かれるまで背骨に沿って切ります。
    6. 脚と棘を冷たいPBS(4°C)を含む6ウェルプレートに分配し、プレートを氷上に保持します。
    7. 大腿骨、脛骨、股関節、椎骨の軟部組織をメスとハサミで洗浄します。
    8. 洗浄した骨を乳鉢と乳棒で5mLの冷たいPBS(4°C)で粉砕します。
    9. 細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーでろ過し、50 mLのチューブに入れます。
    10. 骨が完全に白くなるまで、手順3.1.8〜3.1.9を繰り返します。
  2. 赤血球の溶解:
    1. 回収した細胞懸濁液を400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    2. 細胞ペレットを1 mLの低温ACKバッファー(4°C)に再懸濁します。氷上で5分間インキュベートします。
    3. 冷たいPBS(4°C)を加えて反応を停止します(オプション)。
    4. 400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  3. リネージュの枯渇:
    注:系統陰性(Lin-)細胞を濃縮するために、CD4細胞用のネガティブ選択キットを使用しました。
    1. 磁気ビーズを準備します。
      1. 500 μLのビーズを2 mLの微量遠心チューブに入れます。チューブを磁石の上に置き、上澄みを捨てます。
      2. ビーズを1 mLの冷たいPBS(4°C)で洗浄し、上清を廃棄します。
      3. 500 μLのコールドPBS(4°C)を加え、ビーズを冷たく保ちます(4°C)。
    2. 細胞を500 μLのリネージカクテル(キットに付属の抗体50 μL+PBS450 μL)で暗所で25分間(振とう、4°C)インキュベートします。
    3. 細胞を冷たいPBS(4°C)で洗浄します。
    4. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    5. 細胞を1000 μLの低温PBS(4°C)に再懸濁し、細胞懸濁液をビーズ溶液に移します。
    6. 回転ホイール上で4°Cで15分間インキュベートします。
    7. チューブを磁石の上に置き、溶液が透明になるまで待ちます。上清を新しいFACSチューブに移します。
    8. ビーズを500μLのPBSで洗浄します。
    9. チューブを磁石の上に置き、溶液が透明になるまで待ちます。
    10. 上清を新しいFACSチューブに移します。
    11. 400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  4. FACSの染色
    1. マウス1匹あたり300 μLの抗体ミックスを冷たいPBS(4°C)で調製します。
    2. 幹細胞/前駆細胞用抗体ミックス: 造血幹細胞: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000)、c-Kit - PE(1:1000)、Sca1 - APC-Cy7(1:500)、CD48 - BV421(1:1000)、CD150 - BV605(1:300)
    3. 細胞を暗所で4°Cで40分間インキュベートします。
    4. 1 mLの冷たいPBS(4°C)で洗浄します。400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    5. 細胞ペレットを1 mLのFACS再懸濁バッファーに再懸濁し、フィルターキャップFACSチューブで細胞をろ過します。

4. FACSソーティング

  1. セルソーターを設定します。
    1. 70μmのノズルチップを挿入します。405 nm、488 nm、561 nm、633 nmレーザーを活性化します。
    2. ソートモードを 4ウェイに設定 純度:降伏マスク0、純度マスク32、位相マスク0
    3. ドロップ周波数を90,400Hzに設定し、メーカーの指示に従って振幅とドロップ遅延を調整します。プレート電圧を5000Vに設定します。
    4. 仕分けゲートは、製造元の指示に従って定義します。
      1. すべての細胞タイプについて、まず前方散乱および側方散乱シグナルに基づいて単一細胞を選択し、次に細胞タイプ特異的な染色に基づいて選択します。
      2. B細胞の場合は、AF647陽性、PE陰性の集団を選択します。
      3. T細胞の場合は、PE陽性、AF647陰性の集団を選択します。
      4. 造血幹細胞の場合は、PE-Cy7-low、PE陽性、APC-Cy7陽性、BV605陽性、BV421陰性の集団を選択します。
      5. MPPの場合、PE-Cy7-low、PE陽性、APC-Cy7陽性、BV421陽性、BV605陰性の母集団を選択します。
      6. 破片サンプルの場合、前方散乱および側方散乱の信号に基づいて、無傷の細胞を表すには小さすぎるイベントを選択します。これらのゲーティング戦略を示す典型的なFACSプロットを 図2 と 図3に示します。
    5. 流量を調整して、15,000 イベント/秒未満にします。
  2. コレクションプレートを準備する
    1. 酵母抽出物ストック溶液の調製: 13C酵母抽出物1アリコートを7.5 mLの超高純度H2Oおよび2.5 mLのメタノールに再懸濁します。
    2. 抽出バッファーの調製:10 μLの 13C酵母抽出原液を10 mLのアセトニトリルに加え、混合します。
    3. コレクションプレートの調製:サンプルの収集に使用する 96 ウェル PCR プレートの各ウェルに 25 μL の抽出バッファーを添加します。蒸発を最小限に抑えるには、ウェルをPCRリッド(ストライプをシングレットにカットしたもの)で覆います。
  3. セルの並べ替えを実行します。
    1. 必要に応じて収集ウェルを開いて選別された細胞を収集し、蒸発を最小限に抑えるためにできるだけ早く閉じます。
  4. サンプルをすぐに測定できない場合は、密閉容器に入れて-80°Cで数日間保管してください。融解後、サンプルを5分間超音波処理して、代謝物が完全に再懸濁されるようにします。

