Summary
Questo protocollo descrive un modello in vitro affidabile ed efficiente della barriera emato-encefalica. Il metodo utilizza cellule endoteliali vascolari cerebrali di topo bEnd.3 e misura la resistenza elettrica transmembrana.
Abstract
La barriera emato-encefalica (BBB) è una struttura fisiologica dinamica composta da cellule endoteliali microvascolari, astrociti e periciti. Coordinando l'interazione tra il transito limitato di sostanze nocive, l'assorbimento dei nutrienti e la clearance dei metaboliti nel cervello, la BBB è essenziale per preservare l'omeostasi del sistema nervoso centrale. La costruzione di modelli in vitro della BBB è uno strumento prezioso per esplorare la fisiopatologia dei disturbi neurologici e creare trattamenti farmacologici. Questo studio descrive una procedura per la creazione di un modello di cellula BBB monostrato in vitro seminando cellule bEnd.3 nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti. Per valutare l'integrità della funzione di barriera cellulare, il voltmetro convenzionale a cellule epiteliali è stato utilizzato per registrare in tempo reale la resistenza elettrica transmembrana delle cellule normali e delle cellule ipossiche indotte da CoCl2. Prevediamo che gli esperimenti di cui sopra forniranno spunti efficaci per la creazione di modelli in vitro di BBB e farmaci per il trattamento dei disturbi delle malattie del sistema nervoso centrale.
Introduction
La BBB è un'interfaccia biologica unica tra la circolazione sanguigna e il tessuto nervoso, composto da cellule endoteliali vascolari, periciti, astrociti, neuroni e altre strutture cellulari1. Il flusso di ioni, sostanze chimiche e cellule tra il sangue e il cervello è strettamente regolato da questa barriera. Questa omeostasi protegge i tessuti nervosi dalle tossine e dagli agenti patogeni, consentendo anche il corretto funzionamento dei nervi cerebrali 2,3. Mantenere l'integrità della BBB può prevenire efficacemente lo sviluppo e la progressione di disturbi che colpiscono il sistema nervoso centrale, come la disfunzione neuronale, l'edema e la neuroinfiammazione4. Tuttavia, le proprietà fisiologiche uniche della BBB impediscono a oltre il 98% dei farmaci a piccole molecole e al 100% dei farmaci macromolecolari di entrare nel sistema nervoso centrale5. Pertanto, aumentare la penetrazione dei farmaci attraverso la BBB durante lo sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale è essenziale per raggiungere l'efficacia terapeutica 6,7. Anche se lo screening con simulazione al computer dei substrati ha aumentato significativamente la probabilità che i candidati farmaci attraversino la BEE, sono ancora necessari modelli di BBB in vitro/in vivo affidabili e convenienti per soddisfare le esigenze della ricerca scientifica8.
Una tecnica rapida ed economica per lo screening dei farmaci ad alto rendimento è il modello in vitro 9. Per far luce sui processi fondamentali degli effetti dei farmaci sulla funzione della BBB e sul loro ruolo nello sviluppo e nella progressione della malattia, è stata creata una serie di modelli semplificati di BBB in vitro. Attualmente, i modelli comuni di BBB in vitro sono i modelli monostrato, di co-coltura, dinamici e microfluidici 10,11,12, costruiti da cellule endoteliali vascolari e astrociti, periciti o microglia 13,14. Sebbene le colture cellulari 3D siano più in linea con la struttura fisiologica della BBB15, la loro applicazione come mezzo di screening farmacologico per la BBB è ancora limitata dal loro design intricato e dalla riproducibilità scadente. Al contrario, il modello monostrato in vitro è quello più frequentemente utilizzato per la ricerca sulla BBB ed è applicabile per determinare l'espressione dei trasportatori di membrana e delle proteine a giunzione stretta in particolari cellule.
