Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges und effizientes In-vitro-Modell der Blutschranke des Gehirns. Die Methode verwendet zerebrale vaskuläre Endothelzellen der Maus bEnd.3 und misst den elektrischen Widerstand der Transmembran.
Abstract
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine dynamische physiologische Struktur, die aus mikrovaskulären Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten besteht. Durch die Koordination der Wechselwirkung zwischen dem eingeschränkten Transit von Schadstoffen, der Nährstoffaufnahme und der Metaboliten-Clearance im Gehirn ist die BHS für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Zentralnervensystems unerlässlich. Die Erstellung von In-vitro-Modellen der BHS ist ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der Pathophysiologie neurologischer Erkrankungen und zur Entwicklung pharmakologischer Behandlungen. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Erstellung eines in vitro Monolayer-BHS-Zellmodells durch Aussaat von bEnd.3-Zellen in die obere Kammer einer 24-Well-Platte. Um die Integrität der Zellbarrierefunktion zu beurteilen, wurde das konventionelle Epithelzellvoltmeter verwendet, um den transmembranellen elektrischen Widerstand von normalen Zellen und CoCl 2-induzierten hypoxischen Zellen in Echtzeit aufzuzeichnen. Wir gehen davon aus, dass die oben genannten Experimente effektive Ideen für die Erstellung von In-vitro-Modellen für BHS und Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems liefern werden.
Introduction
BHS ist eine einzigartige biologische Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Nervengewebe, die aus vaskulären Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und anderen zellulären Strukturen besteht1. Der Fluss von Ionen, Chemikalien und Zellen zwischen Blut und Gehirn wird durch diese Barriere streng reguliert. Diese Homöostase schützt das Nervengewebe vor Toxinen und Krankheitserregern und ermöglicht gleichzeitig die entsprechende Funktion der Nerven des Gehirns 2,3. Die Aufrechterhaltung der Integrität der BHS kann die Entwicklung und das Fortschreiten von Störungen, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie z. B. neuronale Dysfunktion, Ödeme und Neuroinflammation, wirksam verhindern4. Die einzigartigen physiologischen Eigenschaften der BHS verhindern jedoch, dass mehr als 98 % der niedermolekularen Medikamente und 100 % der makromolekularen Arzneimittel in das zentrale Nervensystem gelangen5. Daher ist es für die Erzielung der therapeutischen Wirksamkeit unerlässlich, die Penetration von Medikamenten durch die BHS während der Entwicklung von Medikamenten für das zentrale Nervensystem zu erhöhen 6,7. Auch wenn das Computersimulations-Screening von Substraten die Wahrscheinlichkeit, dass Wirkstoffkandidaten die BHS überschreiten, erheblich erhöht hat, werden immer noch zuverlässige und erschwingliche In-vitro-/In-vivo-BHS-Modelle benötigt, um den Anforderungen der wissenschaftlichen Forschung gerecht zu werden8.
Eine schnelle und kostengünstige Technik für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening ist das In-vitro-Modell 9. Um die grundlegenden Prozesse der Auswirkungen von Medikamenten auf die BHS-Funktion und ihre Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krankheiten zu beleuchten, wurde eine Reihe vereinfachter In-vitro-BHS-Modelle erstellt. Gegenwärtig sind die üblichen In-vitro-BHS-Modelle die Monolayer-, Co-Kultur-, dynamischen und mikrofluidischen Modelle 10,11,12, die aus vaskulären Endothelzellen und Astrozyten, Perizyten oder Mikroglia 13,14 aufgebaut sind. Obwohl 3D-Zellkulturen eher der physiologischen Struktur von BHS15 entsprechen, ist ihre Anwendung als Mittel zum Wirkstoffscreening auf BHS immer noch durch ihr kompliziertes Design und ihre unterdurchschnittliche Reproduzierbarkeit eingeschränkt. Im Gegensatz dazu wird das Monolayer-In-vitro-Modell am häufigsten zur Erforschung der BHS verwendet und ist für die Bestimmung der Expression von Membrantransportern und Tight-Junction-Proteinen in bestimmten Zellen geeignet.
