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Neuroscience

Enregistrement de l’intégrité fonctionnelle de la barrière sur les cellules endothéliales vasculaires bEnd.3 via la détection de résistance électrique transendothéliale

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65938
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 4, 1,2, 1,2,5, 2
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Ce protocole décrit un modèle in vitro fiable et efficace de la barrière hémato-encéphalique. La méthode utilise des cellules endothéliales vasculaires cérébrales de souris bEnd.3 et mesure la résistance électrique transmembranaire.

Abstract

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure physiologique dynamique composée de cellules endothéliales microvasculaires, d’astrocytes et de péricytes. En coordonnant l’interaction entre le transit restreint des substances nocives, l’absorption des nutriments et la clairance des métabolites dans le cerveau, la BHE est essentielle à la préservation de l’homéostasie du système nerveux central. La construction de modèles in vitro de la BHE est un outil précieux pour explorer la physiopathologie des troubles neurologiques et créer des traitements pharmacologiques. Cette étude décrit une procédure de création d’un modèle de cellules monocouches de BHE in vitro en ensemencant des cellules bEnd.3 dans la chambre supérieure d’une plaque à 24 puits. Pour évaluer l’intégrité de la fonction de barrière cellulaire, le voltmètre de cellules épithéliales conventionnel a été utilisé pour enregistrer en temps réel la résistance électrique transmembranaire des cellules normales et des cellules hypoxiques induites par la CoCl2. Nous prévoyons que les expériences ci-dessus fourniront des idées efficaces pour la création de modèles in vitro de BHE et de médicaments pour traiter les troubles des maladies du système nerveux central.

Introduction

La BHE est une interface biologique unique entre la circulation sanguine et le tissu nerveux, qui est composée de cellules endothéliales vasculaires, de péricytes, d’astrocytes, de neurones et d’autres structures cellulaires1. Le flux d’ions, de produits chimiques et de cellules entre le sang et le cerveau est strictement régulé par cette barrière. Cette homéostasie protège les tissus nerveux contre les toxines et les agents pathogènes tout en permettant le bon fonctionnement des nerfs du cerveau 2,3. Le maintien de l’intégrité de la BHE peut prévenir efficacement le développement et la progression de troubles affectant le système nerveux central, tels que le dysfonctionnement neuronal, l’œdème et la neuroinflammation4. Cependant, les propriétés physiologiques uniques de la BHE empêchent plus de 98 % des médicaments à petites molécules et 100 % des produits pharmaceutiques macromoléculaires de pénétrer dans le système nerveux central5. Par conséquent, il est essentiel d’augmenter la pénétration des médicaments à travers la BHE pendant le développement des médicaments pour le système nerveux central afin d’atteindre l’efficacité thérapeutique 6,7. Même si le criblage des substrats par simulation informatique a considérablement augmenté la probabilité que les candidats-médicaments franchissent la BHE, des modèles de BHE in vitro/in vivo fiables et abordables sont encore nécessaires pour répondre aux besoins de la recherche scientifique8.

Une technique rapide et abordable pour le criblage de médicaments à haut débit est le modèle9 in vitro. Pour faire la lumière sur les processus fondamentaux des effets des médicaments sur la fonction de la BHE et leur rôle dans le développement et la progression de la maladie, une série de modèles de BHE in vitro simplifiés a été créée. À l’heure actuelle, les modèles de BHE in vitro courants sont les modèles monocouches, de coculture, dynamiques et microfluidiques 10,11,12, construits par des cellules endothéliales vasculaires et des astrocytes, des péricytes ou des microglies 13,14. Bien que les cultures cellulaires 3D soient plus conformes à la structure physiologique de la BHE15, leur application en tant que moyen de criblage de médicaments pour la BHE est encore limitée par leur conception complexe et leur reproductibilité médiocre. En revanche, le modèle in vitro monocouche est celui qui est le plus fréquemment utilisé pour la recherche sur la BHE et est applicable pour déterminer l’expression des transporteurs membranaires et des protéines à jonction serrée dans des cellules particulières.

