Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65938
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 4, 1,2, 1,2,5, 2
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذجا يمكن الاعتماد عليه وفعالا في المختبر لحاجز الدم في الدماغ. تستخدم الطريقة الخلايا البطانية الوعائية الدماغية للفأر bEnd.3 وتقيس المقاومة الكهربائية عبر الغشاء.

Abstract

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو هيكل فسيولوجي ديناميكي يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والخلايا النجمية والخلايا المحيطة. من خلال تنسيق التفاعل بين العبور المقيد للمواد الضارة ، وامتصاص المغذيات ، وإزالة المستقلب في الدماغ ، فإن BBB ضروري في الحفاظ على توازن الجهاز العصبي المركزي. يعد بناء نماذج في المختبر من BBB أداة قيمة لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات العصبية وإنشاء علاجات دوائية. تصف هذه الدراسة إجراء لإنشاء نموذج خلية BBB أحادي الطبقة في المختبر عن طريق زرع خلايا bEnd.3 في الغرفة العلوية لصفيحة 24 بئرا. لتقييم سلامة وظيفة حاجز الخلية ، تم استخدام مقياس الفولتميتر الخلوي الظهاري التقليدي لتسجيل المقاومة الكهربائية عبر الغشاء للخلايا الطبيعية وخلايا نقص الأكسجين التي يسببها CoCl2 في الوقت الفعلي. نتوقع أن توفر التجارب المذكورة أعلاه أفكارا فعالة لإنشاء نماذج في المختبر من BBB والأدوية لعلاج اضطرابات أمراض الجهاز العصبي المركزي.

Introduction

BBB هي واجهة بيولوجية فريدة بين الدورة الدموية والأنسجة العصبية ، والتي تتكون من الخلايا البطانية الوعائية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا النجمية ، والخلايا العصبية ، والهياكل الخلويةالأخرى 1. يتم تنظيم تدفق الأيونات والمواد الكيميائية والخلايا بين الدم والدماغ بشكل صارم بواسطة هذا الحاجز. يحمي هذا التوازن الأنسجة العصبية من السموم ومسببات الأمراض مع تمكين التشغيل المناسب لأعصاب الدماغ 2,3. يمكن أن يؤدي الحفاظ على سلامة BBB إلى منع تطور وتطور الاضطرابات التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي بشكل فعال ، مثل الخلل الوظيفي العصبي والوذمة والالتهاب العصبي4. ومع ذلك ، فإن الخصائص الفسيولوجية الفريدة ل BBB تمنع أكثر من 98٪ من الأدوية الجزيئية الصغيرة و 100٪ من الأدوية الجزيئية من دخول الجهاز العصبي المركزي5. لذلك ، فإن زيادة تغلغل الأدوية من خلال BBB أثناء تطوير الأدوية للجهاز العصبي المركزي أمر ضروري لتحقيق الفعالية العلاجية 6,7. على الرغم من أن فحص المحاكاة الحاسوبية للركائز قد زاد بشكل كبير من احتمال عبور الأدوية المرشحة ل BBB ، إلا أنه لا تزال هناك حاجة إلى نماذج BBB موثوقة وبأسعار معقولة في المختبر / في الجسم الحي لتلبية احتياجات البحث العلمي8.

تقنية سريعة وبأسعار معقولة لفحص الأدوية عالية الإنتاجية هي النموذج9 في المختبر. لإلقاء الضوء على العمليات الأساسية لتأثيرات الأدوية على وظيفة BBB ودورها في تطور المرض وتطوره ، تم إنشاء سلسلة من نماذج BBB المبسطة في المختبر. في الوقت الحاضر ، نماذج BBB الشائعة في المختبر هي النماذج أحادية الطبقة ، والثقافة المشتركة ، والديناميكية ، والموائع الدقيقة10،11،12 ، التي شيدتها الخلايا البطانية الوعائية والخلايا النجمية ، أو الخلايا المحيطة ، أو الخلايا الدبقية الصغيرة13،14. على الرغم من أن ثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد تتماشى بشكل أكبر مع التركيب الفسيولوجي ل BBB15 ، إلا أن تطبيقها كوسيلة لفحص الأدوية ل BBB لا يزال مقيدا بتصميمها المعقد واستنساخها دون المستوى. في المقابل ، فإن نموذج الطبقة الأحادية في المختبر هو النموذج الأكثر استخداما للبحث في BBB وهو قابل للتطبيق لتحديد تعبير ناقلات الغشاء وبروتينات الوصلة الضيقة في خلايا معينة.

