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Neuroscience

बैरियर फंक्शनल इंटीग्रिटी रिकॉर्डिंग bEnd.3 पर ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस डिटेक्शन के माध्यम से वैस्कुलर एंडोथेलियल सेल

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65938
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 4, 1,2, 1,2,5, 2
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क रक्त बाधा के इन विट्रो मॉडल में एक भरोसेमंद और कुशल का वर्णन करता है। विधि माउस सेरेब्रल संवहनी endothelial कोशिकाओं bEnd.3 का उपयोग करता है और transmembrane विद्युत प्रतिरोध उपायों.

Abstract

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक गतिशील शारीरिक संरचना है जो माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट्स से बना है। मस्तिष्क में हानिकारक पदार्थों के प्रतिबंधित पारगमन, पोषक तत्वों के अवशोषण और मेटाबोलाइट निकासी के बीच बातचीत का समन्वय करके, बीबीबी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र होमियोस्टेसिस के संरक्षण में आवश्यक है। बीबीबी के इन विट्रो मॉडल में बिल्डिंग न्यूरोलॉजिकल विकारों के पैथोफिज़ियोलॉजी की खोज और औषधीय उपचार बनाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। यह अध्ययन 24-वेल प्लेट के ऊपरी कक्ष में bEnd.3 कोशिकाओं को बोकर इन विट्रो मोनोलेयर BBB सेल मॉडल बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। सेल बाधा समारोह की अखंडता का आकलन करने के लिए, पारंपरिक उपकला सेल वाल्टमीटर का उपयोग वास्तविक समय में सामान्य कोशिकाओं और सीओसीएल2-प्रेरित हाइपोक्सिक कोशिकाओं के ट्रांसमेम्ब्रेन विद्युत प्रतिरोध को रिकॉर्ड करने के लिए किया गया था। हम आशा करते हैं कि उपरोक्त प्रयोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों के विकारों के इलाज के लिए बीबीबी और दवाओं के इन विट्रो मॉडल के निर्माण के लिए प्रभावी विचार प्रदान करेंगे।

Introduction

बीबीबी रक्त परिसंचरण और तंत्रिका ऊतक के बीच एक अद्वितीय जैविक इंटरफ़ेस है, जो संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स और अन्यसेलुलर संरचनाओं से बना है। रक्त और मस्तिष्क के बीच आयनों, रसायनों और कोशिकाओं के प्रवाह को इस बाधा द्वारा सख्ती से नियंत्रित किया जाता है। यह होमियोस्टेसिस विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों के खिलाफ तंत्रिका ऊतकों की रक्षा करता है जबकि मस्तिष्क की नसों के उचित संचालन को भी सक्षम करता है 2,3. बीबीबी की अखंडता को बनाए रखने से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने वाले विकारों के विकास और प्रगति को प्रभावी ढंग से रोका जा सकता है, जैसे कि न्यूरोनल डिसफंक्शन, एडिमा और न्यूरोइन्फ्लेमेशन4. हालांकि, बीबीबी के अद्वितीय शारीरिक गुण 98% से अधिक छोटे अणु दवाओं और 100% मैक्रोमोलेक्यूलर फार्मास्यूटिकल्स को केंद्रीय तंत्रिका तंत्रमें प्रवेश करने से रोकते हैं। इसलिए, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए दवाओं के विकास के दौरान बीबीबी के माध्यम से दवाओं के प्रवेश में वृद्धि चिकित्सीय प्रभावकारिता 6,7 को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. भले ही सब्सट्रेट की कंप्यूटर सिमुलेशन स्क्रीनिंग ने बीबीबी को पार करने वाले दवा उम्मीदवारों की संभावना को काफी बढ़ा दिया है, वैज्ञानिक अनुसंधान8 की जरूरतों को पूरा करने के लिए इन विट्रो / इन विवो बीबीबी मॉडल में विश्वसनीय और सस्ती अभी भी आवश्यक हैं।

उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक त्वरित और सस्ती तकनीक इन विट्रो मॉडल9 है। बीबीबी फ़ंक्शन पर दवाओं के प्रभाव की मूलभूत प्रक्रियाओं और बीमारी के विकास और प्रगति में उनके हिस्से पर प्रकाश डालने के लिए, इन विट्रो बीबीबी मॉडल में सरलीकृत की एक श्रृंखला बनाई गई है। वर्तमान में, इन विट्रो बीबीबी मॉडल में आम मोनोलेयर, सह-संस्कृति, गतिशील, और माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल10,11,12 हैं, जो संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसाइट्स या माइक्रोग्लिया13,14द्वारा निर्मित हैं। हालांकि 3 डी सेल संस्कृतियों बीबीबी15 की शारीरिक संरचना के अनुरूप हैं, बीबीबी के लिए दवा स्क्रीनिंग के साधन के रूप में उनका आवेदन अभी भी उनके जटिल डिजाइन और सबपर प्रजनन क्षमता से विवश है। इसके विपरीत, मोनोलेयर इन विट्रो मॉडल बीबीबी पर शोध करने के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है और विशेष कोशिकाओं में झिल्ली ट्रांसपोर्टरों और तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए लागू होता है।

ट्रांसमेम्ब्रेन विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप प्रतिरोध में कोशिकाओं की परत का मूल्यांकन और निगरानी करने और सेल अखंडता और बाधा की पारगम्यता का मूल्यांकन करने की एक तकनीक है। मोनोलेयर के दोनों ओर विकास माध्यम या बफर समाधान में एक साथ दो इलेक्ट्रोड डालने से, सेल की कॉम्पैक्ट परत16,17 के माध्यम से प्रत्यावर्ती वर्तमान या विद्युत प्रतिबाधा को मापना संभव है। यह निर्धारित करने के लिए कि इन विट्रो बीबीबी मॉडल ठीक से बनाया गया है या नहीं, टीईईआर का माप आमतौर पर सोने के मानक18 के रूप में नियोजित किया जाएगा। दूसरी ओर, बीबीबी पारगम्यता पर दवा कार्रवाई की प्रवृत्ति सही दवा की भागीदारी19 के बाद सेल परत के विद्युत प्रतिरोध में परिवर्तन को मापने के द्वारा भविष्यवाणी की जा सकती है. उदाहरण के लिए, फेंग एट अल ने पाया कि कैटलपोल (रहमानिया का प्राथमिक सक्रिय मोनोमर) बीबीबी में तंग जंक्शन प्रोटीन के लिपोपॉलेसेकेराइड-प्रेरित डाउन-विनियमन को प्रभावी ढंग से उलट सकता है और माउस मस्तिष्क एंडोथेलियल सेल परत20 के टीईईआर मूल्य को बढ़ा सकता है।

न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया आमतौर पर बीबीबी होमियोस्टेसिस असंतुलन21 का मुख्य कारण है। न्यूरोइन्फ्लेमेटरी चोट को प्रेरित करने के लिए हाइपोक्सिक उपचार रक्त-मस्तिष्क बाधा को नष्ट करने का मुख्य तरीका है, जिसमें मुख्य रूप से भौतिक तरीकों और रासायनिक अभिकर्मक विधियों शामिल हैं। पूर्व मुख्य रूप से हाइपोक्सिक स्थितियों22 अनुकरण करने के लिए सेल विकास पर्यावरण में ऑक्सीजन सामग्री को बदलने के लिए एक तीन-गैस इनक्यूबेटर का उपयोग करता है, जबकि उत्तरार्द्ध कृत्रिम रूप से सेल संस्कृति माध्यम23 के लिए CoCl2 जैसे डीऑक्सी अभिकर्मकों को पेश करके प्राप्त किया जाता है। कोशिकाओं को एक ऑक्सीजन रहित स्थिति में रहना होगा यदि Fe2+ को हेम में Co2+ के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है। यदि उत्प्रेरक समूह में Fe2+ को Co2+ के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है, तो प्रोलाइन हाइड्रॉक्सिलेज़ और एस्पार्टेट हाइड्रॉक्सिलस गतिविधि बाधित हो जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर-1α (HIF-1α)24का संचय होगा। लगातार हाइपोक्सिया के तहत, साइटोप्लाज्म में HIF-1α का डीफॉस्फोराइलेशन कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करता है और संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक को सक्रिय करता है, जो अंततः संवहनी पारगम्यता को बढ़ाता है। पिछले अध्ययनों25,26 में, यह अच्छी तरह से प्रदर्शित किया गया है कि हाइपोक्सिया बीबीबी की पारगम्यता बढ़ाने के लिए एंडोथेलियल तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को काफी कम कर सकता है। इस अध्ययन में, 24-अच्छी प्लेटों में वरीयता प्राप्त bEnd.3 कोशिकाओं के समय-प्रतिरोध वक्र को एक सीधा BBB मॉडल बनाने के लिए मापा गया था। इस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने सेल मॉडल का निर्माण करने के लिए CoCl2 हस्तक्षेप के बाद सेल TEER में परिवर्तनों की विशेषता बताई जिसका उपयोग BBB सुरक्षा के लिए दवाओं को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: माउस मस्तिष्क व्युत्पन्न Endothelial कोशिकाओं.3 (bEnd.3) विशिष्ट मध्यम परिस्थितियों में BBB के इन विट्रो मॉडल में एक सरल निर्माण करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली के कक्षों में inoculated थे. सामान्य कोशिकाओं और हाइपोक्सिक कोशिकाओं के टीईईआर को टीईईआर मीटर(चित्रा 1 और चित्रा 2)द्वारा मापा गया।

