Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65938
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 4, 1,2, 1,2,5, 2
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מבנה פיזיולוגי דינמי המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, אסטרוציטים ופריציטים. על-ידי תיאום האינטראקציה בין מעבר מוגבל של חומרים מזיקים, ספיגת חומרים מזינים וסילוק מטבוליטים במוח, מחסום הדם-מוח חיוני לשימור הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. בניית מודלים חוץ גופיים של BBB היא כלי רב ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירולוגיות ויצירת טיפולים תרופתיים. מחקר זה מתאר הליך ליצירת מודל תאי BBB חד-שכבתי במבחנה על ידי זריעת תאי bend.3 לתוך החדר העליון של צלחת בעלת 24 בארות. כדי להעריך את שלמות תפקוד מחסום התא, נעשה שימוש במד מתח תאי אפיתל קונבנציונלי כדי לרשום את ההתנגדות החשמלית הטרנסממברנה של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים המושרים על ידי CoCl2 בזמן אמת. אנו צופים כי הניסויים הנ"ל יספקו רעיונות יעילים ליצירת מודלים חוץ גופיים של BBB ותרופות לטיפול בהפרעות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

Introduction

BBB הוא ממשק ביולוגי ייחודי בין מחזור הדם לרקמת העצב, המורכב מתאי אנדותל וסקולריים, פריציטים, אסטרוציטים, נוירונים ומבנים תאיים אחרים1. זרימת היונים, הכימיקלים והתאים בין הדם למוח מווסתת בקפדנות על ידי מחסום זה. הומאוסטזיס זה מגן על רקמות העצבים מפני רעלים ופתוגנים תוך שהוא מאפשר פעולה מתאימה של עצבי המוח 2,3. שמירה על שלמות BBB יכולה למנוע ביעילות התפתחות והתקדמות של הפרעות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כגון תפקוד עצבי, בצקת ודלקת עצבית4. עם זאת, התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של BBB מונעות מיותר מ-98% מהתרופות במולקולות קטנות ומ-100% מהתרופות המקרומולקולאריות להיכנס למערכת העצבים המרכזית5. לכן, הגברת החדירה של תרופות דרך BBB במהלך פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית חיונית להשגת יעילות טיפולית 6,7. אף על פי שסימולציה ממוחשבת של מצעים העלתה באופן משמעותי את ההסתברות של מועמדים לתרופות לחצות את מחסום הדם-מוח, עדיין נדרשים מודלים אמינים ובמחיר סביר של BBB in vitro/in vivo כדי לענות על צרכי המחקר המדעי8.

טכניקה מהירה ומשתלמת לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה היא מודל 9 במבחנה. כדי לשפוך אור על התהליכים הבסיסיים של השפעות התרופות על תפקוד BBB וחלקם בהתפתחות והתקדמות המחלה, נוצרה סדרה של מודלים פשוטים של BBB במבחנה. כיום, המודלים הנפוצים של BBB במבחנה הם מודלים חד-שכבתיים, תרבית משותפת, דינמיים ומיקרופלואידים 10,11,12, שנבנו על ידי תאי אנדותל וסקולריים ואסטרוציטים, פריציטים או מיקרוגליה 13,14. למרות שתרביות תאים תלת-ממדיות תואמות יותר את המבנה הפיזיולוגי של BBB15, היישום שלהן כאמצעי לסינון תרופות עבור BBB עדיין מוגבל על ידי העיצוב המורכב שלהן ויכולת השחזור שלהן. לעומת זאת, המודל החד-שכבתי במבחנה הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר BBB והוא ישים לקביעת הביטוי של מובילי ממברנות וחלבוני צומת הדוקים בתאים מסוימים.