La misurazione della resistenza elettrica transmembrana (TEER) è una tecnica per valutare e monitorare lo strato di cellule attraverso la resistenza e valutare l'integrità cellulare e la permeabilità della barriera. Inserendo contemporaneamente due elettrodi nel mezzo di crescita o nella soluzione tampone su entrambi i lati del monostrato, è possibile misurare la corrente alternata o l'impedenza elettrica attraverso lo strato compatto della cella16,17. Al fine di determinare se il modello BBB in vitro è stato creato correttamente, la misurazione del TEER sarà solitamente impiegata come gold standard18. D'altra parte, l'andamento dell'azione dei farmaci sulla permeabilità della BBB può essere previsto con precisione misurando la variazione della resistenza elettrica dello strato cellulare dopo il coinvolgimento del farmaco19. Ad esempio, Feng et al. hanno scoperto che il catalpol (il monomero attivo primario delle rehmanniae) potrebbe invertire efficacemente la down-regulation indotta dai lipopolisaccaridi delle proteine a giunzione stretta nella BBB e aumentare il valore TEER dello strato20 delle cellule endoteliali del cervello di topo.
La risposta neuroinfiammatoria è di solito la causa principale dello squilibrio dell'omeostasi della BBB21. Il trattamento ipossico per indurre lesioni neuroinfiammatorie è il metodo principale per distruggere la barriera emato-encefalica, includendo principalmente metodi fisici e metodi di reagenti chimici. Il primo utilizza principalmente un incubatore a tre gas per variare il contenuto di ossigeno nell'ambiente di crescita cellulare per simulare le condizioni ipossiche22, mentre il secondo si ottiene introducendo artificialmente reagenti deossi come CoCl2 nel terreno di coltura cellulare23. Le cellule rimarranno in una condizione di deossigenazione se Fe2+ viene sostituito con Co2+ nell'eme. Se Fe2+ viene sostituito con Co2+ nel gruppo catalitico, l'attività della prolina idrossilasi e dell'aspartato idrossilasi sarà inibita, con conseguente accumulo di fattore 1α inducibile dall'ipossia (HIF-1α)24. In condizioni di ipossia persistente, la defosforilazione di HIF-1α nel citoplasma innesca la morte cellulare e attiva il fattore di crescita dell'endotelio vascolare, che alla fine aumenta la permeabilità vascolare. In precedenti studi 25,26, è stato ben dimostrato che l'ipossia può ridurre significativamente l'espressione delle proteine endoteliali della giunzione stretta per aumentare la permeabilità della BBB. In questo studio, è stata misurata la curva tempo-resistenza delle cellule bEnd.3 seminate in piastre a 24 pozzetti al fine di creare un modello BBB semplice. Utilizzando questo modello, abbiamo caratterizzato i cambiamenti nel TEER cellulare dopo l'intervento di CoCl2 al fine di costruire un modello cellulare che può essere utilizzato per lo screening dei farmaci per la protezione della BBB.
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Protocol
NOTA: Le cellule endoteliali derivate dal cervello di topo.3 (bEnd.3) sono state inoculate nelle camere di una piastra a 24 pozzetti per costruire un semplice modello in vitro di BBB in condizioni specifiche del terreno. Il TEER delle cellule normali e delle cellule ipossiche è stato misurato con il misuratore TEER (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparazione della soluzione
- Preparare il terreno di coltura cellulare DMEM contenente FBS (10%, v/v), 100 U/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare 100 mM di soluzione madre di CoCl2 aggiungendo 1,30 mg di CoCl2 a 100 μL di soluzione di DMSO.
NOTA: Tutte le soluzioni di cui sopra sono state conservate a 4 °C e la soluzione madre è stata diluita in base alla concentrazione desiderata prima dell'uso. - Preparare una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% (v/v) aggiungendo 2 mL di soluzione di ipoclorito di sodio a 38 mL di acqua bidistillata.
2. Colture cellulari e vitalità cellulare
- Seminare 1 mL di cellule bEnd.3 in piastra di coltura (100 mm) contenente terreno DMEM ad una densità di 1 x 106 cellule/mL e coltura a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Cambiare il terreno ogni 2 o 3 giorni e sottocoltivare le cellule 2 volte a settimana.
- Dopo che le cellule bEnd.3 sono cresciute fino all'80% di confluenza, digerire le cellule con lo 0,25% di tripsina per 30 secondi.
- Preparare una sospensione di cellule bEnd.3 con una densità di 7 x 104 cellule/mL utilizzando un terreno DMEM attraverso un contatore di cellule. Quindi, seminare 100 μL di sospensione cellulare bEnd.3 in una piastra a 96 pozzetti.
