Summary
Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.
Abstract
A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura fisiológica dinâmica composta por células endoteliais microvasculares, astrócitos e pericitos. Ao coordenar a interação entre o trânsito restrito de substâncias nocivas, a absorção de nutrientes e a depuração de metabólitos no cérebro, a BHE é essencial na preservação da homeostase do sistema nervoso central. A construção de modelos in vitro do BBB é uma ferramenta valiosa para explorar a fisiopatologia de distúrbios neurológicos e criar tratamentos farmacológicos. Este estudo descreve um procedimento para criar um modelo in vitro de células BBB monocamada por semeadura de células bEnd.3 na câmara superior de uma placa de 24 poços. Para avaliar a integridade da função de barreira celular, o voltímetro de células epiteliais convencional foi usado para registrar a resistência elétrica transmembrana de células normais e hipóxicas induzidas por CoCl2 em tempo real. Antecipamos que os experimentos acima fornecerão ideias eficazes para a criação de modelos in vitro de BBB e drogas para tratar distúrbios de doenças do sistema nervoso central.
Introduction
A BHE é uma interface biológica única entre a circulação sanguínea e o tecido nervoso, que é composto por células endoteliais vasculares, pericitos, astrócitos, neurônios e outras estruturas celulares1. O fluxo de íons, produtos químicos e células entre o sangue e o cérebro é estritamente regulado por essa barreira. Essa homeostase protege os tecidos nervosos contra toxinas e patógenos, além de permitir o funcionamento adequado dos nervos cerebrais 2,3. A manutenção da integridade da BHE pode efetivamente prevenir o desenvolvimento e a progressão de distúrbios que afetam o sistema nervoso central, como disfunção neuronal, edema e neuroinflamação4. No entanto, as propriedades fisiológicas únicas da BHE impedem que mais de 98% dos medicamentos de pequenas moléculas e 100% dos fármacos macromoleculares entrem no sistema nervoso central5. Portanto, aumentar a penetração de medicamentos através da BHE durante o desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central é essencial para alcançar a eficácia terapêutica 6,7. Embora a triagem de substratos por simulação computacional tenha aumentado significativamente a probabilidade de candidatos a fármacos cruzarem o BBB, modelos de BBB confiáveis e acessíveis in vitro/in vivo ainda são necessários para atender às necessidades da pesquisa científica8.
Uma técnica rápida e acessível para triagem de fármacos em alto rendimento é o modelo in vitro 9. Para lançar luz sobre os processos fundamentais dos efeitos dos medicamentos na função BBB e sua participação no desenvolvimento e progressão da doença, uma série de modelos simplificados in vitro de BBB foi criada. Atualmente, os modelos de BHE in vitro comuns são os modelos monocamada, co-cultura, dinâmico e microfluídico 10,11,12, construídos por células endoteliais vasculares e astrócitos, pericitos ou micróglia 13,14. Embora as culturas de células 3D estejam mais alinhadas com a estrutura fisiológica do BBB15, sua aplicação como meio de triagem de drogas para BBB ainda é limitada por seu design intrincado e reprodutibilidade inferior. Em contraste, o modelo in vitro de monocamada é o mais frequentemente utilizado para pesquisar a BBB e é aplicável para determinar a expressão de transportadores de membrana e proteínas de junção apertada em células específicas.
A medição da resistência elétrica transmembrana (TEER) é uma técnica para avaliar e monitorar a camada de células através da resistência e avaliar a integridade celular e a permeabilidade da barreira. Inserindo-se simultaneamente dois eletrodos no meio de crescimento ou solução tampão de cada lado da monocamada, é possível medir a corrente alternada ou a impedância elétrica através da camada compacta da célula 16,17. Para determinar se o modelo de BBB in vitro foi adequadamente criado, a mensuração do TEER será usualmente empregada como padrão-ouro18. Por outro lado, a tendência da ação do medicamento sobre a permeabilidade da BHE pode ser predita com precisão medindo-se a mudança na resistência elétrica da camada celular após o envolvimento da droga19. Por exemplo, Feng e col. descobriram que o catalpol (o monômero ativo primário de rehmanniae) poderia efetivamente reverter a regulação negativa induzida por lipopolissacarídeo de proteínas de junção apertada no BBB e aumentar o valor TEER da camada de células endoteliais cerebrais de camundongos20.
A resposta neuroinflamatória costuma ser a principal causa de desequilíbrio da homeostase BBB21. O tratamento hipóxico para induzir lesão neuroinflamatória é o principal método para destruir a barreira hematoencefálica, incluindo principalmente métodos físicos e métodos de reagentes químicos. A primeira utiliza primariamente uma incubadora de três gases para variar o conteúdo de oxigênio no ambiente de crescimento celular para simular condições hipóxicas22, enquanto a segunda é obtida pela introdução artificial de reagentes desoxi como a CoCl2 no meio de cultura celular23. As células permanecerão em uma condição desoxigenada se Fe2+ for substituído por Co2+ no heme. Se o Fe2+ for substituído por Co2+ no grupo catalítico, a atividade da prolina hidroxilase e do aspartato hidroxilase será inibida, resultando em um acúmulo do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α)24. Sob hipóxia persistente, a desfosforilação do HIF-1α no citoplasma desencadeia a morte celular e ativa o fator de crescimento endotelial vascular, o que, em última instância, eleva a permeabilidade vascular. Em estudos prévios25,26, foi bem demonstrado que a hipóxia pode reduzir significativamente a expressão de proteínas de tight junction endotelial para aumentar a permeabilidade da BHE. Neste estudo, a curva de resistência temporal de células bEnd.3 semeadas em placas de 24 poços foi medida para criar um modelo de BBB simples. Usando este modelo, caracterizamos as mudanças na célula TEER após a intervenção com CoCl2, a fim de construir um modelo celular que possa ser usado para rastrear drogas para proteção BBB.
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Protocol
NOTA: Células endoteliais derivadas do cérebro de camundongos.3 (bEnd.3) foram inoculadas nas câmaras de uma placa de 24 poços para construir um modelo in vitro simples de BBB sob condições específicas de meio. O TEER das células normais e hipóxicas foi medido pelo medidor TEER (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparação da solução
- Preparar o meio de cultura celular DMEM contendo FBS (10%, v/v), 100 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
- Preparar 100 mM de solução de CoCl2 adicionando 1,30 mg de CoCl2 a 100 μL de solução DMSO.
NOTA: Todas as soluções acima foram armazenadas a 4 °C, e a solução-estoque foi diluída de acordo com a concentração desejada antes do uso. - Preparar solução de hipoclorito de sódio a 5% (v/v) adicionando 2 ml de solução de hipoclorito de sódio a 38 ml de água bidestilada.
2. Cultura e viabilidade celular
- Sementes de 1 mL de células bEnd.3 em placa de cultura (100 mm) contendo meio DMEM na densidade de 1 x 106 células/mL e cultivo a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% CO2. Troque o meio a cada 2 a 3 dias e subculte as células 2x por semana.
- Após bEnd.3 as células crescem até 80 % de confluência, digerir as células com 0,25% de tripsina por 30 s.
- Faça uma suspensão de células bEnd.3 na densidade de 7 x 104 células/mL usando o meio DMEM através de um contador de células. Em seguida, semear 100 μL de suspensão de células bEnd.3 em uma placa de 96 poços.
- Após a adesão celular, limpar as células com PBS e cultivar as células com 100 μL de meio de cultura ou meio contendo droga (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) por 24 h nas mesmas condições. Depois de remover o meio dentro da placa do poço e limpá-lo com PBS, adicionar 100 μL de solução de CCK-8.
NOTA: Não gerar bolhas no poço, o que afetará os valores de densidade óptica (OD). - Coloque placas de 96 poços a 37 °C e incube por 1 h. Meça a absorbância das placas de 96 poços a 450 nm usando um leitor de microplacas.
NOTA: Para evitar diferenças intragrupo, as placas dos poços foram resfriadas à temperatura ambiente antes da detecção. - Calcular a viabilidade celular induzida por diferentes concentrações de CoCl2 de acordo com a fórmula [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Selecionar a concentração de CoCl2 com uma diferença significativa na redução da viabilidade celular em comparação com o grupo controle para o próximo experimento.
3. Montagem do modelo
- Enxaguar a câmara superior das placas de 24 poços com PBS.
NOTA: As células cresceram e se fundiram na parte inferior da câmara superior da placa de 24 poços, e junções apertadas entre as células gradualmente se formaram para desempenhar um papel de barreira. Se as células endoteliais usadas em alguns estudos não forem capazes de formar uma barreira completa nas membranas de PET de forma independente, o revestimento das membranas com solução de colágeno IV é necessário antes da inoculação celular. - Misture as células bEnd.3 com o meio DMEM para fazer uma suspensão a uma densidade de 5 x 105 células/mL usando um misturador de vórtices. Em seguida, semear 200 μL de suspensão celular bEnd.3 na membrana PET na câmara superior de uma placa de 24 poços (0,33 cm2, tamanho de poro da membrana de 0,4 μm).
NOTA: O estudo piloto deste protocolo não encontrou diferença nos resultados ao usar 5 a 10 passagens de células bEnd.3 para experimentos. Para garantir a probabilidade de modelagem bem-sucedida, consulte o intervalo de número de célula deste protocolo. - Adicionar 1200 μL de meio completo à câmara inferior da placa para garantir que a pressão osmótica das câmaras superior e inferior tenda a estabilizar. Há diferenças no volume de meio adicionado dependendo do tipo; Certifique-se de que o nível de líquido das câmaras superior e inferior esteja nivelado.
- Troque o meio da câmara superior e da câmara inferior em um horário fixo todos os dias e monitore o valor da resistência ao mesmo tempo.
- Ao mudar o meio, a integridade da camada celular será prejudicada pelo toque artificial ou movimento excessivo. Para evitar a situação acima, remova lentamente o meio antigo de um lado com uma pipeta de pressão negativa e adicione lentamente um novo meio ao longo da parede durante a troca de fluidos.
4. Medição do TEER
- Antes do início dos trabalhos, coloque o resistor, a solução de hipoclorito de sódio a 5%, o etanol a 75% e a solução de água bidestilada em uma mesa ultralimpa. Ligue a irradiação UV por 30 minutos para eliminar bactérias residuais e patógenos.
- Colocar os eletrodos em solução de hipoclorito de sódio a 5% com agitação lenta por 3 s a 5 s e, em seguida, imergir em etanol 75% por 15 min. Por fim, transfira para PBS ou solução de água bidestilada até o uso.
- Ligue o interruptor na parte traseira do medidor de resistor de célula, clique em Selecionar placa de acordo com os parâmetros na Tabela 1 e selecione Placa de 24 poços.
- De acordo com as necessidades da operação, selecione a sequência de detecção apropriada. Selecionamos o procedimento A1 neste estudo.
- Insira um resistor kΩ no plugue direito para calibrar o instrumento. Se o resultado da calibração for de 1000 ± 5 Ω, considere a precisão do instrumento normal.
- Se o resultado da calibração não for 1000 Ω, clique em Unidades de Modo na interface principal para selecionar OHMS e, em seguida, clique em Calibrar na tela principal para recalibrar o instrumento.
- Puxe o resistor kΩ do lado direito e substitua o eletrodo de medição por um fio de conexão.
- Coloque o eletrodo na placa de 24 poços sem semear células verticalmente e clique em Manuseio em branco na tela principal do instrumento. O valor de fundo da resistência da placa sem células semeadas é de cerca de 134,4 Ω.
- Insira os dois eletrodos nas câmaras superior e inferior da placa semeada com células para que a camada de células fique entre eles e, em seguida, registre o valor da resistência pisando suavemente no pedal.
- Certifique-se de que o eletrodo não toque nas células da câmara superior e na parte inferior da câmara inferior. O tempo de embebição do eletrodo na solução não tem efeito sobre o valor da resistência, e é necessário apenas certificar-se de que o eletrodo está na posição correta.
- Obter valores TEER (Ωcm2) multiplicando os valores de resistência elétrica (ohms) com a área inferior (cm2) da câmara superior, como na equação:
TEER (Ωcm2) = Resistência (Ω)x inserção S (cm2) - Desenhe um gráfico de linhas de TEER-Time (em dias). Quando o valor da resistência não aumenta mais com o tempo (medido ao longo de dias), considere que a célula formou uma barreira.
NOTW: O modelo BBB monocamada de células bEnd.3 será construído com sucesso através da cultura de células bEND.3 com os parâmetros deste estudo por cerca de 6 dias. O TEER do modelo de monocamada celular bEnd.3 variou de 16,49 ± 2,12 Ωcm2 a 27,59 ± 1,50 Ωcm2 em 6 dias (n=8, média ± DP).
5. Destruição de barreiras e análise estatística
- De acordo com a curva TEER - tempo, selecionar os poços com função barreira e dividi-los em grupo controle e grupo CoCl2 (n = 4).
- Adicionar o meio de cultura e o meio de cultura contendo 300 μM de CoCl2 (200 μL) na câmara superior do grupo controle e CoCl2 , respectivamente.
- Detectar os valores de resistência dos grupos controle e CoCl2 em 12 h e 24 h de incubação a 37 °C usando o procedimento descrito na etapa 4.
- Utilizar software comercial para mapear a tendência dos valores TEER da barreira de células cultivadas com ou sem 300 μM de CoCl2.
- Utilizar software de análise estatística para analisar a diferença nos valores de resistência entre células tratadas com CoCl2 e células normais (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
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Representative Results
Este protocolo permitiu o registro das mudanças nos valores de resistência das células de acordo com os parâmetros estabelecidos no resistor transendotelial. A viabilidade de células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas com diferentes concentrações de CoCl2 foi avaliada pelo ensaio CCK-8. O maior dano celular produzido pela CoCl2 foi representado pela menor viabilidade celular. Verificamos que 300 μM de CoCl2 foi significativamente citotóxico in vitro, e essa concentração foi usada para os próximos experimentos (Figura 3A). Monitorando as mudanças na resistência ao crescimento em bEnd.3, verificamos que os valores de TEER celular começaram a se estabilizar no5º dia. A lesão hipóxica induzida pela adição de 300 μM de CoCl2 à câmara superior da placa no6º dia resultou em uma diminuição significativa nos valores de TEER em comparação com o controle nos tempos de 12 h e 24 h (Figura 3B). A função da barreira celular pode ser avaliada indiretamente pelo valor ITER, e um declínio no valor TEER indica a quebra da barreira celular. O valor TEER de 300 μM do grupo CoCl2 caiu em comparação com o grupo controle após incubação por 24 h. (Figura 3C). A pesquisa supracitada demonstrou que danos ao modelo de BBB in vitro podem ser causados por um ambiente hipóxico causado pela CoCl2.
Figura 1: Instrumentos e acessórios para medição TEER. (A-B) Interface principal de operação do medidor TEAR. (C-D) Uma placa de 24 poços. (E) A solução necessária para a limpeza e desinfecção dos eletrodos. (F) É necessária uma resistência padrão para a calibração do medidor TESE. (G-H) O eletrodo e a ampliação local. (I) Pedal foi utilizado para a coleta de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxogramas da resistência transmembrana das células bEnd.3 registrados usando um medidor de resistor transendotelial. (A) Cultura celular. (B) As células bEnd.3 foram semeadas na câmara superior das placas, e uma densa barreira celular foi formada pelo preenchimento das placas de poço com meio para suportar seu crescimento e diferenciação. (C) A integridade funcional da barreira das células foi avaliada pela monitoração TEER. (D) CoCl2 foi usado para mimetizar o ambiente hipóxico para induzir função de barreira celular prejudicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O salidrósídeo mantém a integridade da função de barreira das células bEnd.3 aliviando a lesão hipóxica induzida por CoCl2. (A) Efeito da CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) sobre a viabilidade das células bEnd.3 (n=6, grupo CoCl2 vs grupo controle ***p<0,001, média ± DP). (B) Gráfico das mudanças nos valores TEER de células bEnd.3 tratadas com meio normal ou 300 μM de CoCl2 (n=4, Dia 1 vs Dia 2-6: ##p<0,01, ###p<0,001, Dia 6 vs Dia 6,5 - 7: **p<0,01, média ± DP). (C) Alterações TEER das células após 24 h de lesão hipóxica (n=4, grupo CoCl2 vs grupo controle ***p<0,001, média ± DP). Foi realizada ANOVA one-way e teste de Tukey, sendo considerado significativo o p<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros | Opção |
| Selecione a placa | 24-Poço |
| Ordenação de detecção | A1 |
| Unidades de modo | Ω |
| Resistência padrão | 1 kΩ |
Tabela 1: Definir parâmetros do medidor TESE. As configurações de parâmetros e a seleção do programa do instrumento são necessárias para a detecção da resistência celular.
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Discussion
Um dos órgãos corporais mais desenvolvidos, o cérebro controla uma ampla gama de processos fisiológicos intrincados, incluindo memória, cognição, audição, olfato e movimento27. O cérebro é um dos órgãos mais complicados e doentes do corpo humano ao mesmo tempo. A ocorrência de muitas doenças do sistema nervoso central apresenta tendência crescente ano após ano devido a fatores como poluição do ar, padrões alimentares irregulares e outros fatores 27,28,29. É interessante notar que o início e a progressão de algumas doenças do sistema nervoso central, como acidente vascular cerebral, epilepsia e doença de Alzheimer (DA), estão intimamente correlacionados com o crescimento daBHE30,31,32. O conceito básico para o tratamento da maioria dos transtornos com disfunção cerebral pode ser a criação de novas terapias ou medicamentos para manter a homeostase funcional do BBB. Infelizmente, a maioria dos medicamentos não consegue entrar no parênquima cerebral para desempenhar suas funções vitais devido à hidrofobicidade do BBB e ao seu método único de transporte de solutos14,33. Para aumentar a probabilidade de sucesso de um medicamento, é uma boa estratégia criar novos modelos BBB que possam ser utilizados para triagem molecular de alto rendimento.
Devido à intrincada estrutura da unidade neurovascular, o modelo in vivo teoricamente apresenta maior grau de modelagem da estrutura BBB. No entanto, devido à restrição da homologia entre animais e humanos, as variações nos transportadores BBB podem levar a que a triagem de medicamentos não tenha o resultado esperado34. Pelo contrário, os modelos in vitro oferecem as vantagens de serem baratos, terem um ciclo de detecção rápido e poderem ser utilizados para triagem de alto rendimento, o que pode servir melhor aos objetivos da pesquisa de doenças neurológicas. Com o desenvolvimento da ciência e da tecnologia, cada vez mais modelos in vitro que se assemelham muito à estrutura fisiológica do BBB estão sendo criados e aprimorados. Além da distinção entre técnicas de simulação para plataformas estáticas e dinâmicas, existem diferenças significativas nos tipos e números de células utilizados35. A semeadura de células endoteliais na parte inferior da câmara superior é o modelo mais simples de células BBB e uma excelente abordagem para a cinética de transporte e via de sinalização celular36. Modelos de co-cultura adicionam interações com pericitos ou células gliais na base de células monocamadas, mas esses modelos são frequentemente limitados pela incapacidade de obter posicionamento celular preciso e controle direcionado12. O modelo dinâmico com estrutura 2D e 3D é atualmente a representação mais precisa do microambiente dinâmico do BBB in vitro; No entanto, é importante notar que o desenvolvimento desse modelo envolve um extenso esforço prévio de projeto e validação. A seleção do modelo BBB adequado de acordo com as reais necessidades da pesquisa pode obter resultados experimentais mais precisos.
Os métodos de avaliação da integridade funcional do modelo BBB in vitro geralmente incluem um teste de permeabilidade e um teste de valor de resistência transmembrana. A primeira é realizada principalmente pela avaliação da permeabilidade de substâncias macromoleculares marcadas com fluoresceína. O método é simples e preciso, mas a estrutura da camada celular muda após a passagem da substância fluorescente, resultando em baixa utilização da amostra37. Esta deficiência é efetivamente compensada pelo desenvolvimento do método de detecção TESE. Os dois eletrodos foram colocados em ambos os lados da camada celular, e a integridade da função de barreira foi avaliada medindo-se a resistência da corrente iônica através da barreira celular38. A resistência total foi subtraída da resistência ambiental, como resistência da membrana de cultura e resistência média, e multiplicada pela área da membrana de cultura para obtenção da resistência final BBB (TEER, Ωcm2)39. Um valor mais alto de valores TEER representa um maior grau de tight junctions entre as células. A medição TEER da operação é simples e não invasiva, a função de barreira celular uma vez formada a resistência estaria em uma faixa estável. Esta característica permite que o operador mantenha valores TEER semelhantes, mesmo quando utiliza instrumentos diferentes em condições operacionais padrão. Apenas a temperatura e a colocação da inserção do eletrodo requerem atenção extra do operador. O aumento da temperatura e o toque do eletrodo no fundo diminuirá a resistência das células.
Neste estudo, um modelo simples de células monocamada BBB in vitro foi construído com sucesso avaliando a resistência temporal de células bEnd.3 na câmara superior da placa. O ambiente hipóxico induzido por CoCl2rompeu a junção apertada entre as células endoteliais, o que reduziu significativamente o TEER em comparação com as células normais. De acordo com este protocolo de experimento descrito no processo padrão para criar um modelo de BBB in vitro tem uma alta taxa de sucesso e repetibilidade. Somente a densidade de semeadura precisa ser alterada se este experimento for executado com diferentes especificações de placa de poço e os níveis de líquido nas câmaras superior e inferior das placas estiverem nivelados. No entanto, o valor TEER será um pouco impactado pela localização incorreta do eletrodo e pela heterogeneidade do campo elétrico ao longo da camada celular12. Na maioria dos casos, o TEER será confirmado simultaneamente por imunofluorescência e detecção de permeabilidade, dependendo das exigências do estudo de vários modelos de BBB. Esse modelo celular será aprimorado no futuro, a fim de rastrear medicamentos que possam sofrer os danos causados pela hipóxia. Em conclusão, o uso da tecnologia de detecção TEER provavelmente terá um impacto significativo na criação de medicamentos e estratégias terapêuticas para doenças neurológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274207 e 82104533), do Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012) e do Projeto de Promoção de Pesquisa Acadêmica Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
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