5. LC-QQQ-MS測定

  1. LC 溶媒の調製
    1. メドロン酸ストック溶液(100 mM)を調製する:17.6 mgのメドロン酸を1 mLの超高純度H2Oに溶解する。
    2. 緩衝液Aの調製:1.92gの炭酸アンモニウムを1Lの超高純度H2Oに溶解し、50μLのメドロン酸ストック溶液を添加する。
    3. バッファー B の調製:バッファー 50 mL とアセトニトリル 450 mL を混合します。
    4. LC テストミックスの調製:ロイシン、イソロイシン、AMP、ADP、ATP をそれぞれ 1 ppm を 80:20 アセトニトリル(超高純度 H2O)で混合します。
      注:メドロン酸ストックは、-20°Cで数か月間保存できます。他のバッファーは RT で 2 日間保持できます。
  2. プログラム LC-QQQ-MS メソッド
    1. 化合物固有のMS設定(衝突エネルギーなど)をメーカーの指示に従って最適化します。Agilent 6495シリーズ機器の場合は、 補足表1の設定を使用します。
    2. メーカーの指示に従って、ソース固有のMS設定を最適化します。JetStream加熱ESIソースを使用する装置では、ガス温度:240°C、ガス流量:15L/min、ネブライザー:50psi、シースガス温度:400°C、シースガス流量:11L/min、キャピラリー電圧:2000V、ノズル電圧:300Vを使用します。
    3. イオン移動光学系の設定は、メーカーの指示に従って最適化してください。iFunnelイオン光学系を備えたAgilent機器の場合、次のパラメータを使用します:高圧RF正:110 V、高圧RF負:90 V、低圧RF正:80 V、低圧RF負:60 V。
    4. LC グラジエントをプログラムします:0 分、95% B、150 μL/分。18分、55%B、150μL/分;19分、30%B、150μL/分;21.5分、30%B、150μL/分;22分、95%B、150μL/分;22.7分、95%B、200μL/分、23.5分、95%B、400μL/分;停止時間28分。カラム温度:35°C。
  3. LC-MS装置をセットアップします。
    1. クロマトグラフィーカラムを温度制御されたカラムコンパートメントに接続します。
    2. バッファを接続し、すべての行をパージします。
    3. 少なくとも 4 つのブランクサンプルまたはプールサンプルを実行して、カラムを平衡化します。
  4. LC テストミックスを実行して、クロマトグラフィー性能を確認します。次の条件が満たされていることを確認します。そうでない場合は、サンプルを実行する前に、機器のクリーニングまたはトラブルシューティングを行ってください。
    1. 初期背圧が<150 bar、最大背圧が<400 barであることを確認します。
    2. 保持時間が ±1 分で、イソロイシン 6.0 分、ロイシン 6.4 分、AMP 9.5 分、ADP 11.2 分、ATP 12.7 分であることを確認します。
    3. +132->86 遷移におけるロイシンとイソロイシンの間の谷間がピーク高さの 20% <になるようにします。
    4. AMP と ADP の保持時間の差が 1.5 〜 1.9 分で、ADP と ATP の保持時間の差が 1.1 〜 1.9 分であることを確認します。
  5. ワークリストの設定
    1. LC テストミックスからのキャリーオーバーを最小限に抑えるために、ブランクサンプルから始めます。
    2. サンプルをランダムな順序で実行します。
    3. 最後にブランクサンプルで、将来の実験のためにカラムを洗浄します。

6. automRmでのデータ前処理

注: 次の手順では、msconvert での .d から .mzML への変換、metabdb の準備、データとモデルと metabdb の読み込み、および手動ピーク レビューの一般的な戦略について説明します。