- Dopo l'adesione cellulare, pulire le cellule con PBS e coltivare le cellule con 100 μL di terreno di coltura o terreno contenente farmaco (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) per 24 ore nelle stesse condizioni. Dopo aver rimosso il terreno all'interno della piastra del pozzetto e averlo pulito con PBS, aggiungere 100 μL di soluzione CCK-8.
NOTA: Non generare bolle nel pozzetto, che influenzeranno i valori di densità ottica (OD). - Mettere le piastre a 96 pozzetti in un ambiente di 37 °C e incubare per 1 ora. Misurare l'assorbanza delle piastre a 96 pozzetti a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre.
NOTA: Per evitare differenze all'interno del gruppo, le piastre a pozzetti sono state raffreddate a temperatura ambiente prima del rilevamento. - Calcolare la vitalità cellulare indotta da diverse concentrazioni di CoCl2 secondo la formula [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Selezionare la concentrazione di CoCl2 con una differenza significativa nella riduzione della vitalità cellulare rispetto al gruppo di controllo per il prossimo esperimento.
3. Assemblaggio del modello
- Sciacquare la camera superiore delle piastre a 24 pozzetti con PBS.
NOTA: Le cellule sono cresciute e si sono fuse sul fondo della camera superiore della piastra a 24 pozzetti e si sono gradualmente formate giunzioni strette tra le cellule per svolgere un ruolo di barriera. Se le cellule endoteliali utilizzate in alcuni studi non sono in grado di formare una barriera completa sulle membrane PET in modo indipendente, è necessario rivestire le membrane con una soluzione di collagene IV prima dell'inoculazione cellulare. - Miscelare le cellule bEnd.3 con il terreno DMEM per ottenere una sospensione a una densità di 5 x 105 cellule/mL utilizzando un miscelatore a vortice. Quindi, seminare 200 μL di sospensione cellulare bEnd.3 sulla membrana PET nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti (0,33 cm2, dimensione dei pori della membrana 0,4 μm).
NOTA: Lo studio pilota di questo protocollo non ha riscontrato differenze nei risultati quando si utilizzano da 5 a 10 passaggi di cellule bEnd.3 per gli esperimenti. Per garantire la probabilità di successo della modellazione, fare riferimento all'intervallo del numero di celle di questo protocollo. - Aggiungere 1200 μL di terreno completo alla camera inferiore della piastra per garantire che la pressione osmotica della camera superiore e inferiore tenda a stabilizzarsi. Ci sono differenze nel volume del mezzo aggiunto a seconda del tipo; Assicurarsi che il livello del liquido delle camere superiore e inferiore sia a filo.
- Cambiare il fluido della camera superiore e della camera inferiore a un'ora fissa ogni giorno e monitorare contemporaneamente il valore della resistenza.
- Quando si cambia il mezzo, l'integrità dello strato cellulare sarà danneggiata dal tocco artificiale o da un movimento eccessivo. Per evitare la situazione di cui sopra, rimuovere lentamente il vecchio mezzo da un lato con una pipetta a pressione negativa e aggiungere lentamente un nuovo mezzo lungo la parete durante lo scambio del fluido.
4. Misurazione del TEER
- Prima di iniziare il lavoro, posizionare il resistore, la soluzione di ipoclorito di sodio al 5%, l'etanolo al 75% e la soluzione di acqua bidistillata in un tavolo ultra-pulito. Accendere l'irradiazione UV per 30 minuti per eliminare batteri e agenti patogeni residui.
- Immergere gli elettrodi in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% agitando lentamente per 3-5 secondi, quindi immergerli in etanolo al 75% per 15 minuti. Infine, trasferire in PBS o in una soluzione di acqua bidistillata fino all'uso.
- Accendere l'interruttore sul retro del resistore di cella, fare clic su Seleziona piastra in base ai parametri nella Tabella 1 e selezionare Piastra a 24 pozzetti.
- In base alle esigenze operative, selezionare la sequenza di rilevamento appropriata. In questo studio abbiamo selezionato la procedura A1 .
- Inserire una resistenza kΩ nella spina destra per calibrare lo strumento. Se il risultato della calibrazione è 1000 ± 5 Ω, considerare la precisione dello strumento normale.
- Se il risultato della calibrazione non è 1000 Ω, fare clic su Unità di modalità nell'interfaccia principale per selezionare OHMS, quindi fare clic su Calibra nella schermata principale per ricalibrare lo strumento.
- Estrarre la resistenza kΩ sul lato destro e sostituire l'elettrodo di misura con un filo di collegamento.
- Posizionare l'elettrodo nella piastra a 24 pozzetti senza seminare le celle verticalmente e fare clic su Gestione del grezzo nella schermata principale dello strumento. Il valore di fondo della resistenza della piastra senza cellule seminate è di circa 134,4 Ω.
- Inserire i due elettrodi nelle camere superiore e inferiore della piastra seminata con le celle in modo che lo strato cellulare si trovi tra di loro, quindi registrare il valore della resistenza premendo delicatamente il pedale.
- Assicurarsi che l'elettrodo non tocchi le celle nella camera superiore e nella parte inferiore della camera inferiore. Il tempo di immersione dell'elettrodo nella soluzione non ha alcun effetto sul valore della resistenza ed è solo necessario assicurarsi che l'elettrodo sia nella posizione corretta.
- Ottenere i valori di TEER (Ωcm2) moltiplicando i valori di resistenza elettrica (ohm) per la zona inferiore (cm2) della camera superiore, come nell'equazione:
TEER (Ωcm2) = Resistenza (Ω) xinserto S (cm2) - Disegna un grafico a linee di TEER-Time (in giorni). Quando il valore della resistenza non aumenta ulteriormente con il tempo (misurato in giorni), si consideri la cella formata da una barriera.
NOTW: Il modello BBB monostrato di cellule bEnd.3 sarà costruito con successo coltivando cellule bEND.3 con i parametri di questo studio per circa 6 giorni. Il TEER del modello monostrato di celle bEnd.3 variava da 16,49 ± 2,12 Ωcm2 a 27,59 ± 1,50 Ωcm2 entro 6 giorni (n=8, media ± DS).
5. Distruzione delle barriere e analisi statistica
- In base alla curva TEER - tempo, selezionare i pozzetti con funzione barriera e dividerli nel gruppo di controllo e nel gruppo CoCl2 (n = 4).
- Aggiungere il terreno di coltura e il terreno di coltura contenenti 300 μM di CoCl2 (200 μL) rispettivamente nella camera superiore del gruppo di controllo e del gruppo CoCl2 .
- Rilevare i valori di resistenza dei gruppi di controllo e CoCl2 a 12 ore e 24 ore di incubazione a 37 °C utilizzando la procedura descritta al punto 4.
- Utilizzare software commerciali per mappare l'andamento dei valori di TEER della barriera di cellule coltivate con o senza 300 μM di CoCl2.
- Utilizzare un software di analisi statistica per analizzare la differenza nei valori di resistenza tra le cellule trattate con CoCl2 e le cellule normali (n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
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Representative Results
Questo protocollo ha permesso di registrare le variazioni dei valori di resistenza delle cellule in base ai parametri impostati nel resistore transendoteliale. La vitalità delle cellule bEnd.3 (numero di cellule vive) trattate con diverse concentrazioni di CoCl2 è stata esaminata mediante test CCK-8. Il maggior danno cellulare prodotto da CoCl2 è stato rappresentato da una minore vitalità cellulare. Abbiamo scoperto che 300 μM di CoCl2 erano significativamente citotossici in vitro, e questa concentrazione è stata utilizzata per gli esperimenti successivi (Figura 3A). Monitorando i cambiamenti di resistenza alla crescita in bEnd.3, abbiamo scoperto che i valori di TEER delle cellule hanno iniziato a stabilizzarsi il 5° giorno. La lesione ipossica indotta dall'aggiunta di 300 μM di CoCl2 alla camera superiore della piastra il 6° giorno ha provocato una significativa diminuzione dei valori di TEER rispetto al controllo sia a 12 ore che a 24 ore (Figura 3B). La funzione della barriera cellulare può essere valutata indirettamente dal valore TEER e un calo del valore TEER indica la rottura della barriera cellulare. Il valore TEER del gruppo CoCl2 da 300 μM è diminuito rispetto al gruppo di controllo dopo un'incubazione di 24 ore (Figura 3C). La suddetta ricerca ha dimostrato che il danno al modello in vitro della BBB può essere causato da un ambiente ipossico causato da CoCl2.
Figura 1: Strumenti e accessori per la misurazione del TEER. (A-B) Interfaccia principale di funzionamento del misuratore TEER. (C-D) Una piastra a 24 pozzetti. (E) La soluzione necessaria per la pulizia e la disinfezione degli elettrodi. (F) La resistenza standard è richiesta per la calibrazione del misuratore TEER. (G-H) L'elettrodo e l'ingrandimento locale. (I) Per raccogliere i dati è stato utilizzato un pedale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagrammi di flusso della resistenza transmembrana delle cellule bEnd.3 registrate utilizzando un resistore transendoteliale. (A) Coltura cellulare. (B) Le cellule bEnd.3 sono state seminate nella camera superiore delle piastre e si è formata una densa barriera cellulare riempiendo le piastre del pozzetto con terreno per supportarne la crescita e la differenziazione. (C) L'integrità funzionale della barriera delle cellule è stata valutata monitorando TEER. (D) CoCl2 è stato utilizzato per imitare l'ambiente ipossico per indurre una compromissione della funzione di barriera cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Salidroside mantiene l'integrità della funzione barriera delle cellule bEnd.3 alleviando il danno ipossico indotto da CoCl2. (A) Effetto di CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) sulla vitalità delle cellule bEnd.3 (n=6, gruppo CoCl2 vs gruppo di controllo ***p<0,001, media ± DS). (B) Grafico delle variazioni dei valori di TEER delle cellule bEnd.3 trattate con terreno normale o 300 μM di CoCl2 (n=4, Giorno 1 vs Giorno 2-6: ##p<0.01, ###p<0.001, Giorno 6 vs Giorno 6.5 - 7: **p<0.01, media ± SD). (C) Cambiamenti TEER delle cellule dopo 24 ore di danno ipossico (n=4, gruppo CoCl2 vs gruppo di controllo ***p<0,001, media ± DS). Sono stati eseguiti l'ANOVA unidirezionale e il test di Tukey e p<0,05 è stato considerato significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametri | Opzione |
| Seleziona piatto | Pozzetto a 24 pozzetti |
| Ordine di rilevamento | A1 |
| Unità di modalità | Ω |
| Resistenza standard | 1 kΩ |
Tabella 1: Impostare i parametri del misuratore TEER. Le impostazioni dei parametri e la selezione del programma dello strumento sono necessarie per il rilevamento della resistenza cellulare.
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Discussion
Uno degli organi corporei più sviluppati, il cervello controlla un'ampia gamma di intricati processi fisiologici, tra cui la memoria, la cognizione, l'udito, l'olfattoe il movimento. Il cervello è uno degli organi più complicati e malati del corpo umano allo stesso tempo. L'insorgenza di molti disturbi del sistema nervoso centrale mostra una tendenza crescente anno dopo anno a causa di fattori quali l'inquinamento atmosferico, i modelli alimentari irregolari e altri fattori 27,28,29. È interessante notare che l'inizio e la progressione di alcune malattie del sistema nervoso centrale, come l'ictus, l'epilessia e il morbo di Alzheimer (AD), sono strettamente correlati con la crescita della BBB 30,31,32. Il concetto di base per il trattamento della maggior parte dei disturbi con disfunzione cerebrale può essere la creazione di nuove terapie o farmaci per mantenere l'omeostasi funzionale della BBB. Sfortunatamente, la maggior parte dei farmaci non può entrare nel parenchima cerebrale per svolgere le proprie funzioni vitali a causa dell'idrofobicità della BBB e del suo esclusivo metodo di trasporto del soluto14,33. Per aumentare la probabilità che un farmaco abbia successo, è una buona strategia creare nuovi modelli di BBB che possano essere utilizzati per lo screening molecolare ad alto rendimento.
A causa dell'intricata struttura dell'unità neurovascolare, il modello in vivo ha teoricamente un grado più elevato di modellazione della struttura della BBB. Tuttavia, a causa della restrizione dell'omologia tra animali ed esseri umani, le variazioni nei trasportatori della BBB possono portare a uno screening farmacologico che non ha l'esito atteso34. Al contrario, i modelli in vitro offrono il vantaggio di essere poco costosi, di avere un ciclo di rilevamento rapido e di poter essere utilizzati per lo screening ad alto rendimento, che può servire meglio gli obiettivi della ricerca sulle malattie neurologiche. Con lo sviluppo della scienza e della tecnologia, vengono creati e migliorati sempre più modelli in vitro che assomigliano molto alla struttura fisiologica della BBB. Oltre alla distinzione tra tecniche di simulazione per piattaforme statiche e dinamiche, esistono differenze significative nei tipi di celle e nei numeri utilizzati35. La semina di cellule endoteliali sul fondo della camera superiore è il modello di cellula BBB più semplice e un approccio eccellente per la cinetica di trasporto e la via di segnalazione cellulare36. I modelli di co-coltura aggiungono interazioni con i periciti o le cellule gliali sulla base di cellule monostrato, ma questi modelli sono spesso vincolati dall'incapacità di ottenere un posizionamento accurato delle cellule e un controllo diretto12. Il modello dinamico con struttura 2D e 3D è attualmente la rappresentazione più accurata del microambiente dinamico della BBB in vitro; Tuttavia, è importante notare che lo sviluppo di questo modello comporta un ampio sforzo di progettazione e convalida preliminare. La selezione del modello BBB corretto in base alle reali esigenze della ricerca può ottenere risultati sperimentali più accurati.
I metodi di valutazione dell'integrità funzionale del modello in vitro di BBB di solito includono un test di permeabilità e un test del valore di resistenza transmembrana. Il primo si ottiene principalmente valutando la permeabilità di sostanze macromolecolari marcate con fluoresceina. Il metodo è semplice e preciso, ma la struttura dello strato cellulare cambia dopo il passaggio della sostanza fluorescente, con conseguente basso utilizzo del campione37. Questa carenza è efficacemente compensata dallo sviluppo del metodo di rilevamento TEER. I due elettrodi sono stati posizionati su entrambi i lati dello strato cellulare e l'integrità della funzione barriera è stata valutata misurando la resistenza della corrente ionica attraverso la barriera cellulare38. La resistenza totale è stata sottratta dalla resistenza ambientale, come la resistenza della membrana di coltura e la resistenza del mezzo, e moltiplicata per l'area della membrana di coltura per ottenere la resistenza BBB finale (TEER, Ωcm2)39. Un valore più alto dei valori TEER rappresenta un grado più elevato di giunzioni strette tra le celle. La misurazione del TEER l'operazione è semplice e non invasiva, la funzione di barriera cellulare una volta formata la resistenza sarebbe in un intervallo stabile. Questa caratteristica consente all'operatore di mantenere valori TEER simili anche quando si utilizzano strumenti diversi in condizioni operative standard. Solo la temperatura e il posizionamento dell'inserto dell'elettrodo richiedono un'attenzione particolare da parte dell'operatore. L'aumento della temperatura e il contatto dell'elettrodo con il fondo diminuiranno la resistenza della cella.
In questo studio, è stato costruito con successo un semplice modello di cellula monostrato BBB in vitro valutando la resistenza temporale delle cellule bEnd.3 nella camera superiore della piastra. L'ambiente ipossico indotto da CoCl2ha interrotto la stretta giunzione tra le cellule endoteliali, riducendo significativamente il TEER rispetto alle cellule normali. Secondo questo esperimento, il protocollo descritto nel processo standard per creare un modello di BBB in vitro ha un alto tasso di successo e ripetibilità. Solo la densità di semina deve essere modificata se questo esperimento viene eseguito con diverse specifiche della piastra del pozzetto e i livelli del liquido nelle camere superiore e inferiore delle piastre sono a filo. Tuttavia, il valore TEER sarà in qualche modo influenzato dalla posizione errata dell'elettrodo e dall'eterogeneità del campo elettrico in tutto lo strato cellulare12. Nella maggior parte dei casi, il TEER sarà confermato simultaneamente dall'immunofluorescenza e dal rilevamento della permeabilità, a seconda dei requisiti di studio dei vari modelli di BBB. Questo modello cellulare sarà migliorato in futuro al fine di escludere i farmaci che possono sostenere il danno della BBB causato dall'ipossia. In conclusione, l'uso della tecnologia di rilevamento TEER avrà probabilmente un impatto significativo sulla creazione di farmaci e strategie terapeutiche per le malattie neurologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Apprezziamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82274207 e 82104533), del Key Research and Development Program di Ningxia (2023BEG02012) e dello Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Chengdu di MTC (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
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