1. समाधान तैयार करना

  1. एफबीएस (10%, वी / वी), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. 1.30 मिलीग्राम CoCl2 से 100 μL DMSO समाधान जोड़कर 100 मिमी CoCl2 स्टॉक समाधान तैयार करें।
    नोट: उपरोक्त सभी समाधान 4 डिग्री सेल्सियस स्थिति में संग्रहीत किए गए थे, और स्टॉक समाधान उपयोग से पहले वांछित एकाग्रता के अनुसार पतला था।
  3. डबल आसुत जल के 38 एमएल के लिए सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के 2 एमएल जोड़कर 5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान (वी /

2. सेल संस्कृति और सेल व्यवहार्यता

  1. कल्चर डिश (100 मिमी) में bEnd.3 कोशिकाओं के बीज 1 एमएल जिसमें 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर डीएमईएम माध्यम होता है और 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति होती है। हर 2 से 3 दिनों में माध्यम बदलें और सप्ताह में 2x कोशिकाओं को उपसंस्कृति दें।
  2. bEnd.3 कोशिकाओं के 80% संगम तक बढ़ने के बाद, 30 s के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को पचाएं।
  3. एक सेल काउंटर के माध्यम से DMEM माध्यम का उपयोग कर 7 x 104 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर bEnd.3 कोशिकाओं का निलंबन बनाएं। फिर, 96-अच्छी प्लेट में bEnd.3 सेल निलंबन के बीज 100 माइक्रोन।
  4. सेल आसंजन के बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को साफ करें और संस्कृति के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम या दवा युक्त माध्यम (100 माइक्रोन, 200 माइक्रोन, 300 माइक्रोन, 400 माइक्रोन, 500 माइक्रोन सीओसीएल2) के साथ समान परिस्थितियों में 24 घंटे के लिए। अच्छी तरह से थाली के अंदर माध्यम को हटाने और पीबीएस के साथ यह सफाई के बाद, सीसीके -8 समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें.
    नोट: अच्छी तरह से बुलबुले उत्पन्न न करें, जो ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के मूल्यों को प्रभावित करेगा।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर्यावरण में 96 अच्छी तरह से प्लेटें रखो और 1 घंटे के लिए सेते हैं. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर 450 एनएम पर 96 अच्छी तरह से प्लेटों के अवशोषण को मापें.
    नोट: इंट्रा-ग्रुप मतभेदों से बचने के लिए, अच्छी तरह से प्लेटों का पता लगाने से पहले कमरे के तापमान पर ठंडा किया गया था।
  6. सूत्र के अनुसार CoCl2 की विभिन्न सांद्रता द्वारा प्रेरित सेल व्यवहार्यता की गणना करें [ODड्रग - ODरिक्त] / [ODनियंत्रण-OD रिक्त] x 100%। अगले प्रयोग के लिए नियंत्रण समूह के साथ तुलना में सेल व्यवहार्यता में कमी में एक महत्वपूर्ण अंतर के साथ CoCl2 एकाग्रता का चयन करें.

