Summary
Denne protokol beskriver en pålidelig og effektiv in vitro-model af hjernens blodbarriere. Metoden anvender musecerebrale vaskulære endotelceller bEnd.3 og måler transmembran elektrisk modstand.
Abstract
Blod-hjerne-barrieren (BBB) er en dynamisk fysiologisk struktur sammensat af mikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Ved at koordinere samspillet mellem begrænset transit af skadelige stoffer, næringsstofabsorption og metabolitclearance i hjernen er BBB afgørende for at bevare centralnervesystemets homeostase. Opbygning af in vitro-modeller af BBB er et værdifuldt værktøj til at udforske patofysiologien af neurologiske lidelser og skabe farmakologiske behandlinger. Denne undersøgelse beskriver en procedure til oprettelse af en in vitro monolags BBB-cellemodel ved såning af bEnd.3-celler i det øverste kammer på en 24-brøndplade. For at vurdere integriteten af cellebarrierefunktionen blev det konventionelle epitelcellevoltmeter brugt til at registrere den transmembrane elektriske modstand af normale celler og CoCl 2-inducerede hypoxiske celler i realtid. Vi forventer, at ovenstående forsøg vil give effektive ideer til oprettelse af in vitro-modeller af BBB og lægemidler til behandling af lidelser i centralnervesystemet.
Introduction
BBB er en unik biologisk grænseflade mellem blodcirkulation og nervevæv, som består af vaskulære endotelceller, pericytter, astrocytter, neuroner og andre cellulære strukturer1. Strømmen af ioner, kemikalier og celler mellem blodet og hjernen er strengt reguleret af denne barriere. Denne homeostase beskytter nervevævet mod toksiner og patogener, samtidig med at det muliggør en passende funktion af hjernens nerver 2,3. Opretholdelse af BBB's integritet kan effektivt forhindre udvikling og progression af lidelser, der påvirker centralnervesystemet, såsom neuronal dysfunktion, ødem og neuroinflammation4. BBB's unikke fysiologiske egenskaber forhindrer imidlertid mere end 98% af lægemidler med små molekyler og 100% af makromolekylære lægemidler i at komme ind i centralnervesystemet5. Derfor er det vigtigt at øge penetrationen af medicin gennem BBB under udviklingen af lægemidler til centralnervesystemet for at opnå terapeutisk effekt 6,7. Selv om computersimuleringsscreening af substrater har øget sandsynligheden for, at lægemiddelkandidater krydser BBB, er der stadig behov for pålidelige og overkommelige in vitro/in vivo BBB-modeller for at imødekomme behovene inden for videnskabelig forskning8.
En hurtig og overkommelig teknik til high-throughput lægemiddelscreening er in vitro model9. For at belyse de grundlæggende processer for lægemidlers virkninger på BBB-funktionen og deres rolle i udviklingen og udviklingen af sygdom er der skabt en række forenklede in vitro BBB-modeller. På nuværende tidspunkt er de almindelige in vitro BBB-modeller monolags-, co-kultur-, dynamiske og mikrofluidiske modeller 10,11,12, konstrueret af vaskulære endotelceller og astrocytter, pericytter eller mikroglia13,14. Selvom 3D-cellekulturer er mere i overensstemmelse med den fysiologiske struktur af BBB15, er deres anvendelse som et middel til lægemiddelscreening for BBB stadig begrænset af deres indviklede design og subpar reproducerbarhed. I modsætning hertil er monolags in vitro-modellen den, der hyppigst anvendes til forskning i BBB og er anvendelig til bestemmelse af ekspressionen af membrantransportører og tætte forbindelsesproteiner i bestemte celler.
Måling af transmembran elektrisk modstand (TEER) er en teknik til evaluering og overvågning af cellelaget over modstanden og evaluering af barrierens celleintegritet og permeabilitet. Ved samtidig at indsætte to elektroder i vækstmediet eller bufferopløsningen på hver side af monolaget er det muligt at måle vekselstrømmen eller den elektriske impedans gennem cellens kompakte lag16,17. For at afgøre, om in vitro BBB-modellen er oprettet korrekt, vil målingen af TEER normalt blive anvendt som guldstandard18. På den anden side kan tendensen til medicinvirkning på BBB-permeabilitet forudsiges nøjagtigt ved at måle ændringen i cellelagets elektriske modstand efter lægemiddelinvolvering19. For eksempel opdagede Feng et al., at catalpol (den primære aktive monomer af rehmanniae) effektivt kunne vende den lipopolysaccharid-inducerede nedregulering af tight junction-proteiner i BBB og hæve TEER-værdien af musehjernens endotelcellelag20.
Det neuroinflammatoriske respons er normalt hovedårsagen til BBB homeostase ubalance21. Hypoxisk behandling for at fremkalde neuroinflammatorisk skade er den vigtigste metode til at ødelægge blod-hjerne-barrieren, hovedsageligt inklusive fysiske metoder og kemiske reagensmetoder. Førstnævnte anvender primært en tre-gas-inkubator til at variere iltindholdet i cellevækstmiljøet for at simulere hypoxiske forhold22, mens sidstnævnte opnås ved kunstigt at indføre deoxyreagenser såsom CoCl2til cellekulturmediet23. Cellerne forbliver i en deoxygeneret tilstand, hvis Fe2 + erstattes af Co2 + i hæmmen. Hvis Fe2+ erstattes af Co2+ i den katalytiske gruppe, hæmmes prolinhydroxylase og aspartathydroxylaseaktivitet, hvilket resulterer i en akkumulering af hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α)24. Under vedvarende hypoxi udløser dephosphoryleringen af HIF-1α i cytoplasma celledød og aktiverer vaskulær endotelvækstfaktor, hvilket i sidste ende øger vaskulær permeabilitet. I tidligere undersøgelser 25,26 er det blevet godt demonstreret, at hypoxi signifikant kan reducere ekspressionen af endoteltætte forbindelsesproteiner for at øge permeabiliteten af BBB. I denne undersøgelse blev tidsmodstandskurven for bEnd.3-celler podet i plader med 24 brønde målt for at skabe en ligetil BBB-model. Ved hjælp af denne model karakteriserede vi ændringerne i celle TEER efter CoCl2-intervention for at konstruere en cellemodel, der kan bruges til at screene lægemidler til BBB-beskyttelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Musehjerneafledte endotelceller.3 (bEnd.3) blev podet ind i kamrene på en 24-brønds plade for at konstruere en simpel in vitro-model af BBB under specifikke mediumbetingelser. TEER for normale celler og hypoxiske celler blev målt med TEER-meter (figur 1 og figur 2).
1. Forberedelse af opløsning
- Forbered DMEM-cellekulturmediet indeholdende FBS (10%, v / v), 100 E / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin (se materialetabel).
- Forbered 100 mM CoCl2 stamopløsning ved at tilsætte 1,30 mg CoCl2 til 100 μL DMSO opløsning.
BEMÆRK: Alle ovennævnte opløsninger blev opbevaret ved 4 °C, og stamopløsningen blev fortyndet i overensstemmelse med den ønskede koncentration før brug. - Der fremstilles 5% natriumhypochloritopløsning (v/v) ved tilsætning af 2 ml natriumhypochloritopløsning til 38 ml dobbeltdestilleret vand.
2. Cellekultur og cellelevedygtighed
- Der sås 1 ml bEnd.3-celler i dyrkningsskål (100 mm) indeholdende DMEM-substrat med en massefylde på 1 x 106 celler/ml og dyrkning ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2. Skift mediet hver 2. til 3. dag og subkultur cellerne 2x om ugen.
- Efter bEnd.3 celler vokser til 80% sammenløb, fordøje cellerne med 0,25% trypsin i 30 s.
- Lav en suspension af bEnd.3-celler ved densitet på 7 x 104 celler / ml ved hjælp af DMEM-medium gennem en celletæller. Derefter frø 100 μL bEnd.3 cellesuspension i en 96-brøndplade.
- Efter celleadhæsion rengøres cellerne med PBS og cellerne dyrkes med 100 μL dyrkningsmedium eller lægemiddelholdigt medium (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) i 24 timer under de samme betingelser. Efter fjernelse af mediet inde i brøndpladen og rengøring med PBS tilsættes 100 μL CCK-8-opløsning.
BEMÆRK: Generer ikke bobler i brønden, hvilket vil påvirke værdierne for optisk densitet (OD). - 96-brøndsplader anbringes ved 37 °C og inkuberes i 1 time. Absorbansen af pladerne med 96 brønde måles ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
BEMÆRK: For at undgå forskelle inden for gruppen blev brøndpladerne afkølet til stuetemperatur før detektion. - Beregn cellelevedygtigheden induceret af forskellige koncentrationer af CoCl2 i henhold til formlen [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Vælg CoCl2-koncentrationen med en signifikant forskel i reduktion af cellelevedygtighed sammenlignet med kontrolgruppen til det næste eksperiment.
3. Model samling
- Skyl det øverste kammer på pladerne med 24 brønde med PBS.
BEMÆRK: Celler voksede og smeltede sammen i bunden af det øverste kammer på 24-brøndpladen, og tætte krydsninger mellem celler dannede sig gradvist for at spille en barriererolle. Hvis endotelcellerne, der anvendes i nogle undersøgelser, ikke er i stand til at danne en fuldstændig barriere på PET-membraner uafhængigt, kræves belægning af membranerne med kollagen IV-opløsning inden cellepodning. - Bland bEnd.3-cellerne med DMEM-medium for at fremstille en suspension med en densitet på 5 x 105 celler / ml ved hjælp af en hvirvelblander. Derefter frø 200 μL bEnd.3-cellesuspension på PET-membranen i det øverste kammer på en 24-brøndplade (0,33 cm2, 0,4 μm membranporestørrelse).
BEMÆRK: Pilotundersøgelsen af denne protokol fandt ingen forskel i resultaterne ved brug af 5 til 10 passager af bEnd.3-celler til eksperimenter. For at sikre sandsynligheden for vellykket modellering henvises til cellenummerintervallet i denne protokol. - Der tilsættes 1200 μL komplet substrat til pladens nedre kammer for at sikre, at det osmotiske tryk i det øvre og nedre kammer har tendens til at stabilisere sig. Der er forskelle i mængden af tilsat medium afhængigt af typen; Sørg for, at væskeniveauet i de øvre og nedre kamre er flush.
- Skift mediet i det øverste kammer og det nederste kammer på et fast tidspunkt hver dag, og overvåg modstandsværdien på samme tid.
- Når mediet ændres, vil cellelagets integritet blive beskadiget ved kunstig berøring eller overdreven bevægelse. For at undgå ovenstående situation skal du langsomt fjerne det gamle medium fra den ene side med en undertrykspipette og langsomt tilføje et nyt medium langs væggen under væskeudveksling.
4. Måling af TEER
- Før arbejdet begynder, skal du placere modstanden, 5% natriumhypochloritopløsning, 75% ethanol og dobbeltdestilleret vandopløsning i et ultrarent bord. Tænd UV-bestrålingen i 30 minutter for at fjerne resterende bakterier og patogener.
- Anbring elektroderne i 5% natriumhypochloritopløsning med langsom omrystning i 3 s til 5 s, og nedsænk derefter i 75% ethanol i 15 minutter. Overfør til sidst til PBS eller dobbeltdestilleret vandopløsning indtil brug.
- Tænd for kontakten på bagsiden af cellemodstandsmåleren, klik på Vælg plade i henhold til parametrene i tabel 1, og vælg 24-brøndplade.
- I henhold til driftsbehovene skal du vælge den relevante detektionssekvens. Vi valgte A1-proceduren i denne undersøgelse.
- Indsæt en kΩ-modstand i højre stik for at kalibrere instrumentet. Hvis kalibreringsresultatet er 1000 ± 5 Ω, skal du betragte instrumentets nøjagtighed som normal.
- Hvis kalibreringsresultatet ikke er 1000 Ω, skal du klikke på Modeenheder på hovedgrænsefladen for at vælge OHMS og derefter klikke på Kalibrer på hovedskærmen for at kalibrere instrumentet igen.
- Træk kΩ-modstanden ud på højre side, og udskift måleelektroden med en forbindelsesledning.
- Placer elektroden lodret i pladen med 24 brønde uden såning af celler, og klik på Blank Handling på instrumentets hovedskærm. Baggrundsværdien af plademodstanden uden frøede celler er ca. 134, 4 Ω.
- Indsæt de to elektroder i det øverste og nederste kammer på den podede plade med celler, så cellelaget er mellem dem, og registrer derefter modstandsværdien ved forsigtigt at træde på pedalen.
- Sørg for, at elektroden ikke berører cellerne i det øverste kammer og bunden af det nederste kammer. Opblødningstiden for elektroden i opløsningen har ingen indflydelse på modstandsværdien, og det er kun nødvendigt at sikre, at elektroden er i den rigtige position.
- Få TEER-værdier (Ωcm2) ved at gange elektriske modstandsværdier (ohm) med det nederste areal (cm2) i det øverste kammer, som i ligningen:
TEER (Ωcm2) = Modstand (Ω) x Sindsats (cm2) - Tegn et linjeplot af TEER-tid (i dage). Når modstandsværdien ikke stiger yderligere med tiden (målt over dage), skal du betragte cellen som en barriere.
NOTW: Monolags BBB-modellen af bEnd.3-celler vil med succes blive konstrueret ved at dyrke bEND.3-celler med parametrene i denne undersøgelse i ca. 6 dage. TEER af bEnd.3 celle monolagsmodel varierede fra 16,49 ± 2,12 Ωcm2 til 27,59 ± 1,50 Ωcm2 inden for 6 dage (n = 8, gennemsnit ± SD).
5. Ødelæggelse af barrierer og statistisk analyse
- I henhold til TEER-tidskurven skal du vælge brøndene med barrierefunktion og opdele dem i kontrolgruppen og CoCl2-gruppen (n = 4).
- Der tilsættes dyrkningsmediet og dyrkningsmediet indeholdende 300 μMCoCl2 (200 μL) i henholdsvis kontrolgruppen ogCoCl2-gruppens øverste kammer.
- Modstandsværdierne for kontrol- og CoCl2-grupperne detekteres ved 12 timer og 24 timers inkubation ved 37 °C ved hjælp af proceduren beskrevet i trin 4.
- Brug kommerciel software til at kortlægge tendensen for TEER-værdier for barrieren af celler dyrket med eller uden 300 μM CoCl2.
- Brug statistisk analysesoftware til at analysere forskellen i resistensværdier mellem CoCl2-behandlede celler og normale celler (n = 4, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol tillod registrering af ændringer i cellernes modstandsværdier i henhold til parametrene indstillet i transendotelmodstandsmåleren. Levedygtigheden af bEnd.3-celler (antal levende celler) behandlet med forskellige koncentrationer afCoCl2 blev screenet ved CCK-8-assay. Større celleskader produceret afCoCl2 var repræsenteret ved lavere cellelevedygtighed. Vi fandt, at 300 μMCoCl2 var signifikant cytotoksisk in vitro, og denne koncentration blev anvendt til de næste forsøg (figur 3A). Ved at overvåge ændringerne i vækstmodstanden i bEnd.3 fandt vi, at celle-TEER-værdierne begyndte at stabilisere sig på den 5. dag. Hypoxisk skade forårsaget af tilsætning af 300 μM CoCl2 til pladens øverste kammer på 6. dagen resulterede i et signifikant fald i TEER-værdier sammenlignet med kontrollen ved både 12 timer og 24 timers tidspunkter (figur 3B). Cellebarrierens funktion kan indirekte vurderes af TEER-værdien, og et fald i TEER-værdien indikerer nedbrydningen af cellebarrieren. TEER-værdien for 300 μM CoCl2-gruppen faldt i forhold til kontrolgruppen efter inkubation i 24 timer (figur 3C). Den førnævnte forskning viste, at skader på BBB in vitro-modellen kan være forårsaget af et hypoxisk miljø forårsaget af CoCl2.
Figur 1: Instrumenter og tilbehør til måling af TEER. (A-B) TEER-målerens hovedgrænseflade til betjening. (C-D) En plade med 24 brønde. E) Den opløsning, der kræves til elektroderensning og desinfektion. (F) Der kræves standardmodstand til kalibrering af TEER-måleren. (G-H) Elektroden og lokal forstørrelse. (I) Fodpedal blev brugt til at indsamle data. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowdiagrammer over transmembranmodstanden af bEnd.3-celler registreret ved hjælp af en transendotelmodstandsmåler. (A) Cellekultur. (B) bEnd.3-cellerne blev podet i pladernes øverste kammer, og der blev dannet en tæt cellebarriere ved at fylde brøndpladerne med medium for at understøtte deres vækst og differentiering. C) Cellernes barrierefunktionelle integritet blev vurderet ved monitorering af TEER. (D)CoCl2 blev anvendt til at efterligne det hypoxiske miljø for at fremkalde nedsat cellebarrierefunktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Salidrosid opretholder integriteten af barrierefunktionen af bEnd.3-celler ved at lindre CoCl 2-induceret hypoxisk skade. (A) Virkning af CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) på levedygtigheden af bEnd.3-celler (n = 6, CoCl2-gruppe vs kontrolgruppe ***p<0,001, gennemsnit ± SD). (B) Plot af ændringer i TEER-værdier af bEnd.3-celler behandlet med normalt medium eller 300 μM CoCl2 (n = 4, dag 1 vs dag 2-6: # #p<0.01, # # #p<0.001, dag 6 vs dag 6.5 - 7: ** p < 0.01, gennemsnit ± SD). (C) TEER-ændringer af celler efter 24 timers hypoxisk skade (n = 4, CoCl2-gruppe vs kontrolgruppe ***p<0,001, gennemsnit ± SD). Envejs ANOVA og Tukeys test blev udført, og p<0,05 blev betragtet som signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parametre | Valgmulighed |
| Vælg plade | 24-brønd |
| Bestilling af registrering | A1 |
| Mode enheder | Ω |
| Standard modstand | 1 kΩ |
Tabel 1: Indstil parametre for TEER-måleren. Parameterindstillingerne og programvalget af instrumentet er nødvendige for påvisning af cellemodstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af de mest udviklede kropsorganer, hjernen styrer en bred vifte af indviklede fysiologiske processer, herunder hukommelse, kognition, hørelse, lugt og bevægelse27. Hjernen er et af menneskekroppens mest komplicerede og syge organer på samme tid. Forekomsten af mange lidelser i centralnervesystemet viser en stigende tendens år efter år på grund af faktorer, herunder luftforurening, uregelmæssige spisemønstre og andre faktorer 27,28,29. Det er interessant, at begyndelsen og progressionen af nogle sygdomme i centralnervesystemet, såsom slagtilfælde, epilepsi og Alzheimers sygdom (AD), er tæt korreleret med væksten af BBB 30,31,32. Det grundlæggende koncept til behandling af de fleste lidelser med hjernedysfunktion kan være oprettelsen af nye terapier eller medicin til opretholdelse af BBB funktionel homeostase. Desværre kan de fleste lægemidler ikke komme ind i hjernens parenchyma for at udføre deres vitale funktioner på grund af BBBs hydrofobicitet og dens unikke transportmetode til opløst stof14,33. For at øge sandsynligheden for, at et lægemiddel vil blive vellykket, er det en god strategi at skabe nye BBB-modeller, der kan bruges til molekylær screening med høj kapacitet.
På grund af den indviklede struktur af den neurovaskulære enhed har in vivo-modellen teoretisk en højere grad af modellering af BBB-strukturen. På grund af begrænsningen af homologi mellem dyr og mennesker kan afvigelserne i BBB-transportører imidlertid føre til, at screening af medicin ikke har det forventede resultat34. Tværtimod tilbyder in vitro-modeller fordelene ved at være billige, have en hurtig detektionscyklus og være i stand til at blive brugt til screening med høj kapacitet, hvilket bedre kan tjene målene for neurologisk sygdomsforskning. Med udviklingen af videnskab og teknologi skabes og forbedres flere og flere in vitro-modeller , der ligner BBB's fysiologiske struktur. Ud over sondringen mellem simuleringsteknikker til statiske og dynamiske platforme er der betydelige forskelle i de anvendte celletyper og tal35. Såning af endotelceller i bunden af det øverste kammer er den enkleste BBB-cellemodel og en fremragende tilgang til transportkinetik og cellesignalvej36. Co-kulturmodeller tilføjer interaktioner med pericytter eller gliaceller på grundlag af enkeltlagsceller, men disse modeller er ofte begrænset af manglende evne til at opnå nøjagtig cellepositionering og rettet kontrol12. Den dynamiske model med 2D- og 3D-struktur er i øjeblikket den mest nøjagtige repræsentation af det dynamiske mikromiljø af BBB in vitro; Det er dog vigtigt at bemærke, at udviklingen af denne model kræver omfattende forudgående design- og valideringsindsats. Valg af den rigtige BBB-model i overensstemmelse med forskningens reelle behov kan opnå mere nøjagtige eksperimentelle resultater.
Evalueringsmetoderne for BBB in vitro-modellens funktionelle integritet omfatter normalt en permeabilitetstest og transmembranresistensværditest. Førstnævnte opnås hovedsageligt ved at vurdere permeabiliteten af fluoresceinmærkede makromolekylære stoffer. Metoden er ligetil og præcis, men cellelagets struktur ændres, når det fluorescerende stof passerer igennem, hvilket resulterer i lav prøveudnyttelse37. Denne mangel afhjælpes effektivt ved at udvikle TEER-detektionsmetoden. De to elektroder blev placeret på begge sider af cellelaget, og barrierefunktionens integritet blev vurderet ved at måle ionstrømmodstanden over cellebarrieren38. Den samlede modstand blev trukket fra miljømodstanden, såsom kulturmembranresistens og mediumresistens, og ganget med arealet af kulturmembranen for at opnå den endelige BBB-modstand (TEER, Ωcm2)39. En højere værdi af TEER-værdier repræsenterer en højere grad af tætte forbindelser mellem celler. TEER, der måler operationen, er enkel og ikke-invasiv, cellebarrierefunktionen, når den først er dannet, vil være i et stabilt område. Denne funktion gør det muligt for operatøren at opretholde lignende TEER-værdier, selv når der anvendes forskellige instrumenter under standarddriftsbetingelser. Kun temperaturen og placeringen af elektrodeindsættelsen kræver ekstra opmærksomhed fra operatøren. Stigningen i temperaturen og elektroden, der rører bunden, reducerer cellemodstanden.
I denne undersøgelse blev en simpel BBB monolags cellemodel in vitro konstrueret med succes ved at evaluere den tidsmæssige resistens af bEnd.3 celler i pladens øverste kammer. Det hypoxiske miljø induceret afCoCl2forstyrrede den tætte forbindelse mellem endotelceller, hvilket signifikant reducerede TEER sammenlignet med normale celler. Ifølge denne eksperimentprotokol beskrevet i standardprocessen for at skabe en in vitro BBB-model har en høj succesrate og repeterbarhed. Kun såtætheden skal ændres, hvis dette forsøg udføres med forskellige brøndpladespecifikationer, og væskeniveauerne i pladernes øvre og nedre kamre flugter. TEER-værdien vil dog blive noget påvirket af elektrodens forkerte placering og det elektriske felts heterogenitet i hele cellelaget12. I de fleste tilfælde vil TEER blive bekræftet samtidigt ved immunofluorescens og permeabilitetsdetektion afhængigt af undersøgelseskravene i forskellige BBB-modeller. Denne cellemodel vil blive forbedret i fremtiden for at screene medicin, der kan opretholde BBB-skader forårsaget af hypoxi. Afslutningsvis vil brugen af TEER-detektionsteknologi sandsynligvis have en betydelig indvirkning på oprettelsen af medicin og terapistrategier for neurologiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi sætter pris på den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (82274207 og 82104533), Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) og Xinglin Scholar Research Promotion Project fra Chengdu University of TCM (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A.
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M.
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al.
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
