Summary
このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外 モデルを記述する。この方法では、マウスの脳血管内皮細胞bEnd.3を使用し、膜貫通電気抵抗を測定します。
Abstract
血液脳関門(BBB)は、微小血管内皮細胞、星状細胞、および周皮細胞で構成される動的な生理学的構造です。BBBは、有害物質の輸送制限、栄養素の吸収、および脳内の代謝産物クリアランスの間の相互作用を調整することにより、中枢神経系の恒常性を維持するために不可欠です。BBBの in vitro モデルの構築は、神経疾患の病態生理学を探求し、薬理学的治療法を作成するための貴重なツールです。この研究では、bEnd.3細胞を24ウェルプレートの上部チャンバーに播種することにより、 in vitro 単層BBB細胞モデルを作成する手順について説明します。細胞バリア機能の完全性を評価するために、従来の上皮細胞電圧計を使用して、正常細胞とCoCl2誘導低酸素細胞の膜貫通電気抵抗をリアルタイムで記録しました。以上の実験は、BBBの in vitro モデルや中枢神経系疾患の治療薬の創製に有効なアイデアを提供することが期待されます。
Introduction
BBBは、血管内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、ニューロン、その他の細胞構造で構成される血液循環と神経組織の間のユニークな生物学的インターフェースです1。血液と脳の間のイオン、化学物質、細胞の流れは、このバリアによって厳密に制御されています。このホメオスタシスは、毒素や病原体から神経組織を保護すると同時に、脳の神経の適切な操作を可能にします2,3。BBBの完全性を維持することで、神経機能障害、浮腫、神経炎症など、中枢神経系に影響を与える疾患の発症と進行を効果的に防ぐことができます4。しかし、BBBのユニークな生理学的特性により、低分子医薬品の98%以上、高分子医薬品の100%が中枢神経系に入るのを防ぎます5。したがって、中枢神経系の薬剤の開発中にBBBを介した薬剤の浸透性を高めることは、治療効果を達成するために不可欠です6,7。基質のコンピューターシミュレーションスクリーニングにより、医薬品候補がBBBを通過する確率が大幅に向上しましたが、科学研究のニーズを満たすためには、信頼性が高く手頃な価格のin vitro/in vivo BBBモデルが依然として必要です8。
ハイスループット薬物スクリーニングのための迅速で手頃な技術は、in vitroモデル9です。医薬品がBBB機能に及ぼす影響の基本的なプロセスと、疾患の発症と進行における医薬品の役割を明らかにするために、一連の簡略化されたin vitro BBBモデルが作成されました。現在、一般的なin vitro BBBモデルは、血管内皮細胞とアストロサイト、ペリサイト、またはミクログリアによって構築される単層、共培養、動的、およびマイクロ流体モデル10,11,12である13,14。3D細胞培養はBBB15の生理学的構造とほぼ一致していますが、BBBの薬物スクリーニングの手段としての応用は、その複雑なデザインと標準以下の再現性によって依然として制約されています。対照的に、単分子膜in vitroモデルは、BBBの研究に最も頻繁に使用されるモデルであり、特定の細胞における膜トランスポーターおよびタイトジャンクションタンパク質の発現を決定するために適用できます。
膜貫通電気抵抗(TEER)測定は、抵抗を横切る細胞層を評価および監視し、バリアの細胞の完全性と透過性を評価する技術です。単分子膜の両側にある増殖培地または緩衝液に2つの電極を同時に挿入することにより、セルのコンパクト層16,17を通る交流または電気インピーダンスを測定することができる。in vitro BBBモデルが適切に作成されているかどうかを判断するために、TEERの測定は通常、ゴールドスタンダード18として採用されます。一方、BBB透過性に対する薬物作用の傾向は、薬物関与後の細胞層の電気抵抗の変化を測定することによって正確に予測することができる19。例えば、Fengらは、カタルポール(レフマニアエの主要な活性モノマー)が、BBBのタイトジャンクションタンパク質のリポ多糖誘導性ダウンレギュレーションを効果的に逆転させ、マウス脳内皮細胞層のTEER値を上昇させることができることを発見しました20。
神経炎症反応は、通常、BBBホメオスタシスの不均衡の主な原因である21。神経炎症性損傷を誘発する低酸素治療は、血液脳関門を破壊する主な方法であり、主に物理的方法と化学試薬法が含まれます。前者は、主に3ガスインキュベーターを利用して、細胞増殖環境中の酸素含有量を変化させて低酸素状態をシミュレートし22、後者は、CoCl2などのデオキシ試薬を細胞培養培地に人工的に導入することによって達成される23。ヘム中のCo2+がFe2+に置換されている場合、細胞は脱酸素状態のままになります。触媒基でFe2+がCo2+に置換されると、プロリンヒドロキシラーゼとアスパラギン酸ヒドロキシラーゼ活性が阻害され、低酸素誘導因子-1α(HIF-1α)が蓄積する24。持続的な低酸素状態では、細胞質におけるHIF-1αの脱リン酸化が細胞死を引き起こし、血管内皮増殖因子を活性化し、最終的に血管透過性を高めます。以前の研究25,26では、低酸素症が内皮タイトジャンクションタンパク質の発現を大幅に低下させてBBBの透過性を高めることが十分に実証されています。本研究では、24ウェルプレートに播種したbEnd.3細胞の時間抵抗曲線を測定し、簡単なBBBモデルを作成しました。このモデルを用いて、CoCl2介入後の細胞TEERの変化を特徴づけ、BBB保護のための薬物のスクリーニングに使用できる細胞モデルを構築しました。
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Protocol
注:マウス脳由来内皮細胞.3(bEnd.3)を24ウェルプレートのチャンバーに接種し、特定の培地条件下でBBBの単純な in vitro モデルを構築しました。正常細胞と低酸素細胞のTEERをTEERメーターで測定しました(図1 、 図2)。
1. 溶液調製
- FBS(10%、v/v)、100 U/mLペニシリン、および10 mg/mLストレプトマイシンを含むDMEM細胞培養培地を調製します( 材料表を参照)。
- 100 μL の DMSO 溶液に 1.30 mg の CoCl2 を添加して、100 mM CoCl2 ストック溶液を調製します。
注:上記の溶液はすべて4°C条件で保存し、原液は使用前に所望の濃度に従って希釈しました。 - 2mLの次亜塩素酸ナトリウム溶液を38mLの二重蒸留水に加えて、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液(v/v)を調製します。
2. 細胞培養と細胞生存率
- 1 mLのbEnd.3細胞をDMEM培地を含む培養皿(100 mm)に1 x 106 細胞/mLの密度で播種し、5%CO2の加湿雰囲気下で37°Cで培養します。培地を2〜3日ごとに交換し、細胞を週に2回継代培養します。
- bEnd.3細胞が80%コンフルエントまで増殖したら、0.25%トリプシンで細胞を30秒間消化します。
- セルカウンターを介してDMEM培地を使用して、7 x 104 cells/mLの密度でbEnd.3細胞の懸濁液を調製します。次に、100 μL の bEnd.3 細胞懸濁液を 96 ウェルプレートに播種します。
- 細胞接着後、細胞をPBSで洗浄し、100μLの培地または薬物含有培地(100μM、200μM、300μM、400μM、500μMCoCl2)で同条件で24時間培養する。ウェルプレート内の培地を取り出し、PBSで洗浄した後、CCK-8溶液100μLを添加する。
注意: 光学濃度(OD)の値に影響を与えるウェルに気泡を発生させないでください。 - 96ウェルプレートを37°Cの環境下に置くと、1時間インキュベートされます。マイクロプレートリーダーを使用して、450 nm での 96 ウェルプレートの吸光度を測定します。
注:グループ内の違いを避けるため、ウェルプレートは検出前に室温まで冷却しました。 - [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%の式に従って、異なる濃度のCoCl2によって誘導される細胞生存率を計算します。次の実験では、対照群と比較して細胞生存率の低下に有意差があるCoCl2濃度を選択します。
3. 模型組み立て
- 24ウェルプレートの上部チャンバーをPBSですすぎます。
注:細胞は24ウェルプレートの上部チャンバーの底部で増殖・融合し、細胞間のタイトジャンクションが徐々に形成され、バリアの役割を果たしました。一部の研究で使用された内皮細胞がPET膜上に独立して完全なバリアを形成できない場合は、細胞接種の前に膜をコラーゲンIV溶液でコーティングする必要があります。 - ボルテックスミキサーを用いて、bEnd.3細胞をDMEM培地と混合し、5 x 105 cells/mLの密度で懸濁液を作製します。次に、200 μLのbEnd.3細胞懸濁液を、24ウェルプレートの上部チャンバー(0.33 cm2、0.4 μmのメンブレン孔径)のPETメンブレンに播種します。
注:このプロトコルの予備調査は実験のためにbEnd.3セルの5から10の道を使用したとき結果の相違を見つけなかった。モデリングが成功する確率を確認するには、このプロトコルの細胞番号間隔を参照してください。 - プレートの下部チャンバーに1200 μLの完全培地を添加し、上部チャンバーと下部チャンバーの浸透圧が安定する傾向があることを確認します。種類によって添加する培地の量に違いがあります。上部チャンバーと下部チャンバーの液面が平らであることを確認してください。
- 毎日決まった時間に上チャンバーと下チャンバーの媒体を交換し、同時に抵抗値を監視します。
- 培地を交換すると、人工的な接触や過度の動きによって細胞層の完全性が損なわれます。上記の状況を回避するには、負圧ピペットで片側から古い培地をゆっくりと取り除き、流体交換中に壁に沿って新しい培地をゆっくりと追加します。
4. TEERの測定
- 作業を開始する前に、抵抗器、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液、75%エタノール、および二重蒸留水溶液を超清潔なテーブルに入れます。UV照射を30分間オンにして、残留細菌や病原体を除去します。
- 電極を5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に入れ、3秒から5秒間ゆっくりと振とうした後、75%エタノールに15分間浸します。最後に、使用するまでPBSまたは二重蒸留水溶液に移します。
- セル抵抗計の背面にあるスイッチをオンにし、表1のパラメータに従って[プレートの選択]をクリックし、[24-Well Plate]を選択します。
- 操作のニーズに応じて、適切な検出シーケンスを選択します。この研究では A1 手順を選択しました。
- kΩ抵抗器を右側のプラグに挿入して、機器を校正します。校正結果が1000±5 Ωの場合、機器の精度は正常であると考えてください。
- 校正結果が1000 Ωでない場合は、メインインターフェイスの [モード単位 ]をクリックして OHMSを選択し、メイン画面の[ 校正 ]をクリックして機器を再校正します。
- 右側のkΩ抵抗を引き抜き、測定電極を接続線に交換します。
- 細胞を垂直に播種せずに電極を24ウェルプレートに入れ、装置のメイン画面で [ブランク処理 ]をクリックします。播種セルなしのプレート抵抗のバックグラウンド値は、約134.4 Ωです。
- 2つの電極をセルで播種プレートの上部チャンバーと下部チャンバーに挿入し、セル層がそれらの間に来るようにし、 ペダルを軽く踏んで抵抗値を記録します。
- 電極が上部チャンバーと下部チャンバーの下部のセルに触れていないことを確認してください。電極の溶液への浸漬時間は抵抗値に影響を与えず、電極が正しい位置にあることを確認するだけで済みます。
- 次式のように、電気抵抗値(オーム)に上部チャンバーの底部面積(cm2)を掛けて、TEER値(Ωcm2)を取得します。
TEER(Ωcm2)=抵抗(Ω)×Sインサート (cm2) - TEER-Time (日数) の折れ線グラフを描画します。抵抗値が時間の経過とともにそれ以上増加しない場合(数日間で測定)、セルがバリアを形成したと考えてください。
NOTW:bEnd.3細胞の単層BBBモデルは、この研究のパラメータでbEND.3細胞を約6日間培養することにより、正常に構築されます。bEnd.3細胞単層モデルのTEERは、6日以内に16.49±2.12Ωcm2から27.59±1.50Ωcm2の範囲であった(n=8、平均±SD)。
5. バリア破壊と統計解析
- TEER-時間曲線に従って、バリア関数を持つウェルを選択し、それらを対照群とCoCl2 群(n = 4)に分割します。
- 300μMのCoCl2 (200μL)を含有する培地および培養液を、それぞれ対照群およびCoCl2 群上チャンバーに添加する。
- ステップ 4 で説明した手順を使用して、37 °C での 12 時間および 24 時間のインキュベーションで、コントロール基と CoCl2 基の抵抗値を検出します。
- 市販のソフトウェアを使用して、300 μM CoCl2 の有無にかかわらず培養した細胞のバリアの TEER 値の傾向をマッピングします。
- CoCl2処理細胞と正常細胞(n=4、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)の耐性値の差を統計解析ソフトウェアで解析します。
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Representative Results
このプロトコルにより、経内皮抵抗計に設定されたパラメータに従って、細胞の抵抗値の変化を記録することができました。異なる濃度のCoCl2で処理したbEnd.3細胞(生細胞数)の生存率をCCK-8アッセイでスクリーニングしました。CoCl2 によって引き起こされる細胞損傷が大きいほど、細胞生存率が低くなることが示されました。300 μMのCoCl2がin vitroで有意に細胞傷害性を示すことがわかったため、この濃度を次の実験に使用しました(図3A)。bEnd.3の増殖抵抗性の変化をモニタリングしたところ、5日目に細胞のTEER値が安定し始めたことが分かりました。6日目にプレートの上部チャンバーに300 μM CoCl2を添加することによって誘発された低酸素傷害は、12時間および24時間の両方の時点で、対照と比較してTEER値の有意な減少をもたらしました(図3B)。細胞バリアの機能はTEER値によって間接的に評価することができ、TEER値の低下は細胞バリアの破壊を示す。300 μM CoCl2 群の TEER 値は、24 時間のインキュベーション後に対照群と比較して低下しました(図 3C)。前述の研究により、BBBのin vitroモデルの損傷は、CoCl2によって引き起こされる低酸素環境によって引き起こされる可能性があることが実証されました。
図1:TEERを測定するための機器とアクセサリ。(A-B) TEERメーターの操作メインインターフェース。 (C-D) 24ウェルプレート。 (E) 電極の洗浄と消毒に必要な溶液。(F) TEERメーターの校正には標準抵抗が必要です。 (G-H) 電極と局所倍率。 (I) フットペダルを使用してデータを収集しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:経内皮抵抗計を使用して記録されたbEnd.3細胞の膜貫通抵抗のフローチャート。 (A)細胞培養。(B)bEnd.3細胞をプレートの上部チャンバーに播種し、ウェルプレートに培地を充填して高密度の細胞バリアを形成し、増殖と分化をサポートしました。(C)細胞のバリア機能的完全性は、TEERをモニタリングすることによって評価されました。(D)CoCl2 を使用して低酸素環境を模倣し、細胞バリア機能障害を誘導しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:サリドロシドは、CoCl2誘発性低酸素傷害を緩和することにより、bEnd.3細胞のバリア機能の完全性を維持します。 (a)bEnd.3細胞の生存率に対するCoCl2 (100μM、200μM、300μM、400μM、500μM)の影響(n = 6、CoCl2 グループ対コントロールグループ***p<0.001、平均±SD)。(B)通常の培地または300 μM CoCl2(n = 4、1日目と2〜6日目:##p< 0.01、###p< 0.001、6日目と6.5〜7日目:**p<0.01、平均±SD)で処理したbEnd.3細胞のTEER値の変化のプロット。(C)24時間の低酸素傷害後の細胞のTEER変化(n = 4、CoCl2 群対対照群***p<0.001、平均±SD)。一元配置分散分析とテューキーの検定が実行され、p<0.05が有意であると見なされました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | オプション |
| プレートを選択 | 24ウェル |
| 検出の順序付け | A1 (日本語) |
| モード単位 | Ω |
| 標準抵抗 | 1kΩ |
表1:TEERメーターのパラメータを設定します。 セル抵抗の検出には、機器のパラメータ設定とプログラム選択が必要です。
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Discussion
最も発達した身体器官の1つである脳は、記憶、認知、聴覚、嗅覚、運動など、さまざまな複雑な生理学的プロセスを制御しています27。脳は、人体で最も複雑で病気の器官の1つであると同時に、人体で最も複雑で病気の器官の1つです。多くの中枢神経系疾患の発生は、大気汚染、不規則な食事パターン、およびその他の要因を含む要因により、年々増加傾向を示しています27,28,29。脳卒中、てんかん、アルツハイマー病(AD)などのいくつかの中枢神経系疾患の始まりと進行が、BBBの成長と密接に関連していることは興味深いことです30,31,32。脳機能障害を伴う大多数の疾患の治療の基本概念は、BBBの機能的恒常性を維持するための新しい治療法または薬物の創出である可能性があります。残念ながら、ほとんどの医薬品は、BBBの疎水性と独自の溶質輸送方法14,33のために、重要な機能を実行するために脳実質に入ることができません。医薬品が成功する可能性を高めるには、ハイスループット分子スクリーニングに利用できる新しいBBBモデルを作成することが良い戦略です。
神経血管ユニットの構造が複雑なため、 in vivo モデルは理論的にはBBB構造のモデリングの高度を持っています。しかし、動物とヒトの間の相同性の制限により、BBBトランスポーターのばらつきは、投薬スクリーニングが期待した結果をもたらさないことにつながる可能性がある34。それどころか、 in vitro モデルは、安価で、検出サイクルが速く、ハイスループットスクリーニングに利用できるという利点があり、神経疾患研究の目的によりよく役立つ可能性があります。科学技術の発展に伴い、BBBの生理学的構造によく似た in vitro モデルがますます作成され、強化されています。静的プラットフォームと動的プラットフォームのシミュレーション手法の違いに加えて、使用される細胞の種類と数に大きな違いがあります35。上部チャンバーの底部に内皮細胞を播種することは、最も単純なBBB細胞モデルであり、輸送速度論および細胞シグナル伝達経路に対する優れたアプローチである36。共培養モデルは、単層細胞の基盤に周皮細胞またはグリア細胞との相互作用を追加しますが、これらのモデルは、正確な細胞の位置決めと指向性制御が得られないことによって制約されることがよくあります12。2Dおよび3D構造の動的モデルは、現在 、in vitroでのBBBの動的微小環境を最も正確に表現しています。ただし、このモデルの開発には、事前の設計と検証に広範な作業が必要であることに注意することが重要です。研究の真のニーズに応じて適切なBBBモデルを選択することで、より正確な実験結果を得ることができます。
in vitro モデルのBBBの機能的完全性の評価方法には、通常、透過性試験と膜貫通抵抗値試験が含まれます。前者は、主にフルオレセイン標識高分子物質の透過性を評価することによって達成されます。この方法は単純明快であるが、蛍光物質が通過した後に細胞層の構造が変化するため、サンプル利用率が低くなる37。この欠陥は、TEER検出法の開発によって効果的に補われます。2つの電極をセル層の両側に配置し、セルバリア38を横切るイオン電流抵抗を測定することによって、バリア機能の完全性を評価した。培養膜抵抗や培地抵抗などの環境抵抗から総抵抗値を差し引き、培養膜の面積を掛けて最終的なBBB抵抗(TEER、Ωcm2)を求めた39。TEER 値の値が高いほど、セル間のタイト ジャンクションの度合いが高くなります。操作を測定するTEERは簡単で非侵襲的であり、細胞バリア機能は一度形成された抵抗が安定した範囲になります。この機能により、オペレーターは、標準的な動作条件下で異なる機器を使用する場合でも、同様のTEER値を維持できます。温度と電極挿入の配置のみが、オペレーターに特別な注意を払う必要があります。温度が上昇し、電極が底部に触れると、セル抵抗が減少します。
本研究では、プレート上部チャンバー内のbEnd.3細胞の時間抵抗を評価することにより、 in vitro での簡単なBBB単層細胞モデルの構築に成功しました。CoCl2によって誘導される低酸素環境は、内皮細胞間のタイトジャンクションを破壊し、正常細胞と比較してTEERを有意に低下させました。この実験プロトコルによれば、 in vitro BBBモデルを作成するための標準プロセスに記載されているプロトコルは、高い成功率と再現性を有する。この実験を異なるウェルプレート仕様で実行し、プレートの上部チャンバーと下部チャンバーの液面が平らになっている場合は、播種密度のみを変更する必要があります。しかしながら、TEER値は、電極の誤った位置およびセル層12全体にわたる電界の不均一性によっていくらか影響を受けるであろう。ほとんどの場合、TEERは、さまざまなBBBモデルの研究要件に応じて、免疫蛍光法と透過性検出によって同時に確認されます。この細胞モデルは、低酸素症によって引き起こされるBBB損傷を持続する可能性のある薬をスクリーニングするために、将来的に改善されます。結論として、TEER検出技術の使用は、神経疾患の薬物療法および治療戦略の作成に大きな影響を与える可能性があります。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
中国国家自然科学基金会(82274207および82104533)、寧夏回族自治区重点研究開発プログラム(2023BEG02012)、成都中華大学興林奨学生研究促進プロジェクト(XKTD2022013)からの財政的支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
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