La mesure de la résistance électrique transmembranaire (TEER) est une technique permettant d’évaluer et de surveiller la couche de cellules à travers la résistance et d’évaluer l’intégrité cellulaire et la perméabilité de la barrière. En insérant simultanément deux électrodes dans le milieu de culture ou la solution tampon de part et d’autre de la monocouche, il est possible de mesurer le courant alternatif ou l’impédance électrique à travers la couche compacte de la cellule16,17. Afin de déterminer si le modèle de la BHE in vitro a été correctement créé, la mesure de l’ETER sera généralement utilisée comme étalon-or18. D’autre part, la tendance de l’action des médicaments sur la perméabilité de la BHE peut être prédite avec précision en mesurant le changement de résistance électrique de la couche cellulaire après l’implication du médicament19. Par exemple, Feng et al. ont découvert que le catalpol (le principal monomère actif de rehmanniae) pouvait effectivement inverser la régulation négative induite par les lipopolysaccharides des protéines à jonction serrée dans la BHE et augmenter la valeur TEER de la couche20 de cellules endothéliales du cerveau de souris.

La réponse neuro-inflammatoire est généralement la principale cause du déséquilibre de l’homéostasie de la BHE21. Le traitement hypoxique pour induire des lésions neuro-inflammatoires est la principale méthode pour détruire la barrière hémato-encéphalique, comprenant principalement des méthodes physiques et des méthodes de réactifs chimiques. Le premier utilise principalement un incubateur à trois gaz pour faire varier la teneur en oxygène dans l’environnement de croissance cellulaire afin de simuler des conditions hypoxiques22, tandis que le second est obtenu en introduisant artificiellement des réactifs désoxy tels que CoCl2 dans le milieu de culture cellulaire23. Les cellules resteront dans un état désoxygéné si le Fe2+ est substitué au Co2+ dans l’hème. Si le Fe2+ est substitué au Co2+ dans le groupe catalytique, l’activité de la proline hydroxylase et de l’aspartate hydroxylase sera inhibée, ce qui entraînera une accumulation de facteur 1α inductible par l’hypoxie (HIF-1α)24. En cas d’hypoxie persistante, la déphosphorylation de HIF-1α dans le cytoplasme déclenche la mort cellulaire et active le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ce qui augmente finalement la perméabilité vasculaire. Dans des études antérieures25,26, il a été bien démontré que l’hypoxie peut réduire considérablement l’expression des protéines de jonction serrée endothéliale pour augmenter la perméabilité de la BHE. Dans cette étude, la courbe de résistance temporelle des cellules bEnd.3 ensemencées dans des plaques à 24 puits a été mesurée afin de créer un modèle BHE simple. À l’aide de ce modèle, nous avons caractérisé les changements dans le TEER cellulaire après l’intervention de CoCl2 afin de construire un modèle cellulaire qui peut être utilisé pour cribler les médicaments pour la protection contre la BHE.

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Protocol

NOTE : Des cellules endothéliales dérivées du cerveau de souris.3 (bEnd.3) ont été inoculées dans les chambres d’une plaque à 24 puits pour construire un modèle in vitro simple de la BHE dans des conditions de milieu spécifiques. Les TEER des cellules normales et des cellules hypoxiques ont été mesurés à l’aide d’un TEER (Figure 1 et Figure 2).

1. Préparation de la solution

  1. Préparer le milieu de culture cellulaire DMEM contenant du FBS (10 %, v/v), 100 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine (voir le tableau des matériaux).
  2. Préparer 100 mM de solution mère de CoCl2 en ajoutant 1,30 mg de CoCl2 à 100 μL de solution de DMSO.
    REMARQUE : Toutes les solutions ci-dessus ont été stockées à 4 °C et la solution mère a été diluée en fonction de la concentration souhaitée avant utilisation.
  3. Préparer une solution d’hypochlorite de sodium à 5 % (v/v) en ajoutant 2 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 38 mL d’eau doublement distillée.

2. Culture cellulaire et viabilité cellulaire

  1. Semez 1 mL de cellules bEnd.3 dans une boîte de culture (100 mm) contenant un milieu DMEM à une densité de 1 x 106 cellules/mL et une culture à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Changez le milieu tous les 2 à 3 jours et faites une sous-culture des cellules 2 fois par semaine.
  2. Une fois que les cellules bEnd.3 ont atteint 80 % de confluence, digérez les cellules avec 0,25 % de trypsine pendant 30 s.
  3. Faire une suspension de cellules bEnd.3 à une densité de 7 x 104 cellules/mL en utilisant un milieu DMEM à travers un compteur de cellules. Ensuite, semez 100 μL de suspension cellulaire bEnd.3 dans une plaque à 96 puits.
  4. Après l’adhésion cellulaire, nettoyer les cellules avec du PBS et cultiver les cellules avec 100 μL de milieu de culture ou de milieu contenant du médicament (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) pendant 24 h dans les mêmes conditions. Après avoir retiré le milieu à l’intérieur de la plaque du puits et l’avoir nettoyé avec du PBS, ajoutez 100 μL de solution CCK-8.
    REMARQUE : Ne générez pas de bulles dans le puits, ce qui affecterait les valeurs de densité optique (OD).
  5. Placer les plaques à 96 puits dans un environnement de 37 °C et incuber pendant 1 h. Mesurez l’absorbance des plaques à 96 puits à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
    REMARQUE : Pour éviter les différences à l’intérieur d’un groupe, les plaques de puits ont été refroidies à température ambiante avant la détection.
  6. Calculer la viabilité cellulaire induite par différentes concentrations de CoCl2 selon la formule [ODDrug - OD Blank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Sélectionnez la concentration de CoCl2 avec une différence significative dans la réduction de la viabilité cellulaire par rapport au groupe témoin pour l’expérience suivante.

3. Assemblage du modèle

  1. Rincez la chambre supérieure des plaques à 24 puits avec du PBS.
    REMARQUE : Les cellules se sont développées et ont fusionné au fond de la chambre supérieure de la plaque à 24 puits, et des jonctions serrées entre les cellules se sont progressivement formées pour jouer un rôle de barrière. Si les cellules endothéliales utilisées dans certaines études ne sont pas en mesure de former une barrière complète sur les membranes PET de manière indépendante, il est nécessaire d’enduire les membranes d’une solution de collagène IV avant l’inoculation cellulaire.
  2. Mélanger les cellules bEnd.3 avec le milieu DMEM pour obtenir une suspension à une densité de 5 x 105 cellules/mL à l’aide d’un mélangeur vortex. Ensuite, semer 200 μL de suspension cellulaire bEnd.3 sur la membrane PET dans la chambre supérieure d’une plaque à 24 puits (0,33 cm2, 0,4 μm de taille de pore de membrane).
    REMARQUE : L’étude pilote de ce protocole n’a trouvé aucune différence dans les résultats lors de l’utilisation de 5 à 10 passages de cellules bEnd.3 pour les expériences. Pour vous assurer de la probabilité de réussite de la modélisation, veuillez vous référer à l’intervalle de numéro de cellule de ce protocole.
  3. Ajouter 1200 μL de milieu complet dans la chambre inférieure de la plaque pour s’assurer que la pression osmotique des chambres supérieure et inférieure tend à se stabiliser. Il existe des différences dans le volume de milieu ajouté selon le type ; Assurez-vous que le niveau de liquide des chambres supérieure et inférieure est affleurant.
  4. Changez le milieu de la chambre supérieure et de la chambre inférieure à une heure fixe tous les jours et surveillez la valeur de résistance en même temps.
    1. Lors du changement de milieu, l’intégrité de la couche cellulaire sera endommagée par un toucher artificiel ou un mouvement excessif. Pour éviter la situation ci-dessus, retirez lentement l’ancien milieu d’un côté avec une pipette à pression négative et ajoutez lentement un nouveau milieu le long de la paroi pendant l’échange de fluide.

4. Mesure de l’EER

  1. Avant de commencer le travail, placez la résistance, la solution d’hypochlorite de sodium à 5 %, l’éthanol à 75 % et la solution d’eau distillée double dans une table ultra-propre. Allumez l’irradiation UV pendant 30 min pour éliminer les bactéries résiduelles et les agents pathogènes.
  2. Placer les électrodes dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5 % en agitant lentement pendant 3 à 5 s, puis les immerger dans de l’éthanol à 75 % pendant 15 min. Enfin, transférez dans une solution de PBS ou d’eau distillée double jusqu’à utilisation.
  3. Allumez l’interrupteur situé à l’arrière du compteur de résistances de cellule, cliquez sur Sélectionner la plaque en fonction des paramètres du tableau 1, puis sélectionnez Plaque à 24 puits.
  4. En fonction des besoins de l’opération, sélectionnez la séquence de détection appropriée. Nous avons choisi la procédure A1 dans cette étude.
  5. Insérez une résistance kΩ dans la fiche droite pour calibrer l’instrument. Si le résultat de l’étalonnage est de 1000 ± 5 Ω, considérez que la précision de l’instrument est normale.
    1. Si le résultat de l’étalonnage n’est pas de 1000 Ω, cliquez sur Unités de mode sur l’interface principale pour sélectionner OHMS, puis cliquez sur Calibrer sur l’écran principal pour recalibrer l’instrument.
  6. Retirez la résistance kΩ sur le côté droit et remplacez l’électrode de mesure par un fil de connexion.
  7. Placez l’électrode dans la plaque à 24 puits sans ensemencer les cellules verticalement et cliquez sur Blank Handling (Manipulation des blancs ) sur l’écran principal de l’instrument. La valeur de fond de la résistance de la plaque sans cellules ensemencées est d’environ 134,4 Ω.
  8. Insérez les deux électrodes dans les chambres supérieure et inférieure de la plaque ensemencée avec des cellules de manière à ce que la couche de cellules se trouve entre elles, puis enregistrez la valeur de résistance en appuyant doucement sur la pédale.
    1. Assurez-vous que l’électrode ne touche pas les cellules de la chambre supérieure et du fond de la chambre inférieure. Le temps de trempage de l’électrode dans la solution n’a aucun effet sur la valeur de la résistance et il suffit de s’assurer que l’électrode est dans la bonne position.
  9. Obtenir les valeurs TEER (Ωcm2) en multipliant les valeurs de résistance électrique (ohms) par la surface inférieure (cm2) de la chambre supérieure, comme dans l’équation :
    TEER (Ωcm2) = Résistance (Ω)x insert S (cm 2)
  10. Tracez un tracé linéaire de TEER-Temps (en jours). Lorsque la valeur de la résistance n’augmente pas avec le temps (mesurée en jours), considérez que la cellule formée est une barrière.
    NOTW : Le modèle monocouche de BHE des cellules bEnd.3 sera construit avec succès en cultivant des cellules bEND.3 avec les paramètres de cette étude pendant environ 6 jours. Le TEER du modèle monocouche de cellules bEnd.3 variait de 16,49 ± 2,12 Ωcm2 à 27,59 ± 1,50 Ωcm2 en 6 jours (n = 8, ± écart-type moyen).

5. Destruction des barrières et analyse statistique

  1. Selon la courbe TEER - temps, sélectionnez les puits avec fonction barrière et divisez-les en groupe témoin et groupe CoCl2 (n = 4).
  2. Ajouter le milieu de culture et le milieu de culture contenant 300 μM de CoCl2 (200 μL) dans la chambre supérieure du groupe témoin et du groupe CoCl2 , respectivement.
  3. Détecter les valeurs de résistance des groupes témoin et CoCl2 à 12 h et 24 h d’incubation à 37 °C en suivant la procédure décrite à l’étape 4.
  4. Utiliser un logiciel commercial pour cartographier la tendance des valeurs TEER de la barrière de cellules cultivées avec ou sans 300 μM de CoCl2.
  5. Utiliser un logiciel d’analyse statistique pour analyser la différence de valeurs de résistance entre les cellules traitées au CoCl2 et les cellules normales (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

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Representative Results

Ce protocole a permis d’enregistrer les changements dans les valeurs de résistance des cellules en fonction des paramètres définis dans le compteur de résistance transendothéliale. La viabilité des cellules bEnd.3 (nombre de cellules vivantes) traitées avec différentes concentrations de CoCl2 a été examinée par le test CCK-8. Des dommages cellulaires plus importants produits par CoCl2 étaient représentés par une viabilité cellulaire plus faible. Nous avons constaté que 300 μM de CoCl2 étaient significativement cytotoxiques in vitro, et cette concentration a été utilisée pour les expériences suivantes (Figure 3A). En surveillant les changements de résistance à la croissance dans bEnd.3, nous avons constaté que les valeurs TEER des cellules ont commencé à se stabiliser le 5ème jour. La lésion hypoxique induite par l’ajout de 300 μM de CoCl2 dans la chambre supérieure de la plaque le 6e jour a entraîné une diminution significative des valeurs TEER par rapport au témoin aux points temporels de 12 h et de 24 h (Figure 3B). La fonction de la barrière cellulaire peut être indirectement évaluée par la valeur TEER, et une baisse de la valeur TEER indique la rupture de la barrière cellulaire. La valeur TEER du groupe CoCl2 de 300 μM a chuté par rapport au groupe témoin après une incubation de 24 h (Figure 3C). La recherche susmentionnée a démontré que les dommages au modèle in vitro de la BHE peuvent être causés par un environnement hypoxique causé par la CoCl2.