Die Messung des elektrischen Transmembranwiderstands (TEER) ist eine Technik zur Bewertung und Überwachung der Zellschicht über dem Widerstand und zur Bewertung der Zellintegrität und Durchlässigkeit der Barriere. Durch gleichzeitiges Einführen von zwei Elektroden in das Wachstumsmedium oder die Pufferlösung auf beiden Seiten der Monoschicht ist es möglich, den Wechselstrom oder die elektrische Impedanz durch die kompakte Schicht16,17 der Zelle zu messen. Um festzustellen, ob das In-vitro-BHS-Modell ordnungsgemäß erstellt wurde, wird in der Regel die Messung der TEER als Goldstandard verwendet18. Auf der anderen Seite kann der Trend der medikamentösen Wirkung auf die BHS-Permeabilität genau vorhergesagt werden, indem die Änderung des elektrischen Widerstands der Zellschicht nach Arzneimittelbeteiligung gemessen wird19. Zum Beispiel entdeckten Feng et al., dass Catalpol (das primäre aktive Monomer von Rehmanniae) die Lipopolysaccharid-induzierte Herunterregulierung von Tight-Junction-Proteinen in der BHS effektiv umkehren und den TEER-Wert der Endothelzellschicht des Mäusegehirns20 erhöhen kann.
Die neuroinflammatorische Reaktion ist in der Regel die Hauptursache für ein Ungleichgewicht der BHS-Homöostase21. Die hypoxische Behandlung zur Induktion neuroinflammatorischer Schäden ist die Hauptmethode zur Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, hauptsächlich mit physikalischen Methoden und chemischen Reagenzien. Ersteres verwendet in erster Linie einen Drei-Gas-Inkubator, um den Sauerstoffgehalt in der Zellwachstumsumgebung zu variieren, um hypoxische Bedingungen zu simulieren22, während letzteres durch künstliches Einbringen von Desoxyreagenzien wie CoCl2in das Zellkulturmedium23 erreicht wird. Die Zellen bleiben in einem sauerstoffarmen Zustand, wenn Fe2+ durch Co2+ im Häm ersetzt wird. Wenn Fe2+ in der katalytischen Gruppe durch Co2+ ersetzt wird, wird die Aktivität der Prolinhydroxylase und der Aspartathydroxylase gehemmt, was zu einer Akkumulation des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α (HIF-1α)24 führt. Bei anhaltender Hypoxie löst die Dephosphorylierung von HIF-1α im Zytoplasma den Zelltod aus und aktiviert den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, der letztendlich die Gefäßpermeabilität erhöht. In früheren Studien 25,26 wurde gut gezeigt, dass Hypoxie die Expression von endothelialen Tight-Junction-Proteinen signifikant reduzieren kann, um die Permeabilität der BHS zu erhöhen. In dieser Studie wurde die Zeit-Widerstands-Kurve von bEnd.3-Zellen gemessen, die in 24-Well-Platten ausgesät wurden, um ein einfaches BHS-Modell zu erstellen. Mit Hilfe dieses Modells haben wir die Veränderungen der Zell-TEER nach CoCl2-Intervention charakterisiert, um ein Zellmodell zu konstruieren, das für das Screening von Medikamenten auf BHS-Schutz verwendet werden kann.
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Protocol
ANMERKUNG: Aus dem Gehirn von Mäusen gewonnene Endothelzellen.3 (bEnd.3) wurden in die Kammern einer 24-Well-Platte inokuliert, um ein einfaches In-vitro-Modell der BHS unter bestimmten Mediumbedingungen zu konstruieren. Die TEER von normalen Zellen und hypoxischen Zellen wurden mit einem TEER-Messgerät gemessen (Abbildung 1 und Abbildung 2).
1. Vorbereitung der Lösung
- Bereiten Sie das DMEM-Zellkulturmedium vor, das FBS (10 %, v/v), 100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin enthält (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie 100 mM CoCl2 Stammlösung vor, indem Sie 1,30 mg CoCl2 zu 100 μl DMSO-Lösung hinzufügen.
ANMERKUNG: Alle oben genannten Lösungen wurden bei 4 °C gelagert, und die Stammlösung wurde vor der Verwendung entsprechend der gewünschten Konzentration verdünnt. - Bereiten Sie 5%ige Natriumhypochloritlösung (v/v) vor, indem Sie 2 ml Natriumhypochloritlösung zu 38 ml doppelt destilliertem Wasser hinzufügen.