  1. ProteoWizard20 を使用して、バイナリエンコード精度:32 ビット、MS レベル 1-2、 書き込みインデックス を選択、 zlib 圧縮を使用 を選択。
  2. R を起動します。
  3. パッケージのドキュメントに従ってautomRm 21 をインストールします(最初に使用する前に一度だけ必要です)。
  4. RでautomRm GUIを起動します:automRm :: automrm_gui()
  5. [処理] タブで .d ファイルのバッチを処理し >バッチを処理します。
    1. 代謝物情報を保持し.xlsxファイルを選択します。このファイルは、LC-QQQ-MS メソッドと一致する必要があります。
    2. 選ぶ。ピークピッキングMLモデルを保持するRDataファイル。
    3. 選ぶ。RData ファイルには、ピーク レポート ML モデルが保持されています。
    4. .mzMLファイルを含むプロジェクトフォルダを選択します。
    5. [ バッチ処理] をクリックして、データの前処理を開始します。
  6. 前処理が終了したら、peakoverview.pdfを開いてクロマトグラフィーピークが正しく検出されることを確認します。オプションで、automRm GUIのReviewタブからautomRmdata_Review.RDataをロードし、ピークフィルタリングとピーク積分を手動で変更します。
  7. プロジェクトフォルダから peakinfo.xlsx を開き、データを確認します。
    1. タブ13CAreaの13C内部標準信号を確認してください:実験グループ間および細胞サンプルとデブリサンプル間の強度値に系統的な違いがないことを確認します。このような違いが存在する場合は、その後の分析には NormArea タブまたは NormHeight タブのデータのみを使用します。それ以外の場合は、[RawArea] タブまたは [RawHeight] タブのデータを使用します。
    2. 内部標準ATAおよびCLFの信号強度を タブRawAreaで確認します。実験グループ間でいずれかの化合物の強度に系統的な違いがないことを確認してください。
    3. 各代謝物について、細胞を含むサンプルのシグナル強度を、同じ細胞懸濁液由来のデブリサンプルと比較します。適切な統計的検定を使用して、細胞を含むサンプルがデブリサンプルよりも強度が高い代謝物を同定します。このテストに合格した代謝物のみを、その後のデータ分析に含めます。

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Representative Results

FACSソーティングにより、同じ細胞懸濁液から異なる細胞タイプのクリーンな集団を単離することができます(図2 および 図3)。この方法の特異性は、特定の表面マーカー(例えば、脾臓からのB細胞とT細胞)または表面マーカーの特定の組み合わせ(例えば、造血幹細胞とMPP)による異なる細胞タイプの染色に依存します。細胞内マーカーの染色には、通常、細胞膜の透過処理が必要です。これにより代謝産物の漏出が発生する可能性があるため、このタイプの染色はこのプロトコルでの使用には適していません。

LCは、MSによる検出前に代謝物を分離します(図4)。代謝物は極性によってほぼ選別された HILIC カラムから溶出し、極性の低い化合物は早期に溶出し、極性の高い代謝物は後に溶出します。シグナル強度は、サンプル中の標的代謝物の量と代謝物特異的応答因子によって決定されます。その結果、シグナル強度を代謝物間で有意に比較することはできず、サンプル間での1つの代謝物についてのみ比較できます。 図 4 で強調表示されている 3 つのピークは、1:ナイアシンアミドはレベルは異なりますが、破片と細胞抽出物の両方で検出される、2:細胞抽出物でほぼ独占的に検出されるアセチルカルニチン、3:破片サンプルと細胞抽出物で同じレベルで検出される内部標準アミノレファタリン酸を表しています。

同じ組織由来の細胞タイプ間の代謝の違いは、組み合わせたFACS-LC-MSプロトコルを使用して保持されます(図5)。造血幹細胞とMPPでは、6匹のマウスの細胞で6つのサンプルを生成する必要があり、同じマウスの脾臓から選別されたB細胞とT細胞と比較して、各グループ内のばらつきが大きくなりました。プロセスブランクコントロールサンプルを表すデブリサンプルは、細胞抽出物を含むサンプルから明確に分離されます。デブリサンプル内では、2つの実験が明確に分離されているのがわかり、選別前に細胞が経験する代謝環境の違いが強調されています。クラスター化されたヒートマップ(図 6)で表すと、サンプル間の代謝物の相対レベルなどの追加情報が表示されます。

