Summary
该协议描述了一种可靠且有效的脑血屏障 体外 模型。该方法使用小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3并测量跨膜电阻。
Abstract
血脑屏障（BBB）是由微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成的动态生理结构。通过协调有害物质的受限转运、营养吸收和大脑中代谢物清除之间的相互作用，血脑屏障对于维持中枢神经系统稳态至关重要。建立血脑屏障的 体外 模型是探索神经系统疾病的病理生理学和创建药物治疗的宝贵工具。本研究描述了一种通过将 bEnd.3 细胞接种到 24 孔板的上腔室中来创建 体外 单层 BBB 细胞模型的过程。为了评估细胞屏障功能的完整性，采用常规的上皮细胞电压表实时记录正常细胞和CoCl2诱导的缺氧细胞的跨膜电阻。我们预计上述实验将为创建BBB的 体外 模型和治疗中枢神经系统疾病的药物提供有效的思路。
Introduction
血脑屏障是血液循环和神经组织之间独特的生物界面，由血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、神经元和其他细胞结构组成1。离子、化学物质和细胞在血液和大脑之间的流动受到该屏障的严格调节。这种稳态可以保护神经组织免受毒素和病原体的侵害，同时也使大脑神经能够正常运作2,3。维持血脑屏障的完整性可以有效预防影响中枢神经系统的疾病的发展和进展，如神经元功能障碍、水肿和神经炎症4.然而，BBB独特的生理特性阻止了超过98%的小分子药物和100%的大分子药物进入中枢神经系统5。因此，在中枢神经系统药物开发过程中增加药物通过血脑屏障的渗透对于实现治疗效果至关重要 6,7。尽管底物的计算机模拟筛选大大提高了候选药物穿越 BBB 的概率，但仍需要可靠且负担得起的体外/体内 BBB 模型来满足科学研究的需要8。
一种快速且经济实惠的高通量药物筛选技术是体外模型9。为了阐明药物对血脑屏障功能影响的基本过程及其在疾病发展和进展中的作用，已经创建了一系列简化的体外血脑屏障模型。目前，常见的体外BBB模型有单层、共培养、动态和微流控模型10,11,12，由血管内皮细胞和星形胶质细胞、周细胞或小胶质细胞13,14构建。尽管 3D 细胞培养物更符合 BBB15 的生理结构，但它们作为 BBB 药物筛选手段的应用仍然受到其复杂设计和低于标准的可重复性的限制。相比之下，单层体外模型是最常用于研究BBB的模型，适用于确定特定细胞中膜转运蛋白和紧密连接蛋白的表达。
跨膜电阻 （TEER） 测量是一种评估和监测电阻层的细胞层并评估屏障的细胞完整性和渗透性的技术。通过同时将两个电极插入单层两侧的生长培养基或缓冲溶液中，可以测量通过电池致密层16,17的交流电或电阻抗。为了确定体外BBB模型是否已正确创建，TEER的测量通常将采用作为金标准18。另一方面，通过测量药物受累后细胞层电阻的变化，可以准确预测药物作用对BBB通透性的趋势19。例如，Feng等人发现，地黄科的主要活性单体楸波尔（地黄科的主要活性单体）可以有效逆转脂多糖诱导的血脑屏障中紧密连接蛋白的下调，提高小鼠脑内皮细胞层20的TEER值。
神经炎症反应通常是血脑屏障稳态失衡的主要原因21.低氧治疗诱发神经炎症损伤是破坏血脑屏障的主要方法，主要包括物理方法和化学试剂方法。前者主要利用三气体培养箱来改变细胞生长环境中的氧含量以模拟缺氧条件22，而后者是通过人为地将脱氧试剂（如CoCl2）引入细胞培养基23来实现的。如果 Fe2+ 被血红素中的 Co2+ 取代，细胞将保持脱氧状态。如果催化基团中的Fe2+被Co2+取代，则脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶活性将受到抑制，导致缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）24的积累。在持续缺氧下，细胞质中HIF-1α的去磷酸化触发细胞死亡并激活血管内皮生长因子，最终提高血管通透性。在先前的研究 25,26 中，已经充分证明缺氧可以显着降低内皮紧密连接蛋白的表达，从而增加 BBB 的通透性。在这项研究中，测量了接种在 24 孔板中的 bEnd.3 细胞的时间电阻曲线，以创建一个简单的 BBB 模型。使用该模型，我们表征了 CoCl2 干预后细胞 TEER 的变化，以构建可用于筛选 BBB 保护药物的细胞模型。
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Protocol
注：将小鼠脑源性内皮细胞.3 （bEnd.3） 接种到 24 孔板的腔室中，以在特定培养基条件下构建简单的 BBB 体外 模型。通过TEER仪测量正常细胞和缺氧细胞的TEER（图1 和 图2）。
1. 溶液制备
- 制备含有FBS（10%，v / v），100U / mL青霉素和10mg / mL链霉素的DMEM细胞培养基（参见 材料表）。
- 通过向 100 μL DMSO 溶液中加入 1.30 mg CoCl2 来制备 100 mM CoCl2 储备溶液。
注：上述所有溶液均在4°C条件下储存，使用前根据所需浓度稀释储备溶液。 - 通过将 2 mL 次氯酸钠溶液加入 38 mL 双蒸水中来制备 5% 次氯酸钠溶液 （v/v）。
2. 细胞培养和细胞活力
- 在含有密度为1×10 6个细胞/mL的DMEM培养基的培养皿（100mm）中接种1mL bEnd.3细胞，并在37°C下在5%CO2的湿化气氛中培养。每 2 至 3 天更换培养基，每周 2 次对细胞进行传代培养。
- bEnd.3细胞生长至80%汇合后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞30秒。
- 使用DMEM培养基通过细胞计数器制备密度为7 x 104 个细胞/mL的bEnd.3细胞悬浮液。然后，在 96 孔板中接种 100 μL bEnd.3 细胞悬液。
- 细胞粘附后，用PBS清洁细胞，并在相同条件下用100μL培养基或含药物培养基（100μM，200μM，300μM，400μM，500μM CoCl2）培养细胞24小时。除去孔板内的培养基并用PBS清洗后，加入100μLCCK-8溶液。
注意： 不要在孔中产生气泡，这会影响光密度 （OD） 的值。 - 将96孔板置于37°C环境中，孵育1小时。使用酶标仪测量96孔板在450nm处的吸光度。
注意：为避免组内差异，在检测前将孔板冷却至室温。 - 根据公式[OD药物 - OD空白]/[OD对照 - OD空白]×100%，计算不同浓度的CoCl2诱导的细胞活力。选择与对照组相比，细胞活力降低有显着差异的CoCl2浓度进行下一次实验。
3.模型组装
- 用PBS冲洗24孔板的上腔室。
注意：细胞在24孔板上腔室的底部生长和融合，细胞之间逐渐形成紧密的连接以发挥屏障作用。如果某些研究中使用的内皮细胞不能独立地在PET膜上形成完全屏障，则需要在细胞接种前用胶原IV溶液涂覆膜。 - 使用涡旋混合器将 bEnd.3 细胞与 DMEM 培养基混合，以 5 x 105 个细胞/mL 的密度制成悬浮液。然后，在 24 孔板（0.33 cm 2,0.4 μm 膜孔径）的上腔室中的 PET 膜上接种 200 μL bEnd.3 细胞悬浮液。
注：该方案的初步研究发现，当使用5至10次bEnd.3细胞进行实验时，结果没有差异。为确保建模成功的概率，请参考本协议的细胞数间隔。 - 向板的下腔室中加入 1200 μL 完全培养基，以确保上下腔室的渗透压趋于稳定。根据类型，添加的培养基体积存在差异;确保上腔和下腔室的液位齐平。
- 每天固定时间更换上腔室和下腔室的介质，同时监测电阻值。
- 更换培养基时，细胞层的完整性会因人工触摸或过度运动而受到破坏。为避免上述情况，用负压移液器从一侧缓慢去除旧介质，并在流体交换过程中沿壁缓慢添加新介质。
4. TEER的测量
- 工作开始前，将电阻器、5% 次氯酸钠溶液、75% 乙醇和双蒸水溶液放入超净工作台中。打开紫外线照射 30 分钟以消除残留的细菌和病原体。
- 将电极置于5%次氯酸钠溶液中，缓慢摇动3秒至5秒，然后浸入75%乙醇中15分钟。最后，转移到PBS或双蒸水溶液中直至使用。
- 打开电池电阻表背面的开关，根据表1中的参数点击选择板，选择24孔板。
- 根据操作需要，选择合适的检测顺序。我们在这项研究中选择了 A1 程序。
- 将 kΩ 电阻插入右侧插头以校准仪器。如果校准结果为 1000 ± 5 Ω，则认为仪器的精度正常。
- 如果校准结果不是1000 Ω，点击主界面的 模式单位 选择 欧姆，再点击主界面的 校准 重新校准仪器。
- 拉出右侧的kΩ电阻，用连接线替换测量电极。
- 将电极放入 24 孔板中，不垂直接种细胞，然后单击仪器主屏幕上的 空白处理 。没有接种细胞的板抗性的背景值约为 134.4 Ω。
- 将两个电极插入带有电池的播种板的上下腔室中，使电池层位于它们之间，然后轻轻踩 踏踏板记录电阻值。