2. Zellkultur und Zelllebensfähigkeit
- 1 ml bEnd.3-Zellen in einer Kulturschale (100 mm) mit DMEM-Medium mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml und einer Kultur bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 %CO2 aussäen. Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage und subkultivieren Sie die Zellen 2x pro Woche.
- Nachdem die Zellen auf 80 % Konfluenz angewachsen sind, verdauen Sie die Zellen 30 s lang mit 0,25 % Trypsin.
- Stellen Sie eine Suspension aus bEnd.3-Zellen mit einer Dichte von 7 x 104 Zellen/ml unter Verwendung von DMEM-Medium durch einen Zellzähler her. Säen Sie dann 100 μl bEnd.3-Zellsuspension in eine 96-Well-Platte.
- Nach der Zelladhäsion werden die Zellen mit PBS gereinigt und die Zellen mit 100 μl Kulturmedium oder arzneimittelhaltigem Medium (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) für 24 h unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Nachdem Sie das Medium aus dem Inneren der Well-Platte entfernt und mit PBS gereinigt haben, fügen Sie 100 μl CCK-8-Lösung hinzu.
HINWEIS: Erzeugen Sie keine Blasen in der Vertiefung, die die Werte der optischen Dichte (OD) beeinträchtigen. - 96-Well-Platten bei 37 °C platzieren und 1 h inkubieren. Messen Sie die Absorption der 96-Well-Platten bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
HINWEIS: Um Unterschiede innerhalb der Gruppe zu vermeiden, wurden die Well-Platten vor der Detektion auf Raumtemperatur abgekühlt. - Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit, die durch verschiedene Konzentrationen von CoCl2 induziert wird, gemäß der Formel [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Wählen Sie für das nächste Experiment die CoCl2-Konzentration mit einem signifikanten Unterschied in der Reduktion der Zellviabilität im Vergleich zur Kontrollgruppe.
3. Zusammenbau des Modells
- Spülen Sie die obere Kammer der 24-Well-Platten mit PBS.
HINWEIS: Die Zellen wuchsen und verschmolzen am Boden der oberen Kammer der 24-Well-Platte, und es bildeten sich allmählich Tight Junctions zwischen den Zellen, die eine Barriererolle spielten. Wenn die in einigen Studien verwendeten Endothelzellen nicht in der Lage sind, selbstständig eine vollständige Barriere auf PET-Membranen zu bilden, müssen die Membranen vor der Zellinokulation mit Kollagen-IV-Lösung beschichtet werden. - Mischen Sie die bEnd.3-Zellen mit DMEM-Medium, um mit einem Vortex-Mischer eine Suspension mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen/ml herzustellen. Säen Sie dann 200 μl bEnd.3-Zellsuspension auf die PET-Membran in der oberen Kammer einer 24-Well-Platte (0,33 cm2, 0,4 μm Membranporengröße).
HINWEIS: Die Pilotstudie dieses Protokolls ergab keinen Unterschied in den Ergebnissen, wenn 5 bis 10 Passagen von bEnd.3-Zellen für Experimente verwendet wurden. Um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Modellierung zu gewährleisten, beachten Sie bitte das Zellzahlintervall dieses Protokolls. - Geben Sie 1200 μl des kompletten Mediums in die untere Kammer der Platte, um sicherzustellen, dass sich der osmotische Druck der oberen und unteren Kammer tendenziell stabilisiert. Je nach Typ gibt es Unterschiede in der Menge des zugegebenen Mediums; Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand der oberen und unteren Kammer bündig ist.
- Wechseln Sie täglich das Medium der oberen und unteren Kammer zu einer festgelegten Zeit und überwachen Sie gleichzeitig den Widerstandswert.
- Beim Wechsel des Mediums wird die Integrität der Zellschicht durch künstliche Berührung oder übermäßige Bewegung beschädigt. Um die oben genannte Situation zu vermeiden, entfernen Sie das alte Medium langsam von einer Seite mit einer Unterdruckpipette und fügen Sie während des Flüssigkeitsaustauschs langsam ein neues Medium entlang der Wand hinzu.
4. Messung des TEER
- Bevor Sie mit der Arbeit beginnen, stellen Sie den Widerstand, die 5%ige Natriumhypochloritlösung, das 75%ige Ethanol und die doppelt destillierte Wasserlösung auf einen hochreinen Tisch. Schalten Sie die UV-Bestrahlung für 30 Minuten ein, um Restbakterien und Krankheitserreger zu entfernen.
- Legen Sie die Elektroden in eine 5%ige Natriumhypochloritlösung mit langsamem Schütteln für 3 s bis 5 s und tauchen Sie dann 15 Minuten lang in 75%iges Ethanol ein. Zum Schluss bis zur Verwendung in PBS oder doppelt destillierte Wasserlösung überführen.
- Schalten Sie den Schalter auf der Rückseite des Zellwiderstandsmessgeräts ein, klicken Sie gemäß den Parametern in Tabelle 1 auf Platte auswählen und wählen Sie 24-Well-Platte.
- Wählen Sie je nach Operationsanforderung die geeignete Erkennungssequenz aus. Wir haben uns in dieser Studie für das A1-Verfahren entschieden.
- Stecken Sie einen kΩ-Widerstand in den rechten Stecker, um das Gerät zu kalibrieren. Wenn das Kalibrierungsergebnis 1000 ± 5 Ω beträgt, betrachten Sie die Genauigkeit des Geräts als normal.
- Wenn das Kalibrierungsergebnis nicht 1000 Ω beträgt, klicken Sie auf der Hauptschnittstelle auf Moduseinheiten , um OHMS auszuwählen, und klicken Sie dann auf dem Hauptbildschirm auf Kalibrieren , um das Gerät erneut zu kalibrieren.
- Ziehen Sie den kΩ-Widerstand auf der rechten Seite heraus und ersetzen Sie die Messelektrode durch ein Verbindungskabel.
- Legen Sie die Elektrode in die 24-Well-Platte, ohne Zellen vertikal zu impfen, und klicken Sie auf dem Hauptbildschirm des Geräts auf Blank Handling . Der Hintergrundwert des Plattenwiderstandes ohne gekeimte Zellen beträgt etwa 134,4 Ω.
- Führen Sie die beiden Elektroden in die obere und untere Kammer der besäten Platte mit den Zellen ein, so dass sich die Zellschicht dazwischen befindet, und notieren Sie dann den Widerstandswert, indem Sie vorsichtig auf das Pedal treten.
- Achten Sie darauf, dass die Elektrode die Zellen in der oberen Kammer und den Boden der unteren Kammer nicht berührt. Die Einweichzeit der Elektrode in der Lösung hat keinen Einfluss auf den Widerstandswert, und es muss nur sichergestellt werden, dass sich die Elektrode in der richtigen Position befindet.
- Die TEER-Werte (Ωcm2) erhalten Sie, indem Sie die elektrischen Widerstandswerte (Ohm) mit dem unteren Bereich (cm2) der oberen Kammer multiplizieren, wie in der Gleichung dargestellt:
TEER (Ωcm2) = Widerstand (Ω) xS-Einsatz (cm 2) - Zeichnen Sie ein Liniendiagramm der TEER-Zeit (in Tagen). Wenn der Widerstandswert mit der Zeit nicht weiter ansteigt (gemessen über Tage), betrachten Sie die Zelle als Barriere.
NOTW: Das monolayerige BHS-Modell von bEnd.3-Zellen wird erfolgreich konstruiert, indem bEND.3-Zellen mit den Parametern in dieser Studie für etwa 6 Tage kultiviert werden. Die TEER des bEnd.3-Zell-Monolayer-Modells reichte von 16,49 ± 2,12Ωcm2 bis 27,59 ± 1,50 Ωcm2 innerhalb von 6 Tagen (n=8, Mittelwert ± SD).
5. Barrierezerstörung und statistische Analyse
- Entsprechend der TEER - Zeitkurve wählen Sie die Wells mit Barrierefunktion aus und teilen sie in die Kontrollgruppe und die CoCl2-Gruppe (n = 4) ein.
- Das Nährmedium und das Nährmedium, das 300 μMCoCl2 (200 μl) enthält, werden in die obere Kammer der Kontrollgruppe bzw. der CoCl2-Gruppegegeben .
- Die Widerstandswerte der Kontroll- und CoCl2-Gruppen werden nach 12 h und 24 h Inkubation bei 37 °C mit dem in Schritt 4 beschriebenen Verfahren ermittelt.
- Verwenden Sie kommerzielle Software, um den Trend der TEER-Werte der Barriere von Zellen abzubilden, die mit oder ohne 300 μM CoCl2 kultiviert wurden.
- Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um den Unterschied in den Resistenzwerten zwischen CoCl2-behandelten Zellen und normalen Zellen zu analysieren (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
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Representative Results
Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung von Änderungen der Widerstandswerte von Zellen gemäß den im transendothelialen Widerstandsmessgerät eingestellten Parametern. Die Viabilität von bEnd.3-Zellen (Anzahl der lebenden Zellen), die mit unterschiedlichen Konzentrationen von CoCl2 behandelt wurden, wurde mittels CCK-8-Assay untersucht. Eine größere Zellschädigung durch CoCl2 wurde durch eine geringere Zelllebensfähigkeit repräsentiert. Wir fanden heraus, dass 300 μM CoCl2 in vitro signifikant zytotoxischwaren, und diese Konzentration wurde für die nächsten Experimente verwendet (Abbildung 3A). Durch die Überwachung der Veränderungen der Wachstumsresistenz in bEnd.3 stellten wir fest, dass sich die TEER-Werte der Zellen am 5. Tag zu stabilisieren begannen. Eine hypoxische Verletzung, die durch die Zugabe von 300 μM CoCl2 in die obere Kammer der Platte am 6. Tag induziert wurde, führte zu einer signifikanten Abnahme der TEER-Werte im Vergleich zur Kontrolle sowohl zu den 12-Stunden- als auch zu den 24-Stunden-Zeitpunkten (Abbildung 3B). Die Funktion der Zellbarriere kann indirekt durch den TEER-Wert beurteilt werden, und ein Abfall des TEER-Wertes deutet auf den Zusammenbruch der Zellbarriere hin. Der TEER-Wert der 300 μM CoCl2-Gruppe sank im Vergleich zur Kontrollgruppe nach 24-stündiger Inkubation (Abbildung 3C). Die oben erwähnte Forschung zeigte, dass eine Schädigung des BHS-In-vitro-Modells durch eine hypoxische Umgebung verursacht werden kann, die durch CoCl2 verursacht wird.
Abbildung 1: Instrumente und Zubehör zur Messung von TEER. (A-B) Bedienung der Hauptschnittstelle des TEER-Messgeräts. (C-D) Eine 24-Well-Platte. (E) Die für die Reinigung und Desinfektion der Elektroden erforderliche Lösung. (F) Für die Kalibrierung des TER-Messgeräts ist ein Standardwiderstand erforderlich. (G-H) Die Elektrode und die lokale Vergrößerung. (I) Zur Datenerfassung wurde das Fußpedal verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Flussdiagramme des Transmembranwiderstands von bEnd.3-Zellen, aufgezeichnet mit einem transendothelialen Widerstandsmessgerät. (A) Zellkultur. (B) Die bEnd.3-Zellen wurden in der oberen Kammer der Platten ausgesät, und eine dichte Zellbarriere wurde gebildet, indem die Well-Platten mit Medium gefüllt wurden, um ihr Wachstum und ihre Differenzierung zu unterstützen. (C) Die funktionelle Barriereintegrität der Zellen wurde durch TEER-Monitoring bewertet. (D) CoCl2 wurde verwendet, um die hypoxische Umgebung nachzuahmen, um eine beeinträchtigte Zellbarrierefunktion zu induzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Salidrosid erhält die Integrität der Barrierefunktion von bEnd.3-Zellen, indem es die CoCl 2-induzierte hypoxische Schädigung lindert. (A) Wirkung von CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) auf die Lebensfähigkeit von bEnd.3-Zellen (n=6, CoCl2-Gruppe vs. Kontrollgruppe ***p<0,001, Mittelwert ± SD). (B) Darstellung der Veränderungen der TEER-Werte von bEnd.3-Zellen, die mit normalem Medium oder 300 μM CoCl2 behandelt wurden (n=4, Tag 1 vs. Tag 2-6: ##p<0,01, ###p<0,001, Tag 6 vs. Tag 6,5 - 7: **p<0,01, Mittelwert ± SD). (C) TEER-Veränderungen der Zellen nach 24-stündiger hypoxischer Schädigung (n=4, CoCl2-Gruppe vs. Kontrollgruppe ***p<0,001, Mittelwert ± SD). Es wurden eine Einweg-ANOVA und ein Tukey-Test durchgeführt, und p<0,05 wurde als signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Parameter | Option |
| Platte auswählen | 24-Well-Gehäuse |
| Reihenfolge der Detektion | DIN A1 |
| Modus-Einheiten | Ω |
| Standard-Widerstand | 1 kΩ |
Tabelle 1: Stellen Sie die Parameter des TER-Messgeräts ein. Die Parametereinstellungen und die Programmauswahl des Gerätes sind für die Detektion des Zellwiderstands erforderlich.
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Discussion
Das Gehirn ist eines der am weitesten entwickelten Körperorgane und steuert eine Vielzahl komplizierter physiologischer Prozesse, darunter Gedächtnis, Kognition, Hören, Riechen und Bewegung27. Das Gehirn ist eines der kompliziertesten und zugleich am meisten erkrankten Organe des menschlichen Körpers. Das Auftreten vieler Erkrankungen des Zentralnervensystems zeigt eine wachsende Tendenz von Jahr zu Jahr, was auf Faktoren wie Luftverschmutzung, unregelmäßiges Essverhalten und andere Faktoren zurückzuführenist 27,28,29. Es ist interessant, dass der Beginn und das Fortschreiten einiger Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie Schlaganfall, Epilepsie und Alzheimer (AD), eng mit dem Wachstum von BHS 30,31,32 korrelieren. Das Grundkonzept für die Behandlung der meisten Erkrankungen mit Hirnfunktionsstörungen kann die Entwicklung neuer Therapien oder Medikamente zur Aufrechterhaltung der funktionellen Homöostase der BHS sein. Leider können die meisten Arzneimittel aufgrund der Hydrophobizität der BHS und ihrer einzigartigen Transportmethode für gelöste Stoffe nicht in das Gehirnparenchym gelangen, um ihre lebenswichtigen Funktionen zu erfüllen14,33. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass ein Medikament erfolgreich ist, ist es eine gute Strategie, neue BHS-Modelle zu entwickeln, die für das molekulare Hochdurchsatz-Screening verwendet werden können.
Aufgrund der komplizierten Struktur der neurovaskulären Einheit hat das in vivo Modell theoretisch einen höheren Grad an Modellierung der BHS-Struktur. Aufgrund der Einschränkung der Homologie zwischen Tieren und Menschen können die Varianzen der BHS-Transporter jedoch dazu führen, dass das Medikationsscreening nicht das erwartete Ergebnis erzielt34. Im Gegenteil, In-vitro-Modelle bieten den Vorteil, dass sie kostengünstig sind, einen schnellen Nachweiszyklus haben und für das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden können, was den Zielen der Erforschung neurologischer Erkrankungen besser dienen kann. Mit der Entwicklung von Wissenschaft und Technologie werden immer mehr In-vitro-Modelle erstellt und verbessert, die der physiologischen Struktur der BHS sehr ähnlich sind. Neben der Unterscheidung zwischen Simulationstechniken für statische und dynamische Plattformen gibt es signifikante Unterschiede bei den verwendeten Zelltypen und -zahlen35. Die Aussaat von Endothelzellen am Boden der oberen Kammer ist das einfachste BHS-Zellmodell und ein ausgezeichneter Ansatz für die Transportkinetik und den Zellsignalweg36. Co-Kulturmodelle fügen Interaktionen mit Perizyten oder Gliazellen auf der Grundlage von Monolayer-Zellen hinzu, aber diese Modelle sind häufig durch die Unfähigkeit eingeschränkt, eine genaue Zellpositionierung und eine gerichtete Kontrolle zu erhalten12. Das dynamische Modell mit 2D- und 3D-Struktur ist derzeit die genaueste Darstellung der dynamischen Mikroumgebung von BHS in vitro; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Entwicklung dieses Modells einen umfangreichen vorherigen Entwurfs- und Validierungsaufwand erfordert. Durch die Auswahl des richtigen BHS-Modells in Übereinstimmung mit den tatsächlichen Anforderungen der Forschung können genauere experimentelle Ergebnisse erzielt werden.
Die Bewertungsmethoden der funktionellen Integrität des BHS-In-vitro-Modells umfassen in der Regel einen Permeabilitätstest und einen Transmembranwiderstandswerttest. Ersteres wird hauptsächlich durch die Bewertung der Permeabilität von Fluorescein-markierten makromolekularen Substanzen erreicht. Die Methode ist unkompliziert und präzise, aber die Struktur der Zellschicht ändert sich nach dem Durchgang der fluoreszierenden Substanz, was zu einer geringen Probenausnutzung führt37. Dieser Mangel wird durch die Entwicklung der TEER-Nachweismethode effektiv ausgeglichen. Die beiden Elektroden wurden auf beiden Seiten der Zellschicht platziert, und die Integrität der Barrierefunktion wurde durch Messung des Ionenstromwiderstands über die Zellbarriere38 bewertet. Der Gesamtwiderstand wurde vom Umweltwiderstand, wie z. B. dem Kulturmembranwiderstand und dem Mediumswiderstand, abgezogen und mit der Fläche der Kulturmembran multipliziert, um den endgültigen BHS-Widerstand (TEER, Ωcm2)39 zu erhalten. Ein höherer Wert der TEER-Werte stellt einen höheren Grad an Tight Junctions zwischen den Zellen dar. Die TEER-Messung der Operation ist einfach und nicht-invasiv, die Zellbarrierefunktion nach der Bildung einer Resistenz wäre in einem stabilen Bereich. Diese Funktion ermöglicht es dem Bediener, ähnliche TEER-Werte beizubehalten, auch wenn er verschiedene Geräte unter Standardbetriebsbedingungen verwendet. Lediglich die Temperatur und die Platzierung der Elektrodeneinführung erfordern besondere Aufmerksamkeit des Bedieners. Der Temperaturanstieg und die Berührung der Elektrode mit dem Boden verringern den Zellwiderstand.
In dieser Studie wurde erfolgreich ein einfaches BHS-Monolayer-Zellmodell in vitro konstruiert, indem der zeitliche Widerstand von bEnd.3-Zellen in der oberen Kammer der Platte untersucht wurde. Die durch CoCl2induzierte hypoxische Umgebung störte die Tight Junction zwischen den Endothelzellen, was die TEER im Vergleich zu normalen Zellen signifikant reduzierte. Nach diesem Experiment hat das im Standardverfahren beschriebene Protokoll zur Erstellung eines In-vitro-BHS-Modells eine hohe Erfolgsrate und Wiederholbarkeit. Lediglich die Aussaatdichte muss verändert werden, wenn dieses Experiment mit unterschiedlichen Well-Plattenspezifikationen durchgeführt wird und die Flüssigkeitsstände in der oberen und unteren Kammer der Platten bündig sind. Der TEER-Wert wird jedoch durch die falsche Position der Elektrode und die Heterogenität des elektrischen Feldes in der gesamten Zellschicht12 etwas beeinflusst. In den meisten Fällen wird TEER gleichzeitig durch Immunfluoreszenz- und Permeabilitätsdetektion bestätigt, abhängig von den Studienanforderungen verschiedener BHS-Modelle. Dieses Zellmodell soll in Zukunft verbessert werden, um Medikamente herauszufiltern, die die durch Hypoxie verursachten BHS-Schäden verursachen können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Einsatz der TEER-Detektionstechnologie wahrscheinlich einen erheblichen Einfluss auf die Entwicklung von Medikamenten und Therapiestrategien für neurologische Erkrankungen haben wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir freuen uns über die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Foundation of China (82274207 und 82104533), des Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) und des Xinglin Scholar Research Promotion Project der Chengdu University of TCM (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
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