قياس المقاومة الكهربائية عبر الغشاء (TEER) هو تقنية لتقييم ومراقبة طبقة الخلايا عبر المقاومة وتقييم سلامة الخلية ونفاذية الحاجز. من خلال إدخال قطبين كهربائيين في وقت واحد في وسط النمو أو محلول المخزن المؤقت على جانبي الطبقة الأحادية ، من الممكن قياس التيار المتردد أو المعاوقة الكهربائية من خلال الطبقة المدمجة للخلية16,17. من أجل تحديد ما إذا كان نموذج BBB في المختبر قد تم إنشاؤه بشكل صحيح ، سيتم استخدام قياس TEER عادة كمعيار ذهبي18. من ناحية أخرى ، يمكن التنبؤ بدقة باتجاه عمل الدواء على نفاذية BBB عن طريق قياس التغير في المقاومة الكهربائية لطبقة الخلية بعد إصابة الدواء19. على سبيل المثال ، اكتشف Feng et al. أن catalpol (المونومر النشط الأساسي ل rehmanniae) يمكن أن يعكس بشكل فعال التنظيم السفلي الناجم عن عديد السكاريد الشحمي لبروتينات الوصلات الضيقة في BBB ويرفع قيمة TEER لطبقة الخلايا البطانية لدماغ الفأر20.

عادة ما تكون الاستجابة الالتهابية العصبية هي السبب الرئيسي لاختلال توازن BBB21. علاج نقص الأكسجين للحث على إصابة التهاب الأعصاب هو الطريقة الرئيسية لتدمير الحاجز الدموي الدماغي ، بما في ذلك الطرق الفيزيائية وطرق الكاشف الكيميائي. يستخدم الأول في المقام الأول حاضنة ثلاثية الغازات لتغيير محتوى الأكسجين في بيئة نمو الخلايا لمحاكاة ظروف نقص الأكسجين22 ، بينما يتم تحقيق الأخير عن طريق إدخال كواشف deoxy بشكل مصطنع مثل CoCl2 إلى وسط زراعة الخلايا23. ستبقى الخلايا في حالة غير مؤكسجة إذا تم استبدال Fe2+ ب Co2+ في الهيم. إذا تم استبدال Fe2+ ب Co2+ في المجموعة التحفيزية ، تثبيط نشاط هيدروكسيلاز البرولين وهيدروكسيلاز الأسبارتات ، مما يؤدي إلى تراكم العامل المحرض لنقص الأكسجة -1α (HIF-1α)24. في ظل نقص الأكسجة المستمر ، يؤدي نزع الفسفرة من HIF-1α في السيتوبلازم إلى موت الخلايا وينشط عامل نمو بطانة الأوعية الدموية ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية. في الدراسات السابقة25،26 ، ثبت جيدا أن نقص الأكسجة يمكن أن يقلل بشكل كبير من التعبير عن بروتينات الوصلات الضيقة البطانية لزيادة نفاذية BBB. في هذه الدراسة ، تم قياس منحنى مقاومة الوقت لخلايا bEnd.3 المصنفة في 24 لوحة بئر من أجل إنشاء نموذج BBB مباشر. باستخدام هذا النموذج ، قمنا بتمييز التغييرات في TEER الخلوي بعد تدخل CoCl2 من أجل بناء نموذج خلية يمكن استخدامه لفحص الأدوية لحماية BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تلقيح الخلايا البطانية المشتقة من دماغ الفأر.3 (bEnd.3) في غرف صفيحة 24 بئرا لبناء نموذج بسيط في المختبر من BBB في ظل ظروف متوسطة محددة. تم قياس TEER للخلايا الطبيعية وخلايا نقص الأكسجين بواسطة مقياس TEER (الشكل 1 والشكل 2).

1. إعداد الحل

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا DMEM الذي يحتوي على FBS (10٪ ، v / v) ، 100 U / mL البنسلين ، و 10 ملغ / مل من الستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد محلول مخزون 100 mM CoCl2 بإضافة 1.30 مجم CoCl2 إلى 100 ميكرولتر محلول DMSO.
    ملاحظة: تم تخزين جميع المحاليل المذكورة أعلاه في حالة 4 درجات مئوية ، وتم تخفيف محلول المخزون وفقا للتركيز المطلوب قبل الاستخدام.
  3. تحضير 5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم (v / v) بإضافة 2 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم إلى 38 مل من الماء المقطر المزدوج.