- 确保电极不接触上腔室和下腔室底部的电池。电极在溶液中的浸泡时间对电阻值没有影响，只需要确保电极处于正确的位置即可。
- 通过将电阻值（欧姆）乘以上腔室的底部面积（cm2）获得TEER值（Ωcm2），如等式所示：
TEER （Ωcm2） = 电阻 （Ω） x S插件 （cm2） - 绘制 TEER-Time 的折线图（以天为单位）。当电阻值没有随时间进一步增加（以天为单位测量）时，考虑细胞形成屏障。
注意：bEnd.3 细胞的单层 BBB 模型将通过培养具有本研究中参数的 bEND.3 细胞约 6 天来成功构建。bEnd.3细胞单层模型的TEER范围为16.49±2.12 Ωcm2 至27.59±1.50 Ωcm2,6 天内（n=8，平均值± SD）。
5. 屏障破坏和统计分析
- 根据TEER-时间曲线，选择具有屏障功能的孔，并将其分为对照组和CoCl2 组（n=4）。
- 将培养基和含有300μM CoCl2 （200μL）的培养基分别加入对照组和CoCl2 组上腔。
- 使用步骤4中描述的程序在37°C孵育的12小时和24小时检测对照组和CoCl2 组的电阻值。
- 使用商业软件绘制用或不用 300 μM CoCl2 培养的细胞屏障的 TEER 值趋势。
- 使用统计分析软件分析CoCl2处理的细胞与正常细胞之间的抗性值差异（n=4，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
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Representative Results
该协议允许根据跨内皮电阻仪中设置的参数记录细胞电阻值的变化。采用CCK-8法筛选不同浓度CoCl2处理的bEnd.3细胞（活细胞数）。CoCl2 产生的细胞损伤越大，细胞活力越低。我们发现 300 μM 的 CoCl2 在体外具有显着的细胞毒性，该浓度用于后续实验（图 3A）。通过监测bEnd.3的生长抗性变化，我们发现细胞TEER值在第5天开始稳定。在第6 天向板的上腔室中添加 300 μM CoCl2 引起的缺氧损伤导致与对照组相比，在 12 小时和 24 小时时间点的 TEER 值显着降低（图 3B）。细胞屏障的功能可以通过TEER值间接评估，TEER值的下降表明细胞屏障的破坏。孵育24小时后，与对照组相比，300μM CoCl2组的TEER值下降（图3C）。上述研究表明，体外 BBB 模型的损伤可能是由 CoCl2 引起的缺氧环境引起的。
图 1：用于测量 TEER 的仪器和附件。（A-B） TEER仪表的操作主界面。 （C-D） 24孔板。 （E） 电极清洗和消毒所需的溶液。（F） TEER仪表的校准需要标准电阻。 （G-H） 电极和局部放大倍率。 （I） 使用脚踏板收集数据。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用跨内皮电阻仪记录的 bEnd.3 细胞跨膜电阻的流程图。 （A） 细胞培养。（B） 将 bEnd.3 细胞接种在板的上腔室中，并通过用培养基填充孔板以支持其生长和分化来形成致密的细胞屏障。（C）通过监测TEER评估细胞的屏障功能完整性。（D） CoCl2 用于模拟缺氧环境以诱导受损的细胞屏障功能。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：红景天苷通过减轻 CoCl2 诱导的缺氧损伤来维持 bEnd.3 细胞屏障功能的完整性。 （A） CoCl2 （100 μM、200 μM、300 μM、400 μM、500 μM）对 bEnd.3 细胞活力的影响（n=6，CoCl2 组与对照组 ***p<0.001，平均值 ± SD）。（B） 用正常培养基或 300 μM CoCl2 处理的 bEnd.3 细胞的 TEER 值变化图（n=4，第 1 天与第 2-6 天：##p< 0.01、###p< 0.001，第 6 天与第 6.5 - 7 天：**p<0.01，平均值 ± SD）。（C） 缺氧损伤 24 小时后细胞的 TEER 变化（n=4，CoCl2 组 vs 对照组 ***p<0.001，平均值 ± SD）。进行单因素方差分析和Tukey检验，p<0.05被认为是显著的。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 参数 | 选择 |
| 选择盘子 | 24孔 |
| 检测排序 | 答1 |
| 模式单位 | Ω |
| 标准电阻 | 1 kΩ |
表1：TEER仪表的设置参数。 检测电池电阻需要仪器的参数设置和程序选择。
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Discussion
大脑是最发达的身体器官之一，控制着各种复杂的生理过程，包括记忆、认知、听觉、嗅觉和运动27.大脑是人体最复杂、最患病的器官之一。由于空气污染、饮食习惯不规律和其他因素，许多中枢神经系统疾病的发生呈逐年增长趋势 27,28,29。有趣的是，一些中枢神经系统疾病的开始和进展，如中风、癫痫和阿尔茨海默病（AD），与BBB30,31,32的生长密切相关。治疗大多数脑功能障碍的基本概念可能是创造新的疗法或药物来维持 BBB 功能稳态。不幸的是，由于 BBB 的疏水性及其独特的溶质转运方法，大多数药物无法进入脑实质以发挥其重要功能14,33。为了增加药物成功的可能性，创建可用于高通量分子筛选的新BBB模型是一个很好的策略。
由于神经血管单位结构复杂， 体内模型理论 上对BBB结构的建模程度更高。然而，由于动物和人类之间同源性的限制，血脑屏障转运蛋白的差异可能导致药物筛选没有预期的结果34.相反， 体外 模型具有价格低廉、检测周期快、能够用于高通量筛选等优点，可以更好地服务于神经系统疾病研究的目标。随着科学技术的发展，越来越多的与BBB生理结构非常相似的 体外 模型正在被创建和增强。除了静态和动态平台的模拟技术之间的区别外，使用的细胞类型和数量也存在显着差异35.在上腔室底部接种内皮细胞是最简单的 BBB 细胞模型，也是运输动力学和细胞信号通路36 的绝佳方法。共培养模型在单层细胞的基础上增加了与周细胞或神经胶质细胞的相互作用，但这些模型经常受到无法获得准确细胞定位和定向控制的限制12。具有2D和3D结构的动力学模型是目前BBB体 外动态微环境最准确的表示;然而，需要注意的是，该模型的开发涉及大量的先前设计和验证工作。根据研究的实际需要选择合适的BBB模型，可以获得更准确的实验结果。
BBB体外模型功能完整性的评价方法通常包括渗透性试验和跨膜抗性值试验。前者主要是通过评估荧光素标记的大分子物质的通透性来实现的。该方法简单而精确，但荧光物质通过后细胞层的结构会发生变化，导致样品利用率低37。TEER检测方法的发展有效地弥补了这一不足。将两个电极放置在电池层的两侧，通过测量电池屏障38上的离子电流电阻来评估屏障功能的完整性。从环境阻力中减去总阻力，如培养膜阻力和培养基阻力，乘以培养膜的面积，得到最终的BBB阻力（TEER，Ωcm2）39。TEER 值越高，表示细胞之间的紧密连接程度越高。TEER测量操作简单且无创，细胞屏障功能一旦形成，抗性就会处于稳定范围内。此功能使操作员即使在标准操作条件下使用不同的仪器时也能保持相似的TEER值。只有温度和电极插入的位置需要操作员格外注意。温度的升高和电极接触底部会降低电池电阻。
在这项研究中，通过评估板上腔中 bEnd.3 细胞的时间抗性，成功构建了一个简单的 BBB 单层体 外细胞模型 。CoCl2诱导的缺氧环境破坏了内皮细胞之间的紧密连接，与正常细胞相比，这显着降低了 TEER。根据该实验方案中描述的标准过程，创建 体外 BBB模型具有很高的成功率和可重复性。如果该实验使用不同的孔板规格运行，并且板的上下腔室中的液位是齐平的，则只需要改变接种密度。然而，TEER值将受到电极位置不正确和电场在整个电池层12中的异质性的影响。在大多数情况下，根据各种 BBB 模型的研究要求，将通过免疫荧光和渗透性检测同时确认 TEER。该细胞模型将在未来得到改进，以筛选出可能承受缺氧带来的BBB损伤的药物。总之，TEER检测技术的使用可能会对神经系统疾病的药物和治疗策略的创造产生重大影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
感谢国家自然科学基金（82274207 82104533）、宁夏重点研发计划（2023BEG02012）、成都中医药大学星林学者研究推进项目（XKTD2022013）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A.
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M.
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al.
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