מדידת התנגדות חשמלית טרנסממברנה (TEER) היא טכניקה להערכה וניטור של שכבת התאים על פני ההתנגדות והערכת שלמות התא וחדירות המחסום. על ידי החדרה בו זמנית של שתי אלקטרודות למדיום הגידול או לתמיסת החיץ משני צדי החד-שכבה, ניתן למדוד את זרם החילופין או העכבה החשמלית דרך השכבה הקומפקטית16,17 של התא. על מנת לקבוע אם מודל BBB במבחנה נוצר כראוי, המדידה של TEER תשמש בדרך כלל כתקן זהב18. מצד שני, ניתן לחזות במדויק את מגמת הפעולה התרופתית על חדירות BBB על ידי מדידת השינוי בהתנגדות החשמלית של שכבת התא לאחר מעורבות סמים19. לדוגמה, פנג ועמיתיו גילו כי קטלפול (המונומר הפעיל העיקרי של rehmanniae) יכול להפוך ביעילות את הוויסות כלפי מטה המושרה על ידי ליפופוליסכריד של חלבוני צומת הדוקים ב- BBB ולהעלות את ערך TEER של שכבת תאי אנדותל במוח העכבר20.

התגובה הנוירו-דלקתית היא בדרך כלל הגורם העיקרי לחוסר איזון בהומאוסטזיס BBB21. טיפול היפוקסי לגרימת פגיעה נוירו-דלקתית הוא השיטה העיקרית להרוס את מחסום הדם-מוח, בעיקר כולל שיטות פיזיות ושיטות ריאגנטים כימיים. הראשון משתמש בעיקר באינקובטור של שלושה גזים כדי לשנות את תכולת החמצן בסביבת גידול התאים כדי לדמות תנאים היפוקסיים22, ואילו האחרון מושג על ידי החדרה מלאכותית של ריאגנטים deoxy כגון CoCl2 למדיום תרבית התא23. התאים יישארו במצב לא מחומצן אם Fe2+ יוחלף ב- Co2+ ב- heme. אם Fe2+ מוחלף ב- Co2+ בקבוצה הקטליטית, פעילות הידרוקסילאז פרולין והידרוקסילאז אספרטט יעוכבו, וכתוצאה מכך הצטברות של גורם השראת היפוקסיה-1α (HIF-1α)24. תחת היפוקסיה מתמשכת, dephosphorylation של HIF-1α בציטופלסמה מעורר מוות התא ומפעיל גורם גדילה אנדותל כלי הדם, אשר בסופו של דבר מעלה חדירות כלי הדם. במחקרים קודמים 25,26, הוכח היטב כי היפוקסיה יכולה להפחית באופן משמעותי את הביטוי של חלבוני צומת הדוק אנדותל כדי להגדיל את החדירות של BBB. במחקר זה נמדדה עקומת התנגדות הזמן של תאי bend.3 שנזרעו בלוחות של 24 בארות על מנת ליצור מודל BBB פשוט. באמצעות מודל זה, אפיינו את השינויים ב-TEER התא לאחר התערבות CoCl2 על מנת לבנות מודל תאי שניתן להשתמש בו כדי לסנן תרופות להגנה מפני BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: תאי אנדותל שמקורם במוח עכבר.3 (bBend.3) חוסנו לתוך תאים של צלחת בת 24 בארות כדי לבנות מודל פשוט במבחנה של BBB בתנאים בינוניים ספציפיים. ה-TEER של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים נמדד על-ידי מד TEER (איור 1 ואיור 2).

1. הכנת פתרון

  1. הכינו את מדיום תרבית תאי DMEM המכיל FBS (10%, v/v), 100 U/mL פניצילין וסטרפטומיצין 10 מ"ג/מ"ל (ראו טבלת חומרים).
  2. הכן תמיסת מלאי CoCl2 של 100 מ"מ על ידי הוספת תמיסת CoCl2 עד 100 מיקרוליטר DMSO של 1.30 מ"ג.
    הערה: כל התמיסות הנ"ל אוחסנו במצב של 4 מעלות צלזיוס, ותמיסת המלאי דוללה בהתאם לריכוז הרצוי לפני השימוש.
  3. הכן תמיסת 5% נתרן היפוכלוריט (v/v) על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט ל 38 מ"ל של מים מזוקקים כפול.