2. زراعة الخلايا وصلاحية الخلية

  1. بذرة 1 مل من خلايا bEnd.3 في طبق الاستزراع (100 مم) المحتوي على وسط DMEM بكثافة 1 × 106 خلايا / مل والاستزراع عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2. قم بتغيير الوسط كل 2 إلى 3 أيام واستزراع الخلايا 2x في الأسبوع.
  2. بعد أن تنمو خلايا bEnd.3 إلى التقاء 80٪ ، قم بهضم الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين لمدة 30 ثانية.
  3. قم بعمل تعليق لخلايا bEnd.3 بكثافة 7 × 104 خلايا / مل باستخدام وسط DMEM من خلال عداد خلية. ثم ، قم بزرع 100 ميكرولتر من معلق خلية bEnd.3 في لوحة 96 بئرا.
  4. بعد التصاق الخلية ، قم بتنظيف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني واستزرع الخلايا ب 100 ميكرولتر من وسط الثقافة أو الوسط المحتوي على الدواء (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، 300 ميكرومتر ، 400 ميكرومتر ، 500 ميكرومتر CoCl2) لمدة 24 ساعة في ظل نفس الظروف. بعد إزالة الوسط داخل لوحة البئر وتنظيفه باستخدام PBS ، أضف 100 ميكرولتر من محلول CCK-8.
    ملاحظة: لا تولد فقاعات في البئر ، مما سيؤثر على قيم الكثافة الضوئية (OD).
  5. ضع 96 صفيحة بئر في بيئة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 1 ساعة. قم بقياس امتصاص ألواح 96 بئرا عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة.
    ملاحظة: لتجنب الاختلافات داخل المجموعة ، تم تبريد ألواح البئر إلى درجة حرارة الغرفة قبل اكتشافها.
  6. احسب صلاحية الخلية الناتجة عن تركيزات مختلفة من CoCl2 وفقا للصيغة [OD Drug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] × 100٪. حدد تركيز CoCl2 مع اختلاف كبير في تقليل صلاحية الخلية مقارنة بالمجموعة الضابطة للتجربة التالية.

3. تجميع النموذج

  1. شطف الغرفة العلوية من لوحات 24 بئر مع PBS.
    ملاحظة: نمت الخلايا واندمجت في الجزء السفلي من الغرفة العلوية للوحة المكونة من 24 بئرا ، وتشكلت تقاطعات ضيقة بين الخلايا تدريجيا لتلعب دورا حاجزا. إذا كانت الخلايا البطانية المستخدمة في بعض الدراسات غير قادرة على تشكيل حاجز كامل على أغشية PET بشكل مستقل ، فإن طلاء الأغشية بمحلول الكولاجين الوريدي مطلوب قبل تلقيح الخلايا.
  2. امزج خلايا bEnd.3 مع وسط DMEM لعمل تعليق بكثافة 5 × 105 خلايا / مل باستخدام خلاط دوامة. بعد ذلك ، قم بزرع 200 ميكرولتر من تعليق خلية bEnd.3 على غشاء PET في الغرفة العلوية للوحة 24 بئرا (0.33 سم2 ، حجم مسام الغشاء 0.4 ميكرومتر).
    ملاحظة: لم تجد الدراسة التجريبية لهذا البروتوكول أي اختلاف في النتائج عند استخدام 5 إلى 10 مقاطع من خلايا bEnd.3 للتجارب. لضمان احتمال نجاح النمذجة ، يرجى الرجوع إلى الفاصل الزمني لرقم الخلية لهذا البروتوكول.
  3. أضف 1200 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الغرفة السفلية للوحة للتأكد من أن الضغط الاسموزي للغرف العلوية والسفلية يميل إلى الاستقرار. هناك اختلافات في حجم الوسيط المضاف حسب النوع ؛ تأكد من أن مستوى السائل في الغرف العلوية والسفلية متدفق.
  4. قم بتغيير وسيط الغرفة العلوية والغرفة السفلية في وقت محدد كل يوم ومراقبة قيمة المقاومة في نفس الوقت.
    1. عند تغيير الوسط ، ستتلف سلامة طبقة الخلية بسبب اللمس الاصطناعي أو الحركة المفرطة. لتجنب الموقف أعلاه ، قم بإزالة الوسط القديم ببطء من جانب واحد باستخدام ماصة ضغط سلبي وأضف ببطء وسيطا جديدا على طول الجدار أثناء تبادل السوائل.