3. मॉडल विधानसभा

  1. पीबीएस के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेटों के ऊपरी कक्ष कुल्ला.
    नोट: कोशिकाओं में वृद्धि हुई और 24 अच्छी तरह से थाली के ऊपरी कक्ष के तल पर जुड़े हुए, और कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों धीरे-धीरे एक बाधा भूमिका निभाने के लिए गठित. यदि कुछ अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली एंडोथेलियल कोशिकाएं स्वतंत्र रूप से पीईटी झिल्ली पर एक पूर्ण अवरोध बनाने में सक्षम नहीं हैं, तो सेल टीकाकरण से पहले कोलेजन IV समाधान के साथ झिल्ली को कोटिंग करना आवश्यक है।
  2. एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर निलंबन बनाने के लिए DMEM माध्यम के साथ bEnd.3 कोशिकाओं को मिलाएं। फिर, 24-अच्छी प्लेट (0.33 सेमी2, 0.4 माइक्रोन झिल्ली ताकना आकार) के ऊपरी कक्ष में पीईटी झिल्ली पर bEnd.3 सेल निलंबन के बीज 200 माइक्रोन।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के पायलट अध्ययन में प्रयोगों के लिए bEnd.3 कोशिकाओं के 5 से 10 मार्ग का उपयोग करते समय परिणामों में कोई अंतर नहीं मिला। सफल मॉडलिंग की संभावना सुनिश्चित करने के लिए, कृपया इस प्रोटोकॉल के सेल नंबर अंतराल को देखें।
  3. प्लेट के निचले कक्ष में पूर्ण माध्यम के 1200 माइक्रोन जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऊपरी और निचले कक्षों का आसमाटिक दबाव स्थिर हो जाता है। प्रकार के आधार पर जोड़े गए माध्यम की मात्रा में अंतर हैं; सुनिश्चित करें कि ऊपरी और निचले कक्षों का तरल स्तर फ्लश है।
  4. ऊपरी कक्ष और निचले कक्ष के माध्यम को हर दिन एक निश्चित समय पर बदलें और एक ही समय में प्रतिरोध मूल्य की निगरानी करें।
    1. माध्यम बदलते समय, कृत्रिम स्पर्श या अत्यधिक आंदोलन से सेल परत की अखंडता क्षतिग्रस्त हो जाएगी। उपरोक्त स्थिति से बचने के लिए, धीरे-धीरे एक नकारात्मक दबाव विंदुक के साथ एक तरफ से पुराने माध्यम को हटा दें और धीरे-धीरे द्रव विनिमय के दौरान दीवार के साथ एक नया माध्यम जोड़ें।

4. TEER का मापन

  1. काम शुरू होने से पहले, रोकनेवाला, 5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान, 75% इथेनॉल, और डबल आसुत जल समाधान को अल्ट्रा-क्लीन टेबल में रखें। अवशिष्ट बैक्टीरिया और रोगजनकों को खत्म करने के लिए 30 मिनट के लिए यूवी विकिरण चालू करें।
  2. इलेक्ट्रोड को 5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान में 3 एस से 5 एस के लिए धीमी गति से मिलाते हुए रखें, और फिर 15 मिन के लिए 75% इथेनॉल में विसर्जित करें। अंत में, उपयोग करने तक पीबीएस या डबल आसुत जल समाधान में स्थानांतरण।
  3. सेल रोकनेवाला मीटर के पीछे स्विच चालू करें, तालिका 1 में मापदंडों के अनुसार प्लेट का चयन करें पर क्लिक करें, और 24-वेल प्लेट का चयन करें।
  4. ऑपरेशन की जरूरतों के अनुसार, उपयुक्त डिटेक्शन अनुक्रम का चयन करें। हमने इस अध्ययन में A1 प्रक्रिया का चयन किया।
  5. उपकरण को कैलिब्रेट करने के लिए दाहिने प्लग में kΩ रोकनेवाला डालें। यदि अंशांकन परिणाम 1000 ± 5 Ω है, तो उपकरण की सटीकता को सामान्य मानें।
    1. अंशांकन परिणाम 1000 Ω नहीं है, तो OHMS का चयन करने के लिए मुख्य इंटरफ़ेस पर मोड इकाइयों पर क्लिक करें, और उसके बाद साधन फिर से calibrate करने के लिए मुख्य स्क्रीन पर कैलिब्रेट क्लिक करें.
  6. दाईं ओर kΩ रोकनेवाला बाहर निकालें और मापने वाले इलेक्ट्रोड को कनेक्टिंग तार से बदलें।
  7. इलेक्ट्रोड को लंबवत कोशिकाओं को बोने के बिना 24-अच्छी प्लेट में रखें और उपकरण की मुख्य स्क्रीन पर ब्लैंक हैंडलिंग पर क्लिक करें। बीज प्राप्त कोशिकाओं के बिना प्लेट प्रतिरोध की पृष्ठभूमि मूल्य के बारे में 134.4 Ω है.
  8. कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त प्लेट के ऊपरी और निचले कक्षों में दो इलेक्ट्रोड डालें ताकि सेल परत उनके बीच हो, और फिर धीरे पेडल पर कदम रखकर प्रतिरोध मूल्य रिकॉर्ड करें।
    1. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड ऊपरी कक्ष में कोशिकाओं और निचले कक्ष के नीचे स्पर्श नहीं करता है. समाधान में इलेक्ट्रोड के भिगोने के समय का प्रतिरोध मूल्य पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, और केवल यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि इलेक्ट्रोड सही स्थिति में है।
  9. ऊपरी कक्ष के निचले क्षेत्र (सेमी2) के साथ विद्युत प्रतिरोध मूल्यों (ओम) को गुणा करके TEER मान (Ωcm2) प्राप्त करें, जैसा कि समीकरण में है:
    TEER (Ωcm2) = प्रतिरोध (Ω) x Sइन्सर्ट (cm2)
  10. TEER-समय (दिनों में) का एक रेखा आलेख खींचिए। जब प्रतिरोध मूल्य समय के साथ आगे नहीं बढ़ता है (दिनों में मापा जाता है), तो सेल पर विचार करें कि एक बाधा बनाई गई है।
    NOTW: bEnd.3 कोशिकाओं के मोनोलेयर BBB मॉडल का निर्माण लगभग 6 दिनों के लिए इस अध्ययन में मापदंडों के साथ bEND.3 कोशिकाओं की खेती करके सफलतापूर्वक किया जाएगा। bEnd.3 सेल मोनोलेयर मॉडल का TEER 6 दिनों के भीतर 16.49 ± 2.12 Ωcm2 से 27.59 ± 1.50 Ωcm2 (n = 8, मतलब ± SD) तक था।

5. बाधा विनाश और सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. TEER - समय वक्र के अनुसार, बाधा समारोह के साथ कुओं का चयन करें और उन्हें नियंत्रण समूह और CoCl2 समूह (एन = 4) में विभाजित करें।
  2. क्रमशः नियंत्रण समूह और CoCl2 समूह ऊपरी कक्ष में 300 माइक्रोन CoCl2 (200 μL) युक्त संस्कृति माध्यम और संस्कृति माध्यम जोड़ें।
  3. चरण 4 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके नियंत्रण और2 समूहों के प्रतिरोध मूल्यों को 12 घंटे और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 24 घंटे का पता लगाएं।
  4. 300 माइक्रोन सीओसीएल2 के साथ या बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं के अवरोध के टीईईआर मूल्यों की प्रवृत्ति को मैप करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  5. CoCl2-उपचारित कोशिकाओं और सामान्य कोशिकाओं (n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) के बीच प्रतिरोध मूल्यों में अंतर का विश्लेषण करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल ने ट्रांसेंडोथेलियल रोकनेवाला मीटर में निर्धारित मापदंडों के अनुसार कोशिकाओं के प्रतिरोध मूल्यों में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग की अनुमति दी। CoCl2 की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किए गए bEnd.3 कोशिकाओं (जीवित कोशिकाओं की संख्या) की व्यवहार्यता CCK-8 परख द्वारा जांच की गई थी। CoCl2 द्वारा उत्पादित ग्रेटर सेल क्षति को कम सेल व्यवहार्यता द्वारा दर्शाया गया था। हमने पाया कि CoCl2 के 300 माइक्रोन इन विट्रो में काफी साइटोटॉक्सिक था, और इस एकाग्रता का उपयोग अगले प्रयोगों(चित्रा 3ए)के लिए किया गया था। bEnd.3 में विकास प्रतिरोध परिवर्तनों की निगरानी करके, हमने पाया कि सेल TEER मान 5वें दिन स्थिर होने लगे। 6वें दिन प्लेट के ऊपरी कक्ष में 300 माइक्रोन सीओसीएल2 के अलावा प्रेरित हाइपोक्सिक चोट के परिणामस्वरूप 12 घंटे और 24 घंटे समय बिंदु(चित्रा 3बी)दोनों पर नियंत्रण की तुलना में टीईईआर मूल्यों में उल्लेखनीय कमी आई। सेल बैरियर के कार्य का अप्रत्यक्ष रूप से TEER मान द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, और TEER मान में गिरावट सेल बाधा के टूटने को इंगित करती है। 300 माइक्रोन CoCl2 समूह के TEER मूल्य 24 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद नियंत्रण समूह की तुलना में गिरा (चित्रा 3C). उपरोक्त शोध से पता चला है कि बीबीबी इन विट्रो मॉडल को नुकसान सीओसीएल 2 के कारण हाइपोक्सिक वातावरण के कारण हो सकताहै।

Figure 1
चित्र 1: TEER को मापने के लिए उपकरण और सहायक उपकरण। (ए-बी) TEER मीटर का ऑपरेशन मुख्य इंटरफ़ेस। (सीडी) एक 24-अच्छी तरह से प्लेट। (ई) इलेक्ट्रोड सफाई और कीटाणुशोधन के लिए आवश्यक समाधान। (एफ) टीईईआर मीटर के अंशांकन के लिए मानक प्रतिरोध की आवश्यकता होती है। (जीएच) इलेक्ट्रोड और स्थानीय आवर्धन। (I) डेटा एकत्र करने के लिए फुट पेडल का उपयोग किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक transendothelial रोकनेवाला मीटर का उपयोग कर दर्ज bEnd.3 कोशिकाओं के transmembrane प्रतिरोध के प्रवाह चार्ट. (ए) सेल संस्कृति। (बी) bEnd.3 कोशिकाओं प्लेटों के ऊपरी कक्ष में वरीयता प्राप्त थे, और एक घने सेल बाधा उनके विकास और भेदभाव का समर्थन करने के लिए माध्यम के साथ अच्छी तरह से प्लेटों को भरने के द्वारा गठन किया गया था. (सी) कोशिकाओं की बाधा कार्यात्मक अखंडता टीईईआर की निगरानी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। (डी) सीओसीएल2 का उपयोग बिगड़ा हुआ सेल बाधा समारोह को प्रेरित करने के लिए हाइपोक्सिक वातावरण की नकल करने के लिए किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Salidroside CoCl3-प्रेरित हाइपोक्सिक चोट को कम करके bEnd.2 कोशिकाओं के बाधा समारोह की अखंडता को बनाए रखता है। (ए) bEnd.3 कोशिकाओं (n = 6, CoCl2 समूह बनाम नियंत्रण समूह *** p<0.001, मतलब ± एसडी) की व्यवहार्यता पर CoCl2 (100 माइक्रोन, 200 माइक्रोन, 300 माइक्रोन, 400 माइक्रोन) का प्रभाव (बी) सामान्य माध्यम या 300 माइक्रोन सीओसीएल2 (एन = 4, दिन 1 बनाम दिन 2-6) के साथ इलाज किए गए bEnd.3 कोशिकाओं के TEER मूल्यों में परिवर्तन का प्लॉट: # #p<0.01, # # #p< 0.001, दिन 6 बनाम दिन 6.5 - 7: ** पी <0.01, मतलब ± एसडी)। (सी)24 घंटे हाइपोक्सिक चोट (एन = 4, सीओसीएल2 समूह बनाम नियंत्रण समूह *** पी<0.001, मतलब ± एसडी) के बाद कोशिकाओं के टीईईआर परिवर्तन। एक तरफा एनोवा और टुकी के परीक्षण किए गए, और पी <0.05 को महत्वपूर्ण माना गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पैरामीटर विकल्प
प्लेट का चयन करें 24-अच्छी तरह से
डिटेक्शन ऑर्डरिंग ए 1
मोड इकाइयाँ Ω
मानक प्रतिरोध 1 kΩ

तालिका 1: TEER मीटर के पैरामीटर सेट करें। सेल प्रतिरोध का पता लगाने के लिए उपकरण की पैरामीटर सेटिंग्स और प्रोग्राम चयन की आवश्यकता होती है।

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Discussion

सबसे विकसित शारीरिक अंगों में से एक, मस्तिष्क जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को नियंत्रित करता है, जिसमें स्मृति, अनुभूति, श्रवण, गंध और आंदोलन27 शामिल हैं। मस्तिष्क एक ही समय में मानव शरीर के सबसे जटिल और रोगग्रस्त अंगों में से एक है। कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों की घटना वायु प्रदूषण, अनियमित खाने के पैटर्न और अन्य कारकों27,28,29 सहित कारकों के कारण साल दर साल बढ़ती प्रवृत्ति को दर्शाती है। यह दिलचस्प है कि कुछ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों की शुरुआत और प्रगति, जैसे स्ट्रोक, मिर्गी और अल्जाइमर रोग (एडी), बीबीबी30,31,32 के विकास के साथ निकटता से संबंधित हैं। मस्तिष्क की शिथिलता के साथ अधिकांश विकारों के उपचार के लिए मूल अवधारणा बीबीबी कार्यात्मक होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए नए उपचार या दवाओं का निर्माण हो सकता है। दुर्भाग्य से, अधिकांश दवाएं बीबीबी की हाइड्रोफोबिसिटी और इसकी अनूठी विलेय परिवहन विधि14,33 के कारण अपने महत्वपूर्ण कार्यों को करने के लिए मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रवेश नहीं कर सकती हैं। इस संभावना को बढ़ाने के लिए कि एक दवा सफल होगी, नए बीबीबी मॉडल बनाना एक अच्छी रणनीति है जिसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट आणविक स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है।

न्यूरोवास्कुलर यूनिट की जटिल संरचना के कारण, इन विवो मॉडल में सैद्धांतिक रूप से बीबीबी संरचना के मॉडलिंग की उच्च डिग्री है। हालांकि, जानवरों और मनुष्यों के बीच होमोलॉजी के प्रतिबंध के कारण, बीबीबी ट्रांसपोर्टरों में भिन्नता से दवा स्क्रीनिंग हो सकती है जो अपेक्षित परिणामनहीं है 34. इसके विपरीत, इन विट्रो मॉडल सस्ती होने, त्वरित पहचान चक्र होने और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने में सक्षम होने के फायदे प्रदान करते हैं, जो न्यूरोलॉजिकल रोग अनुसंधान के उद्देश्यों को बेहतर ढंग से पूरा कर सकते हैं। विज्ञान और प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, अधिक से अधिक इन विट्रो मॉडल जो बीबीबी की शारीरिक संरचना से मिलते-जुलते हैं, बनाए और बढ़ाए जा रहे हैं। स्थिर और गतिशील प्लेटफार्मों के लिए सिमुलेशन तकनीकों के बीच अंतर के अलावा, सेल प्रकार और35 का उपयोग किया जाने वाली संख्याओं में महत्वपूर्ण अंतर हैं। ऊपरी कक्ष के तल पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीडिंग करना सबसे सरल बीबीबी सेल मॉडल है और परिवहन कैनेटीक्स और सेल सिग्नलिंग मार्ग36 के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण है। सह-संस्कृति मॉडल मोनोलेयर कोशिकाओं की नींव पर पेरिसाइट्स या ग्लियल कोशिकाओं के साथ बातचीत जोड़ते हैं, लेकिन इन मॉडलों को अक्सर सटीक सेल पोजिशनिंग और निर्देशित नियंत्रण12 प्राप्त करने में असमर्थता से विवश किया जाता है। 2 डी और 3 डी संरचना के साथ गतिशील मॉडल वर्तमान में इन विट्रो में बीबीबी के गतिशील माइक्रोएन्वायरमेंट का सबसे सटीक प्रतिनिधित्व है; हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस मॉडल के विकास में व्यापक पूर्व डिजाइन और सत्यापन प्रयास शामिल हैं। अनुसंधान की वास्तविक जरूरतों के अनुसार उचित बीबीबी मॉडल का चयन अधिक सटीक प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त कर सकता है।

इन विट्रो मॉडल में बीबीबी की कार्यात्मक अखंडता के मूल्यांकन विधियों में आमतौर पर एक पारगम्यता परीक्षण और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रतिरोध मूल्य परीक्षण शामिल होता है। पूर्व मुख्य रूप से फ्लोरेसिन-लेबल वाले मैक्रोमोलेक्यूलर पदार्थों की पारगम्यता का आकलन करके पूरा किया जाता है। विधि सीधा और सटीक है, लेकिन फ्लोरोसेंट पदार्थ के माध्यम से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप कम नमूना उपयोग37 के माध्यम से सेल परत की संरचना बदल जाती है. यह कमी प्रभावी रूप से TEER डिटेक्शन विधि के विकास के लिए बनाई गई है। दो इलेक्ट्रोड सेल परत के दोनों किनारों पर रखा गया था, और बाधा समारोह की अखंडता सेल बाधा38 भर में आयन वर्तमान प्रतिरोध को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. कुल प्रतिरोध को पर्यावरण प्रतिरोध से घटाया गया था, जैसे कि संस्कृति झिल्ली प्रतिरोध और मध्यम प्रतिरोध, और अंतिम बीबीबी प्रतिरोध (टीईईआर, Ωcm2)39प्राप्त करने के लिए संस्कृति झिल्ली के क्षेत्र से गुणा किया गया था। टीईईआर मूल्यों का एक उच्च मूल्य कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों की एक उच्च डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है। ऑपरेशन को मापने वाला टीईईआर सरल और गैर-आक्रामक है, एक बार गठित प्रतिरोध एक स्थिर सीमा में सेल बाधा फ़ंक्शन होगा। यह सुविधा ऑपरेटर को मानक परिचालन स्थितियों के तहत विभिन्न उपकरणों का उपयोग करते समय भी समान TEER मूल्यों को बनाए रखने में सक्षम बनाती है। केवल तापमान और इलेक्ट्रोड सम्मिलन की नियुक्ति के लिए ऑपरेटर से अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है। तापमान में वृद्धि और नीचे को छूने वाले इलेक्ट्रोड से सेल प्रतिरोध कम हो जाएगा।

इस अध्ययन में, इन विट्रो में एक सीधा बीबीबी मोनोलेयर सेल मॉडल सफलतापूर्वक प्लेट के ऊपरी कक्ष में bEnd.3 कोशिकाओं के अस्थायी प्रतिरोध का मूल्यांकन करके बनाया गया था। CoCl2द्वारा प्रेरित हाइपोक्सिक वातावरण ने एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शन को बाधित कर दिया, जिसने सामान्य कोशिकाओं की तुलना में TEER को काफी कम कर दिया। इन विट्रो बीबीबी मॉडल बनाने के लिए मानक प्रक्रिया में वर्णित इस प्रयोग प्रोटोकॉल के अनुसार उच्च सफलता दर और दोहराव है। केवल बोने घनत्व को बदलने की जरूरत है अगर यह प्रयोग विभिन्न अच्छी तरह से प्लेट विनिर्देशों के साथ चलाया जाता है और प्लेटों के ऊपरी और निचले कक्षों में तरल स्तर फ्लश होते हैं। हालांकि, TEER मान कुछ हद तक इलेक्ट्रोड के गलत स्थान और सेल परत12 भर में विद्युत क्षेत्र की विषमता से प्रभावित हो जाएगा. ज्यादातर मामलों में, टीईईआर की पुष्टि विभिन्न बीबीबी मॉडल की अध्ययन आवश्यकताओं के आधार पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और पारगम्यता का पता लगाने के द्वारा एक साथ की जाएगी। हाइपोक्सिया द्वारा लाए गए बीबीबी क्षति को बनाए रखने वाली दवाओं को स्क्रीन करने के लिए भविष्य में इस सेल मॉडल में सुधार किया जाएगा। अंत में, TEER डिटेक्शन तकनीक के उपयोग से न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के लिए दवाओं और चिकित्सा रणनीतियों के निर्माण पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82274207 और 82104533), निंग्ज़िया के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2023BEG02012), और चेंगदू विश्वविद्यालय टीसीएम (XKTD2022013) के ज़िंगलिन स्कॉलर रिसर्च प्रमोशन प्रोजेक्ट से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)

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References

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बैरियर फंक्शनल इंटीग्रिटी रिकॉर्डिंग BEnd.3 वैस्कुलर एंडोथेलियल सेल ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस डिटेक्शन ब्लड-ब्रेन बैरियर माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल सेल एस्ट्रोसाइट्स पेरिसाइट्स इन विट्रो मॉडल न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर फार्माकोलॉजिकल ट्रीटमेंट मोनोलेयर बीबीबी सेल मॉडल अपर चैंबर 24-वेल प्लेट सेल बैरियर फंक्शन एपिथेलियल सेल वोल्टमीटर ट्रांसमेम्ब्रेन इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस CoCl2-प्रेरित हाइपोक्सिक सेल सेंट्रल नर्वस सिस्टम डिजीज
बैरियर फंक्शनल इंटीग्रिटी रिकॉर्डिंग bEnd.3 पर ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस डिटेक्शन <em>के माध्यम से</em> वैस्कुलर एंडोथेलियल सेल
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Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang,… More

Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).

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