Figure 1
図1:提示されたプロトコルの主要なステップの概要。 この図はシェーンベルガーらの許可を得て転載したものである12。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:脾臓からのB細胞およびT細胞の純粋な集団の分離。 細胞およびデブリイベントは、前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)シグナルに基づいて選択されました。B細胞およびT細胞は、細胞タイプ特異的な染色シグナルに基づいて選択しました。この図はシェーンベルガーらの許可を得て改作したものである12。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:骨髄からのHSCとMPPの分離。 細胞およびデブリイベントは、前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)シグナルに基づいて選択されました。HSCおよびMPP集団は、細胞タイプ特異的な染色シグナルの複数の段階に基づいて選択されました。この図はシェーンベルガーらの許可を得て改作したものである12。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:クロマトグラムの例。 (A)5000のHSCと(B)5000のデブリイベントを含むサンプル。軸は両方のパネルで同じスケールを共有していることに注意してください。強調表示された代謝物は、1:ニコチンアミド、2:アセチルカルニチン、3:アミノテレフタル酸(ATA)です。. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:異なる細胞タイプの代謝プロファイルの主成分分析(PCA)と、同じ実験からのデブリバックグラウンドサンプル。 異なる臓器とあらゆる臓器からの破片バックグラウンドサンプルの間に大きな分離が観察されます。また、各臓器の細胞内では細胞の種類がはっきりと分かれています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:異なる細胞タイプで測定された代謝物と、一致するバックグラウンドコントロールサンプル(デブリ)を表すヒートマップ。 欠損値は、すべてのサンプルで同じ代謝物の半値に代入されました。プロットでは、データは各行で個別に最大値に正規化されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足表 1:この表には、保持時間(RT)、極性(Pol)、プリカーサー m/z(Q1)、フラグメント m/z(Q3)、衝突エネルギー(CE)など、選択した代謝物の化合物固有の設定がリストされています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルを使用してターゲットメタボロミクスを成功裏に実施するための最も重要なステップは、1)クリーンな細胞集団をもたらす堅牢な染色およびゲーティング戦略、2)液体量の正確な取り扱い、3)すべての実験ステップ、特に代謝物抽出前のすべてのステップの再現性のあるタイミングです。理想的には、1つの実験に属するすべてのサンプルを1つのバッチで処理および測定して、バッチの影響を最小限に抑える必要があります22。大規模な実験では、-80°Cで細胞抽出物を採取し、すべての抽出物を1回のバッチで測定することをお勧めします。

低インプットサンプルを扱う場合、実験の過程で使用されるすべての材料をきれいに取り扱うことを強調する必要があります23。一般的な汚染は、残留バッファー、洗剤、スキンケア製品です。コンタミネーションを最小限に抑えるための最も重要な対策は、実験全体を通して適切な手袋を使用することです。

細胞が非生理学的条件にさらされることによる代謝物組成の変化を最小限に抑えるには、氷上でサンプルを調製し、低温試薬(4°C)で調製することが重要です。また、FACSステップの前にできるだけ速くすることで、測定の質が向上します2。抗体染色の指示時間は、良好な染色効率を得るために妥当なほど短くします。Fcブロック抗体を用いてFc受容体への抗体の非特異的結合を阻害する追加のステップは、FACS染色手順の前に追加することができる24,25。これにより、標的細胞集団のコンタミネーションが防止され、多くのFc受容体高細胞タイプ(単球やマクロファージなど)を含む細胞懸濁液や、血清なしで培養した細胞を扱う場合に特にお勧めします。ただし、全体的な処理時間が10〜15分増加するため、結果に非生理学的変動性が加わる可能性があります。

最新の質量分析計で動的 MRM 分析法を使用することで、化合物特異的な設定にリストされているすべての代謝物を 1 回の注入で記録できます。標的代謝物の数を制限することで、従来の質量分析計で記載されたプロトコルを実装でき、データの前処理とデータ解析が迅速化されます。

LC-MS データには、ある程度のバックグラウンドシグナルが混入することは避けられません。したがって、バックグラウンド上で検出できる代謝物を特定するには、細心の注意を払う必要があります。無傷の細胞(破片)を表すには小さすぎるイベントをソートすると、マトリックス依存のバックグラウンドシグナル強度を表す関連するプロセスブランクサンプルが生成されます。さらに、内部標準により、さらなるデータ分析から除外すべき問題のあるサンプルを特定できます26。どちらの品質保証尺度も、十分な数の反復が利用可能な場合に最も効果的です。グループごとに少なくとも 6 回の反復を使用することをお勧めします。

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Disclosures

著者は利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgments

著者らは、この研究で使用した動物を提供してくれたマックス・プランク免疫生物学・エピジェネティクス研究所の動物施設に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

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References

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免疫学と感染症、第204号、
希少初代細胞のターゲットメタボロミクス
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Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

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