Figure 1
Figure 1 : Instruments et accessoires pour la mesure de l’EER. (A-B) Interface principale de fonctionnement du compteur TEER. (C-D) Une plaque de 24 puits. (E) La solution requise pour le nettoyage et la désinfection des électrodes. (F) Une résistance standard est requise pour l’étalonnage de l’appareil de mesure TEER. (G-H) L’électrode et le grossissement local. (I) La pédale a été utilisée pour recueillir des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Organigrammes de la résistance transmembranaire des cellules bEnd.3 enregistrés à l’aide d’un appareil de mesure à résistance transendothéliale. (A) Culture cellulaire. (B) Les cellules bEnd.3 ont été ensemencées dans la chambre supérieure des plaques, et une barrière cellulaire dense a été formée en remplissant les plaques du puits avec un milieu pour soutenir leur croissance et leur différenciation. (C) L’intégrité fonctionnelle de la barrière des cellules a été évaluée par la surveillance de l’EER. (D) CoCl2 a été utilisé pour imiter l’environnement hypoxique afin d’induire une altération de la fonction de barrière cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Salidroside maintient l’intégrité de la fonction barrière des cellules bEnd.3 en atténuant les lésions hypoxiques induites par la CoCl2. (A) Effet de la CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) sur la viabilité des cellules bEnd.3 (n = 6, groupe CoCl2 vs groupe témoin ***p<0,001, moyenne ± écart-type). (B) Graphique des changements dans les valeurs TEER des cellules bEnd.3 traitées avec un milieu normal ou 300 μM CoCl2 (n = 4, jour 1 vs jour 2-6 : ##p<0,01, ###p<0,001, jour 6 vs jour 6,5 - 7 : **p<0,01, moyenne ± écart-type). (C) Changements TEER des cellules après une lésion hypoxique de 24 h (n = 4, groupe CoCl2 vs groupe témoin ***p<0,001, moyenne ± écart-type). Une ANOVA à un facteur et le test de Tukey ont été effectués, et p<0,05 a été considéré comme significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètres Option
Sélectionner une assiette 24 puits
Ordre de détection A1
Unités de mode Ω
Résistance standard 1 kΩ

Tableau 1 : Définir les paramètres du compteur TEER. Le réglage des paramètres et la sélection du programme de l’instrument sont nécessaires pour la détection de la résistance des cellules.

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Discussion

L’un des organes corporels les plus développés, le cerveau contrôle un large éventail de processus physiologiques complexes, notamment la mémoire, la cognition, l’ouïe, l’odorat etle mouvement. Le cerveau est à la fois l’un des organes les plus compliqués et les plus malades du corps humain. L’apparition de nombreux troubles du système nerveux central montre une tendance croissante d’année en année en raison de facteurs tels que la pollution de l’air, les habitudes alimentaires irrégulières et d’autres facteurs 27,28,29. Il est intéressant de noter que le début et la progression de certaines maladies du système nerveux central, telles que les accidents vasculaires cérébraux, l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer (MA), sont étroitement corrélés à la croissance de la BHE30,31,32. Le concept de base pour le traitement de la majorité des troubles avec dysfonctionnement cérébral peut être la création de nouvelles thérapies ou de nouveaux médicaments pour maintenir l’homéostasie fonctionnelle de la BHE. Malheureusement, la plupart des médicaments ne peuvent pas pénétrer dans le parenchyme cérébral pour remplir leurs fonctions vitales en raison de l’hydrophobicité de la BHE et de sa méthode unique de transport des solutés14,33. Pour augmenter la probabilité de succès d’un médicament, il est judicieux de créer de nouveaux modèles de BHE qui peuvent être utilisés pour le criblage moléculaire à haut débit.

En raison de la structure complexe de l’unité neurovasculaire, le modèle in vivo a théoriquement un degré plus élevé de modélisation de la structure de la BHE. Cependant, en raison de la restriction de l’homologie entre les animaux et les humains, les variances dans les transporteurs de la BHE peuvent conduire à ce que le dépistage des médicaments n’ait pas les résultats escomptés34. Au contraire, les modèles in vitro offrent l’avantage d’être peu coûteux, d’avoir un cycle de détection rapide et de pouvoir être utilisés pour le dépistage à haut débit, ce qui peut mieux servir les objectifs de la recherche sur les maladies neurologiques. Avec le développement de la science et de la technologie, de plus en plus de modèles in vitro qui ressemblent étroitement à la structure physiologique de la BHE sont créés et améliorés. En plus de la distinction entre les techniques de simulation pour les plates-formes statiques et dynamiques, il existe des différences significatives dans les types et les nombres de cellules utilisées35. L’ensemencement des cellules endothéliales au fond de la chambre supérieure est le modèle de cellules BHE le plus simple et une excellente approche pour la cinétique de transport et la voie de signalisation cellulaire36. Les modèles de co-culture ajoutent des interactions avec les péricytes ou les cellules gliales à la base des cellules monocouches, mais ces modèles sont souvent limités par l’incapacité d’obtenir un positionnement précis des cellules et un contrôle dirigé12. Le modèle dynamique avec structure 2D et 3D est actuellement la représentation la plus précise du microenvironnement dynamique de la BHE in vitro ; Cependant, il est important de noter que le développement de ce modèle nécessite d’importants efforts de conception et de validation préalables. La sélection du modèle BHE approprié en fonction des besoins réels de la recherche permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus précis.

Les méthodes d’évaluation de l’intégrité fonctionnelle du modèle in vitro de la BHE comprennent généralement un test de perméabilité et un test de valeur de résistance transmembranaire. La première est principalement réalisée en évaluant la perméabilité des substances macromoléculaires marquées à la fluorescéine. La méthode est simple et précise, mais la structure de la couche cellulaire change après le passage de la substance fluorescente, ce qui entraîne une faible utilisation de l’échantillon37. Cette lacune est efficacement compensée par le développement de la méthode de détection TEER. Les deux électrodes ont été placées de part et d’autre de la couche cellulaire, et l’intégrité de la fonction barrière a été évaluée en mesurant la résistance au courant ionique à travers la barrière cellulaire38. La résistance totale a été soustraite de la résistance environnementale, telle que la résistance de la membrane de culture et la résistance moyenne, et multipliée par la surface de la membrane de culture pour obtenir la résistance finale à la BHE (TEER, Ωcm2)39. Une valeur plus élevée des valeurs TEER représente un degré plus élevé de jonctions serrées entre les cellules. La mesure TEER de l’opération est simple et non invasive, la fonction de barrière cellulaire une fois la résistance formée serait dans une plage stable. Cette fonction permet à l’opérateur de maintenir des valeurs TEER similaires même lors de l’utilisation d’instruments différents dans des conditions de fonctionnement standard. Seules la température et le placement de l’électrode nécessitent une attention particulière de la part de l’opérateur. L’augmentation de la température et le contact de l’électrode avec le fond diminueront la résistance de la cellule.

Dans cette étude, un modèle simple de cellules monocouches de BHE in vitro a été construit avec succès en évaluant la résistance temporelle des cellules bEnd.3 dans la chambre supérieure de la plaque. L’environnement hypoxique induit par CoCl2a perturbé la jonction étroite entre les cellules endothéliales, ce qui a considérablement réduit la TEER par rapport aux cellules normales. Selon cette expérience, le protocole décrit dans le processus standard de création d’un modèle de BHE in vitro a un taux de réussite et une répétabilité élevés. Seule la densité de semis doit être modifiée si cette expérience est réalisée avec des spécifications différentes des plaques de puits et que les niveaux de liquide dans les chambres supérieure et inférieure des plaques sont affleurants. Cependant, la valeur TEER sera quelque peu affectée par l’emplacement incorrect de l’électrode et l’hétérogénéité du champ électrique dans toute la couche cellulaire12. Dans la plupart des cas, la TEER sera confirmée simultanément par immunofluorescence et détection de perméabilité en fonction des exigences de l’étude des différents modèles de BHE. Ce modèle cellulaire sera amélioré à l’avenir afin d’éliminer les médicaments susceptibles de subir les dommages causés par l’hypoxie. En conclusion, l’utilisation de la technologie de détection TEER aura probablement un impact significatif sur la création de médicaments et de stratégies thérapeutiques pour les maladies neurologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274207 et 82104533), du programme clé de recherche et de développement du Ningxia (2023BEG02012) et du projet de promotion de la recherche Xinglin Scholar de l’Université de Chengdu de MTC (XKTD2022013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).

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