2. תרבית תאים וכדאיות התא

  1. זרע 1 מ"ל של bend.3 תאים בצלחת תרבית (100 מ"מ) המכיל מדיום DMEM בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל ותרבית ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2. שנה את המדיום כל 2 עד 3 ימים ותת-תרבית את התאים 2 פעמים בשבוע.
  2. לאחר bend.3 תאים לגדול 80% מפגש, לעכל את התאים עם 0.25% טריפסין במשך 30 שניות.
  3. בצע השעיה של bend.3 תאים בצפיפות של 7 x 104 תאים/מ"ל באמצעות תווך DMEM דרך מונה תאים. לאחר מכן, זרעו 100 μL של bend.3 השעיית תאים בצלחת של 96 בארות.
  4. לאחר היצמדות התא, נקו את התאים עם PBS ותרביתו את התאים עם 100 μL של מדיום תרבית או מדיום המכיל תרופות (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) במשך 24 שעות באותם תנאים. לאחר הסרת המדיום בתוך צלחת הבאר וניקוי עם PBS, להוסיף 100 μL של תמיסת CCK-8.
    הערה: אין ליצור בועות בבאר, אשר ישפיעו על ערכי הצפיפות האופטית (OD).
  5. שים צלחות 96 בארות בסביבה של 37 מעלות צלזיוס ודגור במשך שעה אחת. מדוד את הספיגה של לוחות 96 בארות ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplates.
    הערה: כדי למנוע הבדלים בתוך הקבוצה, לוחות הבאר צוננו לטמפרטורת החדר לפני הגילוי.
  6. חשב את כדאיות התא המושרה על ידי ריכוזים שונים של CoCl2 בהתאם לנוסחה [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. בחר את ריכוז CoCl2 עם הבדל משמעותי בהפחתת כדאיות התא בהשוואה לקבוצת הביקורת לניסוי הבא.

3. הרכבת דגם

  1. שטפו את החדר העליון של צלחות 24 הבארות עם PBS.
    הערה: תאים גדלו והתמזגו בתחתית החדר העליון של צלחת 24 בארות, וצמתים הדוקים בין תאים נוצרו בהדרגה כדי למלא תפקיד מחסום. אם תאי האנדותל ששימשו במחקרים מסוימים אינם מסוגלים ליצור מחסום מלא על קרומי PET באופן עצמאי, נדרש ציפוי הקרומים בתמיסת קולגן IV לפני חיסון התא.
  2. ערבבו את תאי bend.3 עם מדיום DMEM ליצירת תרחיף בצפיפות של 5 x 105 תאים/מ"ל באמצעות מערבל מערבולת. לאחר מכן, זרע 200 μL של bend.3 השעיית תאים על קרום PET בחדר העליון של צלחת 24 בארות (0.33 ס"מ2, 0.4 מיקרומטר גודל נקבוביות הממברנה).
    הערה: מחקר הפיילוט של פרוטוקול זה לא מצא הבדל בתוצאות בעת שימוש ב-5 עד 10 מעברים של תאי bend.3 לניסויים. כדי להבטיח את ההסתברות למידול מוצלח, עיין במרווח מספר התא של פרוטוקול זה.
  3. הוסף 1200 μL של תווך שלם לתא התחתון של הצלחת כדי להבטיח שהלחץ האוסמוטי של החדרים העליונים והתחתונים נוטה להתייצב. ישנם הבדלים בנפח המדיום שנוסף בהתאם לסוג; ודא כי רמת הנוזל של החדרים העליונים והתחתונים הוא סמוק.
  4. שנה את התווך של החדר העליון והחדר התחתון בשעה קבועה בכל יום ועקוב אחר ערך ההתנגדות בו זמנית.
    1. בעת שינוי המדיום, שלמות שכבת התא תיפגע על ידי מגע מלאכותי או תנועה מוגזמת. כדי למנוע את המצב הנ"ל, לאט להסיר את המדיום הישן מצד אחד עם פיפטה לחץ שלילי ולאט לאט להוסיף מדיום חדש לאורך הקיר במהלך חילופי נוזלים.

4. מדידת TEER

  1. לפני תחילת העבודה, הניחו את הנגד, תמיסת 5% נתרן היפוכלוריט, 75% אתנול ותמיסת מים מזוקקים כפולה בשולחן נקי במיוחד. הפעל את הקרנת UV למשך 30 דקות כדי לחסל שאריות חיידקים ופתוגנים.
  2. מניחים את האלקטרודות בתמיסת 5% נתרן היפוכלוריט עם ניעור איטי במשך 3 שניות עד 5 שניות, ולאחר מכן טובלים באתנול 75% למשך 15 דקות. לבסוף, יש להעביר ל-PBS או לתמיסת מים מזוקקים פעמיים עד לשימוש.
  3. הפעל את המתג בגב מד נגדי התא, לחץ על בחר צלחת בהתאם לפרמטרים בטבלה 1 ובחר צלחת 24 בארות.
  4. בהתאם לצרכי הפעולה, בחר את רצף הזיהוי המתאים. בחרנו הליך A1 במחקר זה.
  5. הכנס נגד kΩ לתקע הימני כדי לכייל את המכשיר. אם תוצאת הכיול היא 1000 ± 5 Ω, שקול את דיוק המכשיר כתקין.
    1. אם תוצאת הכיול אינה 1000 Ω, לחץ על יחידות מצב בממשק הראשי כדי לבחור OHMS, ולאחר מכן לחץ על כיול במסך הראשי כדי לכייל מחדש את המכשיר.
  6. משוך את נגד kΩ בצד ימין והחלף את אלקטרודת המדידה בחוט חיבור.
  7. מקם את האלקטרודה בלוח 24 הקידוחים מבלי לזרוע תאים אנכית ולחץ על טיפול ריק במסך הראשי של המכשיר. ערך הרקע של עמידות הצלחת ללא תאי זרע הוא כ 134.4 Ω.
  8. הכנס את שתי האלקטרודות לחדרים העליונים והתחתונים של צלחת הזרע עם תאים כך ששכבת התא תהיה ביניהם, ולאחר מכן רשום את ערך ההתנגדות על ידי דריכה עדינה על הדוושה.
    1. ודא שהאלקטרודה אינה נוגעת בתאים בתא העליון ובתחתית התא התחתון. לזמן ההשריה של האלקטרודה בתמיסה אין השפעה על ערך ההתנגדות, ויש רק לוודא שהאלקטרודה נמצאת במיקום הנכון.
  9. קבל ערכי TEER (Ωcm2) על ידי הכפלת ערכי התנגדות חשמלית (ohms) עם השטח התחתון (cm2) של החדר העליון, כמו במשוואה:
    TEER (Ωcm2) = התנגדות (Ω) xS insert (ס"מ2)
  10. צייר תרשים קו של TEER-Time (בימים). כאשר ערך ההתנגדות אינו עולה עוד יותר עם הזמן (נמדד על פני ימים), שקול את התא נוצר מחסום.
    NOTW: מודל BBB חד-שכבתי של תאי bEnd.3 ייבנה בהצלחה על ידי תרבית תאי bEND.3 עם הפרמטרים במחקר זה במשך כ-6 ימים. ה-TEER של מודל חד-שכבתי של תא bEnd.3 נע בין 16.49 ±-2.12 Ωcm2 ל-27.59 ±-1.50 Ωcm2 תוך 6 ימים (n = 8, ממוצע ± SD).

5. הרס מחסומים וניתוח סטטיסטי

  1. על פי עקומת הזמן TEER, בחר את הבארות עם פונקציית מחסום וחלק אותן לקבוצת הבקרה ולקבוצת CoCl2 (n = 4).
  2. הוסף את מדיום התרבית ואת מדיום התרבית המכיל 300 מיקרומטר CoCl2 (200 μL) לקבוצת הביקורת ולתא העליון של קבוצת CoCl2 , בהתאמה.
  3. זהה את ערכי ההתנגדות של קבוצות הבקרה ו- CoCl2 ב- 12 שעות ו- 24 שעות הדגירה ב- 37 ° C באמצעות ההליך המתואר בשלב 4.
  4. השתמש בתוכנה מסחרית כדי למפות את המגמה של ערכי TEER של מחסום התאים בתרבית עם או בלי 300 מיקרומטר CoCl2.
  5. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי כדי לנתח את ההבדל בערכי ההתנגדות בין תאים שטופלו ב- CoCl2 לבין תאים נורמליים (n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה איפשר רישום של שינויים בערכי ההתנגדות של תאים על פי הפרמטרים שנקבעו במד הנגד transendothelial. הכדאיות של תאי bEnd.3 (מספר התאים החיים) שטופלו בריכוזים שונים של CoCl2 נבדקה על ידי בדיקת CCK-8. נזק גדול יותר לתאים שנוצר על ידי CoCl2 היה מיוצג על ידי כדאיות תאים נמוכה יותר. מצאנו ש-300 מיקרומטר של CoCl2 היה ציטוטוקסי באופן משמעותי במבחנה, והריכוז הזה שימש לניסויים הבאים (איור 3A). על-ידי ניטור השינויים בהתנגדות לגדילה ב-bBend.3, מצאנו שערכי TEER של התא החלו להתייצב ביוםהחמישי . פגיעה היפוקסית שנגרמה על-ידי הוספה של 300 מיקרומטר CoCl2 לחדר העליון של הצלחת ביוםה-6 הביאה לירידה משמעותית בערכי TEER בהשוואה לביקורת בנקודות הזמן של 12 שעות ו-24 שעות (איור 3B). ניתן להעריך בעקיפין את תפקוד מחסום התא על ידי ערך ה-TEER, וירידה בערך ה-TEER מצביעה על התמוטטות מחסום התא. ערך TEER של 300 מיקרומטר קבוצת CoCl2 ירד בהשוואה לקבוצת הביקורת לאחר הדגירה במשך 24 שעות (איור 3C). המחקר הנ"ל הראה כי נזק למודל BBB in vitro יכול להיגרם על ידי סביבה היפוקסית הנגרמת על ידי CoCl2.

Figure 1
איור 1: מכשירים ואביזרים למדידת TEER. (א-ב) תפעול הממשק הראשי של מד TEER. (ג-ד) צלחת 24 בארות. (ה) התמיסה הנדרשת לניקוי וחיטוי אלקטרודות. (F) נדרשת התנגדות סטנדרטית לכיול מד TEER. (ז-ח) האלקטרודה והגדלה מקומית. (I) דוושת רגל שימשה לאיסוף נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תרשימי זרימה של ההתנגדות הטרנסממברנלית של תאים bend.3 שתועדו באמצעות מד נגד טרנסאנדותל. (A) תרבית תאים. (B) תאי העיקול 3 נזרעו בחדר העליון של הלוחות, ומחסום תאים צפוף נוצר על ידי מילוי לוחות הבאר בתווך כדי לתמוך בצמיחתם ובהתמיינותם. (C) שלמות תפקודית המחסום של התאים הוערכה על ידי ניטור TEER. (D) CoCl2 שימש לחיקוי הסביבה ההיפוקסית כדי לגרום לתפקוד לקוי של מחסום התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סלידרוסיד שומר על שלמות תפקוד המחסום של תאי bend.3 על-ידי הקלה על פגיעה היפוקסית הנגרמת על-ידי CoCl2. (A) ההשפעה של CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) על הכדאיות של תאי bEnd.3 (n=6, קבוצת CoCl2 לעומת קבוצת ביקורת ***p<0.001, ממוצע ± SD). (B) תרשים שינויים בערכי TEER של תאי bend.3 שטופלו בתווך רגיל או 300 מיקרומטר CoCl2 (n = 4, יום 1 לעומת יום 2-6: ##p<0.01, ###p<0.001, יום 6 לעומת יום 6.5 - 7: **p<0.01, ממוצע ± SD). (C) שינויי TEER של תאים לאחר פגיעה היפוקסית של 24 שעות (n = 4, קבוצת CoCl2 לעומת קבוצת ביקורת ***p<0.001, ממוצע ± SD). בוצעו בדיקות חד-כיווניות של ANOVA ו-Tukey, ו-p<0.05 נחשב למשמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטרים אפשרות
בחר צלחת 24-באר
איתור הזמנה א1
יחידות מצב Ω
התנגדות סטנדרטית 1 kΩ

טבלה 1: הגדרת פרמטרים של מד TEER. הגדרות הפרמטרים ובחירת התוכנית של המכשיר נדרשים לזיהוי התנגדות התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחד מאיברי הגוף המפותחים ביותר, המוח שולט במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים, כולל זיכרון, קוגניציה, שמיעה, ריח ותנועה27. המוח הוא אחד האיברים המסובכים והמטופלים ביותר בגוף האדם בעת ובעונה אחת. הופעתן של הפרעות רבות במערכת העצבים המרכזית מראה נטייה גוברת משנה לשנה בשל גורמים הכוללים זיהום אוויר, דפוסי אכילה לא סדירים וגורמים אחרים 27,28,29. מעניין כי ההתחלה וההתקדמות של כמה מחלות מערכת העצבים המרכזית, כגון שבץ, אפילפסיה ואלצהיימר (AD), קשורות קשר הדוק עם הצמיחה של BBB 30,31,32. הרעיון הבסיסי לטיפול ברוב ההפרעות עם תפקוד לקוי של המוח עשוי להיות יצירת טיפולים חדשים או תרופות לשמירה על הומאוסטזיס תפקודי BBB. למרבה הצער, רוב התרופות אינן יכולות להיכנס לפרנכימת המוח כדי לבצע את תפקידיהן החיוניים בשל ההידרופוביות של BBB ושיטת הובלת המומסים הייחודית שלה 14,33. כדי להגדיל את הסבירות שתרופה תצליח, זוהי אסטרטגיה טובה ליצור מודלים חדשים של BBB שניתן להשתמש בהם לסינון מולקולרי בתפוקה גבוהה.

בשל המבנה המורכב של היחידה neurovascular, מודל in vivo תיאורטית יש רמה גבוהה יותר של מודלים של מבנה BBB. עם זאת, בשל הגבלת ההומולוגיה בין בעלי חיים לבני אדם, השונות במובילי BBB עלולה להוביל לכך שבדיקת תרופות לא תביא לתוצאה הצפויה34. להיפך, מודלים במבחנה מציעים את היתרונות של היותם זולים, מחזור גילוי מהיר, והיכולת להיות מנוצלים לבדיקות סקר בתפוקה גבוהה, אשר יכול לשרת טוב יותר את המטרות של מחקר מחלות נוירולוגיות. עם התפתחות המדע והטכנולוגיה, יותר ויותר מודלים במבחנה הדומים מאוד למבנה הפיזיולוגי של BBB נוצרים ומשופרים. בנוסף להבחנה בין טכניקות סימולציה לפלטפורמות סטטיות ודינמיות, ישנם הבדלים משמעותיים בסוגי התאים ובמספרים המשמשים35. זריעת תאי אנדותל בתחתית החדר העליון היא מודל תאי BBB הפשוט ביותר וגישה מצוינת לקינטיקה של תעבורה ומסלול איתות תאי36. מודלים של תרבית משותפת מוסיפים אינטראקציות עם פריציטים או תאי גלייה על בסיס תאים חד-שכבתיים, אך מודלים אלה מוגבלים לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת להשיג מיקום תאים מדויק ובקרה מכוונת12. המודל הדינמי עם מבנה דו-ממדי ותלת-ממדי הוא כיום הייצוג המדויק ביותר של המיקרו-סביבה הדינמית של BBB במבחנה; עם זאת, חשוב לציין כי פיתוח מודל זה כרוך במאמץ תכנון ותיקוף מוקדם נרחב. בחירת מודל BBB הנכון בהתאם לצרכים האמיתיים של המחקר יכולה להשיג תוצאות ניסוי מדויקות יותר.

שיטות ההערכה של שלמות תפקודית של מודל BBB in vitro כוללות בדרך כלל מבחן חדירות ומבחן ערך התנגדות transmembrane. הראשון מושג בעיקר על ידי הערכת החדירות של חומרים מקרומולקולריים המסומנים פלואורסצאין. השיטה פשוטה ומדויקת, אך מבנה שכבת התא משתנה לאחר שהחומר הפלואורסצנטי עובר דרכה, וכתוצאה מכך ניצול הדגימה נמוך37. מחסור זה מפצה למעשה על ידי פיתוח שיטת זיהוי TEER. שתי האלקטרודות מוקמו משני צידי שכבת התא, ותקינות פונקציית המחסום הוערכה על ידי מדידת התנגדות זרם היונים על פני מחסום התא38. ההתנגדות הכוללת הופחתה מההתנגדות הסביבתית, כגון התנגדות קרום התרבות והתנגדות בינונית, והוכפלה בשטח קרום התרבית כדי לקבל את התנגדות BBB הסופית (TEER, Ωcm2)39. ערך גבוה יותר של ערכי TEER מייצג רמה גבוהה יותר של צמתים הדוקים בין תאים. TEER מדידת הפעולה היא פשוטה ולא פולשנית, תפקוד מחסום התא ברגע שנוצר התנגדות יהיה בטווח יציב. תכונה זו מאפשרת למפעיל לשמור על ערכי TEER דומים גם בעת שימוש במכשירים שונים בתנאי הפעלה סטנדרטיים. רק הטמפרטורה והמיקום של החדרת האלקטרודה דורשים תשומת לב נוספת מהמפעיל. עליית הטמפרטורה והאלקטרודה הנוגעת בתחתית יפחיתו את התנגדות התא.

במחקר זה, מודל פשוט של תא חד-שכבתי BBB במבחנה נבנה בהצלחה על-ידי הערכת ההתנגדות הטמפורלית של תאי bend.3 בחדר העליון של הצלחת. הסביבה ההיפוקסית שנגרם על ידי CoCl2שיבשה את הצומת ההדוק בין תאי אנדותל, מה שהפחית משמעותית את TEER בהשוואה לתאים נורמליים. על פי פרוטוקול ניסוי זה, המתואר בתהליך הסטנדרטי ליצירת מודל BBB במבחנה , הוא בעל שיעור הצלחה גבוה וחזרתיות. רק צפיפות הזריעה צריכה להשתנות אם ניסוי זה מנוהל עם מפרטי לוחות באר שונים ורמות הנוזל בחדרים העליונים והתחתונים של הלוחות סמוקים. עם זאת, ערך ה-TEER יושפע במידה מסוימת מהמיקום השגוי של האלקטרודה ומההטרוגניות של השדה החשמלי לאורך שכבת התא12. ברוב המקרים, TEER יאושר בו זמנית על ידי זיהוי immunofluorescence וחדירות בהתאם לדרישות המחקר של מודלים שונים BBB. מודל תאים זה ישתפר בעתיד על מנת לסנן תרופות שעלולות לספוג את נזקי BBB הנגרמים על ידי היפוקסיה. לסיכום, לשימוש בטכנולוגיית זיהוי TEER צפויה להיות השפעה משמעותית על יצירת תרופות ואסטרטגיות טיפול במחלות נוירולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274207 ו- 82104533), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר המלומד Xinglin של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (XKTD2022013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Tags

רישום שלמות תפקודית של המחסום BEnd.3 תאי אנדותל וסקולריים זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל מחסום דם-מוח תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אסטרוציטים פריציטים מודלים חוץ גופיים הפרעות נוירולוגיות טיפולים תרופתיים מודל תאי BBB חד-שכבתיים תא עליון צלחת 24 בארות תפקוד מחסום התא מד מתח תאי אפיתל התנגדות חשמלית טרנסממברנלית תאים היפוקסיים המושרים על ידי CoCl2 מחלות מערכת העצבים המרכזית
רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים <em>באמצעות</em> זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang,… More

Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter