Summary
Этот протокол описывает надежную и эффективную модель гематоэнцефалического барьера in vitro . Метод использует клетки эндотелия сосудов головного мозга мышей bEnd.3 и измеряет трансмембранное электрическое сопротивление.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) представляет собой динамическую физиологическую структуру, состоящую из микрососудистых эндотелиальных клеток, астроцитов и перицитов. Координируя взаимодействие между ограниченным транзитом вредных веществ, всасыванием питательных веществ и клиренсом метаболитов в головном мозге, ГЭБ играет важную роль в сохранении гомеостаза центральной нервной системы. Построение моделей ГЭБ in vitro является ценным инструментом для изучения патофизиологии неврологических расстройств и создания фармакологических методов лечения. В данном исследовании описана процедура создания модели монослойных клеток ГЭБ in vitro путем посева клеток bEnd.3 в верхнюю камеру 24-луночного планшета. Для оценки целостности барьерной функции клеток использовали обычный эпителиальный клеточный вольтметр для регистрации трансмембранного электрического сопротивления нормальных клеток и CoCl 2-индуцированных гипоксических клеток в режиме реального времени. Мы ожидаем, что вышеуказанные эксперименты дадут эффективные идеи для создания in vitro моделей ГЭБ и препаратов для лечения заболеваний центральной нервной системы.
Introduction
ГЭБ представляет собой уникальный биологический интерфейс между кровообращением и нервной тканью, который состоит из эндотелиальных клеток сосудов, перицитов, астроцитов, нейронов и других клеточных структур1. Поток ионов, химических веществ и клеток между кровью и мозгом строго регулируется этим барьером. Этот гомеостаз защищает нервные ткани от токсинов и болезнетворных микроорганизмов, а также обеспечивает надлежащую работу нервов головного мозга 2,3. Поддержание целостности ГЭБ может эффективно предотвращать развитие и прогрессирование нарушений, влияющих на центральную нервную систему, таких как дисфункция нейронов, отек и нейровоспаление4. Однако уникальные физиологические свойства ГЭБ предотвращают попадание в центральную нервную систему более 98% низкомолекулярных лекарственных препаратов и 100% высокомолекулярных фармацевтических препаратов5. Поэтому увеличение проникновения лекарственных средств через ГЭБ при разработке препаратов для центральной нервной системы имеет существенное значение для достижения терапевтической эффективности 6,7. Несмотря на то, что скрининг субстратов с помощью компьютерного моделирования значительно повысил вероятность того, что кандидаты в лекарственные препараты проникнут через ГЭБ, для удовлетворения потребностейнаучных исследований по-прежнему необходимы надежные и доступные модели ГЭБ in vitro/in vivo.
Быстрым и доступным методом высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов является модель in vitro 9. Для того, чтобы пролить свет на фундаментальные процессы влияния лекарственных средств на функцию ГЭБ и их роль в развитии и прогрессировании заболевания, была создана серия упрощенных моделей ГЭБ in vitro. В настоящее время распространенными моделями ГЭБ in vitro являются монослойные, кокультуральные, динамические и микрофлюидные модели 10,11,12, построенные сосудистыми эндотелиальными клетками и астроцитами, перицитами или микроглией 13,14. Несмотря на то, что 3D-клеточные культуры в большей степени соответствуют физиологической структуре ГЭБ15, их применение в качестве средства скрининга лекарств на ГЭБ по-прежнему ограничено их сложной конструкцией и низкой воспроизводимостью. В отличие от этого, модель монослоя in vitro является наиболее часто используемой для исследования ГЭБ и применима для определения экспрессии мембранных транспортеров и белков плотного соединения в конкретных клетках.
Измерение трансмембранного электрического сопротивления (TEER) — это метод оценки и мониторинга слоя клеток поперек сопротивления, а также оценки целостности клеток и проницаемости барьера. При одновременном введении двух электродов в питательную среду или буферный раствор с обеих сторон монослоя можно измерить переменный ток или электрический импеданс через компактный слой ячейки16,17. Для того, чтобы определить, правильно ли была создана модель ГВВ in vitro, в качестве золотого стандарта обычно используется измерение TEER18. С другой стороны, тенденция действия лекарств на проницаемость ГЭБ может быть точно предсказана путем измерения изменения электрического сопротивления клеточного слоя после введения препарата19. Например, Feng et al. обнаружили, что catalpol (первичный активный мономер rehmanniae) может эффективно обратить вспять вызванную липополисахаридами подавление регуляции белков плотных соединений в ГЭБ и повысить значение TEER20-го слоя эндотелиальных клеток головного мозга мыши.
Нейровоспалительная реакция обычно является основной причиной дисбаланса гомеостаза ГЭБ21. Гипоксическое лечение для индуцирования нейровоспалительного повреждения является основным методом разрушения гематоэнцефалического барьера, в основном включающим физические методы и методы химических реагентов. В первом случае в основном используется инкубатор из трех газов для изменения содержания кислорода в среде роста клеток для моделирования гипоксических условий22, в то время как второй достигается путем искусственного введения дезоксиреагентов, таких как CoCl2, в средуклеточной культуры 23. Клетки останутся в деоксигенированном состоянии, если Fe2+ будет заменен на Co2+ в геме. Если Fe2+ заменить Co2+ в каталитической группе, активность пролингидроксилазы и аспартатгидроксилазы будет ингибирована, что приведет к накоплению гипоксически-индуцируемого фактора-1α (HIF-1α)24. При персистирующей гипоксии дефосфорилирование HIF-1α в цитоплазме вызывает гибель клеток и активирует фактор роста эндотелия сосудов, что в конечном итоге повышает проницаемость сосудов. В предыдущих исследованиях25,26 было хорошо продемонстрировано, что гипоксия может значительно снижать экспрессию эндотелиальных белков плотного соединения для увеличения проницаемости ГЭБ. В этом исследовании была измерена кривая сопротивления времени клеток bEnd.3, засеянных в 24-луночные планшеты, чтобы создать прямолинейную модель ГЭБ. Используя эту модель, мы охарактеризовали изменения в клеточном TEER после вмешательства CoCl2 с целью построения клеточной модели, которая может быть использована для скрининга лекарств на защиту от ГЭБ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки, полученные из мозга мышей.3 (bEnd.3), были инокулированы в камеры 24-луночного планшета для построения простой модели ГЭБ in vitro в определенных условиях среды. ТЭЭР нормальных и гипоксических клеток измеряли с помощью измерителя TEER (рис. 1 и рис. 2).
1. Приготовление раствора
- Приготовьте питательную среду для клеток DMEM, содержащую FBS (10%, v/v), 100 ЕД/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина (см. таблицу материалов).
- Приготовьте 100 мМ исходного раствора CoCl2 , добавив 1,30 мг CoCl2 в 100 мкл раствора ДМСО.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все вышеуказанные растворы хранились при температуре 4 °C, а исходный раствор перед использованием разбавляли в соответствии с желаемой концентрацией. - Приготовьте 5% раствор гипохлорита натрия (v/v), добавив 2 мл раствора гипохлорита натрия к 38 мл воды двойной дистиллированной воды.
2. Клеточная культура и жизнеспособность клеток
- Высевают 1 мл клеток bEnd.3 в чашку для культивирования (100 мм), содержащую среду DMEM плотностью 1 x 106 клеток/мл и культивируют при 37 °C во влажной атмосфере 5% CO2. Меняйте среду каждые 2-3 дня и субкультивируйте клетки 2 раза в неделю.
- После bEnd.3 клетки вырастают до 80 % слияния, переваривают клетки с 0,25 % трипсина в течение 30 с.
- Изготовьте суспензию клеток bEnd.3 плотностью 7 x 104 кл/мл с использованием среды DMEM через счетчик клеток. Затем высевают 100 мкл клеточной суспензии bEnd.3 в 96-луночный планшет.
- После адгезии клеток очищают клетки PBS и культивируют клетки 100 мкл питательной среды или лекарственной среды (100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ CoCl2) в течение 24 ч в тех же условиях. После удаления среды внутри лунки и очистки ее PBS добавьте 100 мкл раствора CCK-8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не образуйте пузырьков в лунке, которые могут повлиять на значения оптической плотности (OD). - Поместите 96-луночные планшеты в среду 37 °C и инкубируйте в течение 1 ч. Измерьте абсорбцию 96-луночных планшетов на длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать внутригрупповых различий, планшеты лунок перед обнаружением охлаждали до комнатной температуры. - Рассчитайте жизнеспособность клеток, индуцированную различными концентрациями CoCl2, по формуле [OD Drug - ODBlank] / [OD Control-ODBlank] x 100%. Выберите концентрацию CoCl2 со значимой разницей в снижении жизнеспособности клеток по сравнению с контрольной группой для следующего эксперимента.
3. Сборка модели
- Промойте верхнюю камеру 24-луночных планшетов с помощью PBS.
Примечание: Клетки росли и сливались в нижней части верхней камеры 24-луночной пластины, и постепенно образовывались плотные соединения между клетками, играющие барьерную роль. Если эндотелиальные клетки, использованные в некоторых исследованиях, не способны самостоятельно сформировать полный барьер на ПЭТ-мембранах, перед инокуляцией клеток необходимо покрыть мембраны раствором коллагена внутривенно. - Смешайте клетки bEnd.3 со средой DMEM для получения суспензии плотностью 5 x 105 клеток/мл с помощью вихревого смесителя. Затем высевают 200 мкл клеточной суспензии bEnd.3 на ПЭТ-мембрану в верхней камере 24-луночного планшета (размер пор мембраны 0,33см2, 0,4 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пилотное исследование этого протокола не обнаружило различий в результатах при использовании от 5 до 10 пассажей клеток bEnd.3 для экспериментов. Чтобы убедиться в вероятности успешного моделирования, пожалуйста, обратитесь к интервалу номеров ячеек этого протокола. - Добавьте 1200 мкл полной среды в нижнюю камеру планшета, чтобы обеспечить стабилизацию осмотического давления верхней и нижней камер. Существуют различия в объеме добавляемой среды в зависимости от типа; Убедитесь, что уровень жидкости в верхней и нижней камерах находится на одном уровне.
- Меняйте среду верхней и нижней камеры в фиксированное время каждый день и одновременно контролируйте значение сопротивления.
- При смене среды целостность клеточного слоя будет нарушена искусственным прикосновением или чрезмерным движением. Чтобы избежать описанной выше ситуации, медленно удаляйте старую среду с одной стороны пипеткой с отрицательным давлением и медленно добавляйте новую среду вдоль стенки во время обмена жидкости.
4. Измерение TEER
- Перед началом работы поместите резистор, 5% раствор гипохлорита натрия, 75% раствор этанола и раствор двойной дистиллированной воды в сверхчистый стол. Включите УФ-облучение на 30 минут, чтобы устранить остаточные бактерии и болезнетворные микроорганизмы.
- Поместите электроды в 5% раствор гипохлорита натрия при медленном встряхивании на 3–5 с, а затем погрузите в 75% этанол на 15 мин. Наконец, переведите на PBS или раствор двойной дистиллированной воды до использования.
- Включите переключатель на задней панели измерителя резисторов, нажмите кнопку Select Plate (Выбрать пластину ) в соответствии с параметрами, приведенными в таблице 1, и выберите 24-луночную пластину.
- В соответствии с потребностями операции выберите подходящую последовательность обнаружения. В данном исследовании мы выбрали процедуру А1 .
- Вставьте резистор кОм в правый штекер для калибровки прибора. Если результат калибровки составляет 1000 ± 5 Ω, считайте точность прибора нормальной.
- Если результат калибровки не равен 1000 Ω, нажмите Единицы измерения режима на главном интерфейсе, чтобы выбрать OHMS, а затем нажмите Калибровка на главном экране, чтобы повторно откалибровать прибор.
- Вытащите кОм-резистор с правой стороны и замените измерительный электрод соединительным проводом.
- Поместите электрод в 24-луночную пластину без затравочных ячеек вертикально и нажмите Blank Handling (Обработка заготовки ) на главном экране прибора. Фоновое значение сопротивления пластины без засеянных ячеек составляет около 134,4 Ω.
- Вставьте два электрода в верхнюю и нижнюю камеры затравленной пластины с ячейками так, чтобы слой ячеек находился между ними, а затем запишите значение сопротивления, осторожно наступив на педаль.
- Следите за тем, чтобы электрод не касался ячеек в верхней камере и нижней части нижней камеры. Время замачивания электрода в растворе не влияет на величину сопротивления, и необходимо только убедиться, что электрод находится в правильном положении.
- Получите значения TEER (Омсм2) путем умножения значений электрического сопротивления (Ом) на нижнюю площадь (см2) верхней камеры, как в уравнении:
TEER (Омсм 2) = Сопротивление (Ω) x Sвставка (см2) - Нарисуйте линейный график TEER-Time (в днях). Когда значение сопротивления не увеличивается с течением времени (измеряется в течение нескольких дней), считайте, что клетка образовалась как барьер.
NOTW: Монослойная BBB-модель клеток bEnd.3 будет успешно построена путем культивирования клеток bEND.3 с параметрами, указанными в этом исследовании, в течение примерно 6 дней. TEER модели монослоя ячейки bEnd.3 варьировал от 16,49 ± 2,12Омсм2 до 27,59 ± 1,50Омсм2 в течение 6 дней (n=8, среднее ± SD).
5. Разрушение барьеров и статистический анализ
- По кривой TEER - время выберите скважины с барьерной функцией и разделите их на контрольную группу и группу CoCl2 (n = 4).
- Добавьте питательную среду и питательную среду, содержащую 300 мкМ CoCl2 (200 мкл), в верхнюю камеру контрольной группы и CoCl2 соответственно.
- Определяют значения резистентности контрольной и CoCl2 групп через 12 ч и 24 ч инкубации при 37 °C, используя процедуру, описанную в шаге 4.
- Используйте коммерческое программное обеспечение для картирования тренда значений TEER барьера клеток, культивируемых с 300 мкМ CoCl2 или без него.
- Используйте программное обеспечение для статистического анализа для анализа разницы в значениях резистентности между клетками, обработанными CoCl2, и нормальными клетками (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволял регистрировать изменения значений сопротивления клеток по параметрам, заданным в трансэндотелиальном резисторном измерителе. Жизнеспособность клеток bEnd.3 (количество живых клеток), обработанных различными концентрациями CoCl2 , проводили скрининг с помощью анализа CCK-8. Большее повреждение клеток, вызванное CoCl2 , было представлено более низкой жизнеспособностью клеток. Мы обнаружили, что 300 мкМ CoCl2 были значимыми цитотоксическими in vitro, и эта концентрация была использована для следующих экспериментов (рис. 3А). Наблюдая за изменениями сопротивления росту в bEnd.3, мы обнаружили, что значения TEER клеток начали стабилизироваться на5-е сутки. Гипоксическое повреждение, индуцированное добавлением 300 мкМ CoCl2 в верхнюю камеру планшета на6-е сутки, приводило к значительному снижению значений TEER по сравнению с контролем как через 12 ч, так и через 24 ч (рис. 3B). Функцию клеточного барьера можно косвенно оценить по значению TEER, а снижение значения TEER указывает на разрушение клеточного барьера. Значение TEER группы CoCl2 300 мкМ снизилось по сравнению с контрольной группой после инкубации в течение 24 ч. (рис. 3C). Вышеупомянутое исследование показало, что повреждение модели ГЭБ in vitro может быть вызвано гипоксической средой, вызванной CoCl2.
Рисунок 1: Приборы и принадлежности для измерения TEER. (А-Б) Основной интерфейс работы измерителя TEER. (К-Д) 24-луночная пластина. (E) Раствор, необходимый для очистки и дезинфекции электродов. (F) Для калибровки измерителя TEER требуется стандартное сопротивление. (Г-Х) Электрод и локальное увеличение. (I) Для сбора данных использовалась ножная педаль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Блок-схемы трансмембранного сопротивления клеток bEnd.3, зарегистрированные с помощью трансэндотелиального резисторного измерителя. (А) Клеточная культура. (B) Клетки bEnd.3 были высеяны в верхнюю камеру планшетов, и плотный клеточный барьер был сформирован путем заполнения луночных планшетов средой для поддержки их роста и дифференцировки. (C) Барьерную функциональную целостность клеток оценивали с помощью мониторинга TEER. (D) CoCl2 был использован для имитации гипоксической среды, чтобы индуцировать нарушение барьерной функции клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Салидрозид поддерживает целостность барьерной функции клеток bEnd.3, облегчая гипоксическое повреждение, индуцированное CoCl2. (A) Влияние CoCl2 (100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ) на жизнеспособность клеток bEnd.3 (n=6, группа CoCl2 против контрольной группы ***p<0,001, среднее ± SD). (B) График изменений значений TEER клеток bEnd.3, обработанных нормальной средой или 300 мкМ CoCl2 (n=4, 1-й день по сравнению со 2-6-м днем: ##p<0,01, ###p<0,001, 6-й день по сравнению с 6,5-7-м днем: **p<0,01, среднее ± SD). (C) ТЭЭР изменения клеток после 24-часового гипоксического повреждения (n=4, CoCl2 группа по сравнению с контрольной группой ***p<0,001, среднее ± SD). Были проведены односторонние ANOVA и тест Тьюки, и p<0,05 был признан значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметры | Выбор |
| Выберите пластину | 24-Луночный |
| Порядок обнаружения | А1 |
| Единицы измерения режимов | Ω |
| Эталонное сопротивление | 1 кОм |
Таблица 1: Настройка параметров измерителя TEER. Настройки параметров и выбор программы прибора необходимы для определения сопротивления ячейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Один из наиболее развитых органов тела, мозг контролирует широкий спектр сложных физиологических процессов, включая память, познание, слух, обоняниеи движение. Мозг является одним из самых сложных и больных органов человеческого тела одновременно. Возникновение многих расстройств центральной нервной системы демонстрирует тенденцию к росту из года в год из-за таких факторов, как загрязнение воздуха, нерегулярный режим питания и другие факторы 27,28,29. Интересно, что начало и прогрессирование некоторых заболеваний центральной нервной системы, таких как инсульт, эпилепсия и болезнь Альцгеймера (БА), тесно коррелируют с ростом ГЭБ 30,31,32. Основной концепцией лечения большинства расстройств с дисфункцией головного мозга может быть создание новых методов лечения или лекарств для поддержания функционального гомеостаза ГЭБ. К сожалению, большинство лекарств не могут проникнуть в паренхиму головного мозга для выполнения своих жизненно важных функций из-за гидрофобности ГЭБ и его уникального метода транспортировки растворенных веществ14,33. Чтобы повысить вероятность того, что лекарство будет успешным, хорошей стратегией является создание новых моделей ГЭБ, которые могут быть использованы для высокопроизводительного молекулярного скрининга.
Из-за сложного строения сосудисто-нервного блока модель in vivo теоретически имеет более высокую степень моделирования структуры ГЭБ. Однако из-за ограничения гомологии между животными и человеком различия в переносчиках ГЭБ могут привести к тому, что медикаментозный скрининг не даст ожидаемогорезультата. Напротив, модели in vitro обладают такими преимуществами, как недороговизна, быстрый цикл обнаружения и возможность использования для высокопроизводительного скрининга, что может лучше служить целям исследования неврологических заболеваний. С развитием науки и техники создается и совершенствуется все больше и больше моделей in vitro , которые очень напоминают физиологическую структуру ГЭБ. В дополнение к различиям между методами моделирования для статических и динамических платформ, существуют существенные различия в типах и количестве используемых ячеек35. Посев эндотелиальных клеток в нижней части верхней камеры является простейшей моделью клеток ГЭБ и отличным подходом к кинетике транспорта и клеточному сигнальному пути36. Модели кокультур добавляют взаимодействие с перицитами или глиальными клетками на основе монослойных клеток, но эти модели часто ограничены невозможностью получить точное позиционирование клеток и направленный контроль12. Динамическая модель с 2D и 3D структурой в настоящее время является наиболее точным представлением динамического микроокружения ГЭБ in vitro; Тем не менее, важно отметить, что разработка этой модели требует значительных усилий по предварительному проектированию и проверке. Выбор правильной модели ГЭБ в соответствии с реальными потребностями исследования позволяет получить более точные экспериментальные результаты.
Методы оценки функциональной целостности модели ГЭБ in vitro обычно включают тест на проницаемость и тест на значение трансмембранной резистентности. Первое в основном достигается путем оценки проницаемости меченых флуоресцеином высокомолекулярных веществ. Метод прост и точен, но структура клеточного слоя изменяется после прохождения флуоресцентного вещества, что приводит к низкому использованию образца37. Этот недостаток эффективно восполняется развитием метода детектирования TEER. Два электрода размещали по обе стороны слоя ячейки, и целостность барьерной функции оценивали путем измерения сопротивления ионному току через барьерячейки 38. Общее сопротивление вычитали из сопротивления окружающей среде, такого как сопротивление культуральной мембраны и сопротивление среды, и умножали на площадь культуральной мембраны, чтобы получить окончательную стойкость ГЭБ (TEER,Ωcm2)39. Более высокое значение значений TEER представляет собой более высокую степень плотных соединений между клетками. Измерение TEER является простым и неинвазивным, барьерная функция клеток после формирования резистентности будет в стабильном диапазоне. Эта функция позволяет оператору поддерживать одинаковые значения TEER даже при использовании разных приборов в стандартных условиях эксплуатации. Только температура и расположение электрода требуют от оператора повышенного внимания. Повышение температуры и соприкосновение электрода со дном уменьшают сопротивление ячейки.
В этом исследовании была успешно построена простая модель монослойной клетки ГЭБ in vitro путем оценки временного сопротивления клеток bEnd.3 в верхней камере пластины. Гипоксическая среда, индуцированная CoCl2, нарушала плотное соединение между эндотелиальными клетками, что значительно снижало TEER по сравнению с нормальными клетками. Согласно этому протоколу эксперимента, описанному в стандартном процессе создания модели ГЭБ in vitro , имеет высокую успешность и воспроизводимость. Только плотность затравки должна быть изменена, если этот эксперимент проводится с различными спецификациями луночных планшетов, а уровни жидкости в верхней и нижней камерах планшетов находятся на одном уровне. Тем не менее, на значение TEER будет некоторое влияние неправильное расположение электрода и неоднородность электрического поля по всему слою ячейки12. В большинстве случаев ТЭЭР подтверждается одновременно с определением иммунофлуоресценции и проницаемости в зависимости от требований к исследованию различных моделей ГЭБ. Эта клеточная модель будет усовершенствована в будущем, чтобы отсеивать лекарства, которые могут выдержать повреждение ГЭБ, вызванное гипоксией. В заключение, использование технологии обнаружения TEER, вероятно, окажет значительное влияние на создание лекарств и стратегий терапии неврологических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы высоко ценим финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82274207 и 82104533), Программы ключевых исследований и разработок Нинся (2023BEG02012) и Проекта содействия научным исследованиям Xinglin Университета ТКМ в Чэнду (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A.
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M.
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al.
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