4. قياس TEER

  1. قبل بدء العمل ، ضع المقاوم ، محلول هيبوكلوريت الصوديوم 5٪ ، 75٪ إيثانول ، ومحلول ماء مقطر مزدوج في طاولة فائقة التنظيف. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة للقضاء على البكتيريا المتبقية ومسببات الأمراض.
  2. ضع الأقطاب الكهربائية في محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 5٪ مع اهتزاز بطيء لمدة 3 إلى 5 ثوان ، ثم اغمر في 75٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، انقله إلى PBS أو محلول الماء المقطر المزدوج حتى الاستخدام.
  3. قم بتشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من مقياس مقاومة الخلية ، وانقر فوق حدد اللوحة وفقا للمعلمات الواردة في الجدول 1 ، وحدد لوحة 24 بئرا.
  4. وفقا لاحتياجات العملية ، حدد تسلسل الكشف المناسب. اخترنا الإجراء A1 في هذه الدراسة.
  5. أدخل المقاوم kΩ في القابس الأيمن لمعايرة الجهاز. إذا كانت نتيجة المعايرة 1000 ± 5 Ω ، فاعتبر دقة الجهاز طبيعية.
    1. إذا لم تكن نتيجة المعايرة 1000 Ω ، فانقر فوق وحدات الوضع على الواجهة الرئيسية لتحديد OHMS ، ثم انقر فوق معايرة على الشاشة الرئيسية لإعادة معايرة الجهاز.
  6. اسحب المقاوم kΩ على الجانب الأيمن واستبدل قطب القياس بسلك توصيل.
  7. ضع القطب في لوحة 24 بئرا دون زرع الخلايا عموديا وانقر فوق معالجة فارغة على الشاشة الرئيسية للأداة. تبلغ قيمة الخلفية لمقاومة اللوحة بدون خلايا البذور حوالي 134.4 Ω.
  8. أدخل القطبين في الغرفتين العلوية والسفلية للوحة المصنفة بخلايا بحيث تكون طبقة الخلية بينهما ، ثم سجل قيمة المقاومة عن طريق الضغط برفق على الدواسة.
    1. تأكد من أن القطب لا يلمس الخلايا الموجودة في الغرفة العلوية وأسفل الغرفة السفلية. لا يؤثر وقت نقع القطب في المحلول على قيمة المقاومة ، ومن الضروري فقط التأكد من أن القطب في الموضع الصحيح.
  9. احصل على قيم TEER (Ωcm2) بضرب قيم المقاومة الكهربائية (أوم) في المساحة السفلية (سم2) من الغرفة العلوية ، كما في المعادلة:
    TEER (Ωcm2) = المقاومة (Ω) ×S إدراج (سم2)
  10. ارسم مخططا خطيا ل TEER-Time (بالأيام). عندما لا تزداد قيمة المقاومة مع مرور الوقت (تقاس على مدار أيام) ، ضع في اعتبارك أن الخلية شكلت حاجزا.
    NOTW: سيتم بناء نموذج BBB أحادي الطبقة لخلايا bEnd.3 بنجاح عن طريق زراعة خلايا bEND.3 مع المعلمات في هذه الدراسة لمدة 6 أيام تقريبا. تراوح TEER لنموذج الخلية أحادية الطبقة bEnd.3 من 16.49 ± 2.12 Ωcm2 إلى 27.59 ± 1.50 Ωcm2 في غضون 6 أيام (n = 8 ، متوسط ± SD).

5. تدمير الحاجز والتحليل الإحصائي

  1. وفقا لمنحنى TEER - الزمني ، حدد الآبار ذات وظيفة الحاجز وقسمها إلى مجموعة التحكم ومجموعة CoCl2 (n = 4).
  2. أضف وسط الاستزراع ووسط الاستزراع الذي يحتوي على 300 ميكرومتر CoCl2 (200 ميكرولتر) إلى المجموعة الضابطة والغرفة العلوية لمجموعة CoCl2 ، على التوالي.
  3. الكشف عن قيم المقاومة لمجموعات التحكم و CoCl2 عند 12 ساعة و 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية باستخدام الإجراء الموضح في الخطوة 4.
  4. استخدم البرامج التجارية لرسم خريطة لاتجاه قيم TEER لحاجز الخلايا المستزرعة مع أو بدون 300 μM CoCl2.
  5. استخدم برنامج التحليل الإحصائي لتحليل الفرق في قيم المقاومة بين الخلايا المعالجة ب CoCl2 والخلايا الطبيعية (n = 4 ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p <0.001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سمح هذا البروتوكول بتسجيل التغييرات في قيم مقاومة الخلايا وفقا للمعايير المحددة في مقياس المقاوم عبر البطانة. تم فحص صلاحية خلايا bEnd.3 (عدد الخلايا الحية) المعالجة بتركيزات مختلفة من CoCl2 بواسطة مقايسة CCK-8. تم تمثيل تلف الخلايا الأكبر الناتج عن CoCl2 من خلال انخفاض صلاحية الخلية. وجدنا أن 300 ميكرومتر من CoCl2 كانت سامة للخلايا بشكل كبير في المختبر ، وتم استخدام هذا التركيز في التجارب التالية (الشكل 3A). من خلال مراقبة تغيرات مقاومة النمو في bEnd.3 ، وجدنا أن قيم TEER للخلية بدأت في الاستقرارفي اليوم الخامس. أدت إصابة نقص الأكسجين الناتجة عن إضافة 300 ميكرومتر CoCl2 إلى الغرفة العلوية للوحةفي اليوم السادس إلى انخفاض كبير في قيم TEER مقارنة بالتحكم في كل من النقاط الزمنية 12 h و 24 h (الشكل 3B). يمكن تقييم وظيفة حاجز الخلية بشكل غير مباشر من خلال قيمة TEER ، ويشير الانخفاض في قيمة TEER إلى انهيار حاجز الخلية. انخفضت قيمة TEER لمجموعة 300 μM CoCl2 مقارنة بمجموعة التحكم بعد الحضانة لمدة 24 ساعة (الشكل 3C). أظهر البحث المذكور أعلاه أن الضرر الذي يلحق بنموذج BBB في المختبر يمكن أن يكون ناتجا عن بيئة نقص الأكسجين التي تسببها CoCl2.

Figure 1
الشكل 1: أدوات وملحقات لقياس TEER. (أ-ب) واجهة التشغيل الرئيسية لمقياس TEER. (ج-د) لوحة 24 بئر. ه: المحلول المطلوب لتنظيف الأقطاب الكهربائية وتطهيرها. (F) المقاومة القياسية مطلوبة لمعايرة مقياس TEER. (ع-ح) القطب والتكبير المحلي. (ط) تم استخدام دواسة القدم لجمع البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخططات انسيابية للمقاومة عبر الغشاء لخلايا bEnd.3 المسجلة باستخدام مقياس المقاومة عبر البطانة. أ: زراعة الخلايا. (ب) زرعت خلايا bEnd.3 في الحجرة العلوية للصفائح ، وتشكل حاجز خلوي كثيف عن طريق ملء صفائح البئر بوسط لدعم نموها وتمايزها. (ج) تم تقييم السلامة الوظيفية للحاجز الحاجز للخلايا من خلال مراقبة TEER. (د) استخدم كلوريد الصوديوم2 لمحاكاة بيئة نقص الأكسجين للحث على ضعف وظيفة حاجز الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يحافظ Salidroside على سلامة وظيفة الحاجز الواقي لخلايا bEnd.3 عن طريق التخفيف من إصابة نقص الأكسجين التي يسببها CoCl2. (أ) تأثير CoCl2 (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، 300 ميكرومتر ، 400 ميكرومتر ، 500 ميكرومتر) على صلاحية خلايا bEnd.3 (n = 6 ، مجموعة CoCl2 مقابل المجموعة الضابطة ***p<0.001 ، متوسط ± SD). (ب) مخطط التغيرات في قيم TEER لخلايا bEnd.3 المعالجة بوسط عادي أو 300 ميكرومتر CoCl2 (ن = 4 ، اليوم 1 مقابل اليوم 2-6: # #p<0.01 ، # # #p< 0.001 ، اليوم 6 مقابل اليوم 6.5 - 7: ** p < 0.01 ، متوسط ± SD). (C) تغيرات TEER للخلايا بعد إصابة نقص الأكسجين لمدة 24 ساعة (n = 4 ، مجموعة CoCl2 مقابل المجموعة الضابطة ***p <0.001 ، متوسط ± SD). تم إجراء اختبار ANOVA و Tukey أحادي الاتجاه ، واعتبر p<0.05 مهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البارامترات خيار
اختر اللوحة 24-بئر
ترتيب الكشف أ 1
وحدات الوضع Ω
المقاومة القياسية 1 كيلو أوم

الجدول 1: تعيين معلمات مقياس TEER. إعدادات المعلمات واختيار البرنامج للأداة مطلوبة للكشف عن مقاومة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أحد أكثر أعضاء الجسم تطورا ، يتحكم الدماغ في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية المعقدة ، بما في ذلك الذاكرة والإدراك والسمع والشم والحركة27. الدماغ هو واحد من أكثر أعضاء جسم الإنسان تعقيدا ومرضا في نفس الوقت. يظهر حدوث العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي ميلا متزايدا عاما بعد عام بسبب عوامل تشمل تلوث الهواء وأنماط الأكل غير المنتظمة وعوامل أخرى27،28،29. من المثير للاهتمام أن بداية وتطور بعض أمراض الجهاز العصبي المركزي ، مثل السكتة الدماغية والصرع ومرض الزهايمر (AD) ، ترتبط ارتباطا وثيقا بنمو BBB30،31،32. قد يكون المفهوم الأساسي لعلاج غالبية الاضطرابات ذات الخلل الوظيفي في الدماغ هو إنشاء علاجات أو أدوية جديدة للحفاظ على التوازن الوظيفي BBB. لسوء الحظ ، لا يمكن لمعظم الأدوية الدخول إلى حمة الدماغ لأداء وظائفها الحيوية بسبب كره الماء ل BBB وطريقة النقل المذاب الفريدة14,33. لزيادة احتمالية نجاح الدواء ، إنها استراتيجية جيدة لإنشاء نماذج BBB جديدة يمكن استخدامها للفحص الجزيئي عالي الإنتاجية.

نظرا للهيكل المعقد للوحدة الوعائية العصبية ، فإن النموذج في الجسم الحي لديه نظريا درجة أعلى من نمذجة بنية BBB. ومع ذلك ، نظرا لتقييد التماثل بين والبشر ، قد تؤدي الفروق في ناقلات BBB إلى عدم وجود فحص للأدوية النتيجة المتوقعة34. على العكس من ذلك ، توفر النماذج في المختبر مزايا كونها غير مكلفة ، ولديها دورة كشف سريعة ، والقدرة على استخدامها للفحص عالي الإنتاجية ، والتي يمكن أن تخدم بشكل أفضل أهداف أبحاث الأمراض العصبية. مع تطور العلوم والتكنولوجيا ، يتم إنشاء وتعزيز المزيد والمزيد من النماذج المختبرية التي تشبه إلى حد كبير التركيب الفسيولوجي ل BBB. بالإضافة إلى التمييز بين تقنيات المحاكاة للمنصات الثابتة والديناميكية ، هناك اختلافات كبيرة في أنواع الخلايا والأرقام المستخدمة35. يعد زرع الخلايا البطانية في الجزء السفلي من الغرفة العلوية أبسط نموذج لخلية BBB ونهجا ممتازا لحركية النقل ومسار إشارات الخلية36. تضيف نماذج الاستزراع المشترك تفاعلات مع الخلايا المحيطة أو الخلايا الدبقية على أساس الخلايا أحادية الطبقة ، ولكن هذه النماذج غالبا ما تكون مقيدة بعدم القدرة على الحصول على تحديد دقيق للخلية والتحكم الموجه12. النموذج الديناميكي مع هيكل 2D و 3D هو حاليا التمثيل الأكثر دقة للبيئة المكروية الديناميكية ل BBB في المختبر. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن تطوير هذا النموذج ينطوي على جهد مكثف للتصميم والتحقق من الصحة. يمكن أن يؤدي اختيار نموذج BBB المناسب وفقا للاحتياجات الحقيقية للبحث إلى الحصول على نتائج تجريبية أكثر دقة.

عادة ما تتضمن طرق تقييم السلامة الوظيفية لنموذج BBB في المختبر اختبار النفاذية واختبار قيمة المقاومة عبر الغشاء. يتم تحقيق الأول بشكل أساسي من خلال تقييم نفاذية المواد الجزيئية الكبيرة التي تحمل علامة الفلوريسين. الطريقة مباشرة ودقيقة ، لكن بنية طبقة الخلية تتغير بعد مرور المادة الفلورية ، مما يؤدي إلى انخفاض استخدام العينة37. يتم تعويض هذا النقص بشكل فعال من خلال تطوير طريقة الكشف عن TEER. تم وضع القطبين على جانبي طبقة الخلية ، وتم تقييم سلامة وظيفة الحاجز عن طريق قياس مقاومة التيار الأيوني عبر حاجز الخلية38. تم طرح المقاومة الكلية من المقاومة البيئية ، مثل مقاومة غشاء الثقافة والمقاومة المتوسطة ، وضربها في مساحة غشاء الاستزراع للحصول على مقاومة BBB النهائية (TEER ، Ωcm2) 39. تمثل القيمة الأعلى لقيم TEER درجة أعلى من التقاطعات الضيقة بين الخلايا. TEER قياس العملية بسيط وغير جراحي ، وظيفة حاجز الخلية بمجرد تشكيل المقاومة ستكون في نطاق مستقر. تمكن هذه الميزة المشغل من الحفاظ على قيم TEER مماثلة حتى عند استخدام أجهزة مختلفة في ظل ظروف التشغيل القياسية. تتطلب درجة الحرارة ووضع إدخال القطب فقط اهتماما إضافيا من المشغل. ستؤدي زيادة درجة الحرارة والقطب الذي يلامس القاع إلى تقليل مقاومة الخلايا.

في هذه الدراسة ، تم بناء نموذج خلية أحادية الطبقة BBB مباشر في المختبر بنجاح من خلال تقييم المقاومة الزمنية لخلايا bEnd.3 في الغرفة العلوية للوحة. أدت بيئة نقص الأكسجين التي يسببها CoCl2إلى تعطيل التقاطع الضيق بين الخلايا البطانية ، مما قلل بشكل كبير من TEER مقارنة بالخلايا الطبيعية. وفقا لبروتوكول التجربة هذا الموصوف في العملية القياسية لإنشاء نموذج BBB في المختبر لديه معدل نجاح مرتفع وقابلية للتكرار. يجب تغيير كثافة البذر فقط إذا تم إجراء هذه التجربة بمواصفات مختلفة للوحة البئر وكانت مستويات السائل في الغرف العلوية والسفلية للألواح متدفقة. ومع ذلك ، ستتأثر قيمة TEER إلى حد ما بالموقع غير الصحيح للقطب وعدم تجانس المجال الكهربائي في جميع أنحاء طبقة الخلية12. في معظم الحالات ، سيتم تأكيد TEER في وقت واحد عن طريق الكشف عن التألق المناعي والنفاذية اعتمادا على متطلبات الدراسة لنماذج BBB المختلفة. سيتم تحسين نموذج الخلية هذا في المستقبل من أجل فحص الأدوية التي قد تتعرض لتلف BBB الناجم عن نقص الأكسجة. في الختام ، من المحتمل أن يكون لاستخدام تقنية الكشف عن TEER تأثير كبير على إنشاء الأدوية واستراتيجيات العلاج للأمراض العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن نقدر الدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274207 و 82104533) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي في نينغشيا (2023BEG02012) ، ومشروع تعزيز أبحاث Xinglin Scholar التابع لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (XKTD2022013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Tags

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز ، BEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية ، كشف المقاومة الكهربائية عبر البطانية ، الحاجز الدموي الدماغي ، الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة ، الخلايا النجمية ، الخلايا المحيطة ، النماذج في المختبر ، الاضطرابات العصبية ، العلاجات الدوائية ، نموذج خلية BBB أحادية الطبقة ، الغرفة العلوية ، لوحة 24 بئرا ، وظيفة حاجز الخلية ، مقياس الفولتميتر للخلايا الظهارية ، المقاومة الكهربائية عبر الغشاء ، خلايا نقص الأكسجين التي يسببها CoCl2 ، أمراض الجهاز العصبي المركزي
تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية <em>عبر</em> اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang,… More

Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter