Summary
Denne protokollen beskriver en pålitelig og effektiv in vitro-modell av hjernens blodbarriere. Metoden bruker mus, cerebrale vaskulære endotelceller bEnd.3 og måler transmembran elektrisk motstand.
Abstract
Blod-hjernebarrieren (BBB) er en dynamisk fysiologisk struktur sammensatt av mikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Ved å koordinere samspillet mellom begrenset transitt av skadelige stoffer, næringsopptak og metabolittclearance i hjernen, er BBB avgjørende for å bevare sentralnervesystemets homeostase. Å bygge in vitro-modeller av BBB er et verdifullt verktøy for å utforske patofysiologien til nevrologiske lidelser og skape farmakologiske behandlinger. Denne studien beskriver en prosedyre for å lage en in vitro monolayer BBB-cellemodell ved å så bEnd.3-celler inn i det øvre kammeret på en 24-brønnsplate. For å vurdere integriteten til cellebarrierefunksjonen ble det konvensjonelle epitelcellevoltmeteret brukt til å registrere den transmembrane elektriske motstanden til normale celler og CoCl 2-induserte hypoksiske celler i sanntid. Vi forventer at de ovennevnte forsøkene vil gi effektive ideer for opprettelse av in vitro-modeller av BBB og legemidler for å behandle lidelser i sykdommer i sentralnervesystemet.
Introduction
BBB er et unikt biologisk grensesnitt mellom blodsirkulasjon og nervevev, som består av vaskulære endotelceller, pericytter, astrocytter, nevroner og andre cellulære strukturer1. Strømmen av ioner, kjemikalier og celler mellom blodet og hjernen er strengt regulert av denne barrieren. Denne homeostasen beskytter nervevevet mot toksiner og patogener, samtidig som det muliggjør riktig drift av hjernens nerver 2,3. Opprettholde integriteten til BBB kan effektivt forhindre utvikling og progresjon av lidelser som påvirker sentralnervesystemet, som nevronal dysfunksjon, ødem og nevroinflammasjon4. Imidlertid forhindrer de unike fysiologiske egenskapene til BBB mer enn 98% av småmolekylære medisiner og 100% av makromolekylære legemidler fra å komme inn i sentralnervesystemet5. Derfor er økt penetrasjon av medisiner gjennom BBB under utvikling av medisiner for sentralnervesystemet avgjørende for å oppnå terapeutisk effekt 6,7. Selv om datasimuleringsscreening av substrater har økt sannsynligheten for at legemiddelkandidater krysser BBB, er det fortsatt behov for pålitelige og rimelige in vitro / in vivo BBB-modeller for å møte behovene til vitenskapelig forskning8.
En rask og rimelig teknikk for narkotikascreening med høy gjennomstrømning er in vitro-modell 9. For å belyse de grunnleggende prosessene for legemidlers effekter på BBB-funksjon og deres rolle i utvikling og progresjon av sykdom, er det laget en serie forenklede in vitro BBB-modeller. For tiden er de vanlige in vitro BBB-modellene monolags-, samkultur-, dynamiske og mikrofluidiske modeller 10,11,12, konstruert av vaskulære endotelceller og astrocytter, pericytter eller mikroglia 13,14. Selv om 3D-cellekulturer er mer i tråd med den fysiologiske strukturen til BBB15, er deres anvendelse som et middel til narkotikascreening for BBB fortsatt begrenset av deres intrikate design og subpar reproduserbarhet. I motsetning til dette er monolaget in vitro-modellen den som oftest brukes til å undersøke BBB og er anvendelig for å bestemme ekspresjonen av membrantransportører og stramme kryssproteiner i bestemte celler.
Transmembran elektrisk motstand (TEER) måling er en teknikk for å evaluere og overvåke laget av celler over motstanden og evaluere celleintegriteten og permeabiliteten til barrieren. Ved samtidig å sette inn to elektroder i vekstmediet eller bufferløsningen på hver side av monolaget, er det mulig å måle vekselstrøm eller elektrisk impedans gjennom cellens kompakte lag16,17. For å avgjøre om in vitro BBB-modellen er riktig opprettet, vil måling av TEER vanligvis bli brukt som gullstandard18. På den annen side kan trenden med medisineringsvirkning på BBB-permeabilitet nøyaktig forutsies ved å måle endringen i elektrisk motstand i cellelaget etter legemiddelinvolvering19. For eksempel oppdaget Feng et al. at catalpol (den primære aktive monomeren av rehmanniae) effektivt kunne reversere lipopolysakkaridindusert nedregulering av stramme kryssproteiner i BBB og øke TEER-verdien av mushjernens endotelcellelag20.
Den nevroinflammatoriske responsen er vanligvis hovedårsaken til BBB-homeostase ubalanse21. Hypoksisk behandling for å indusere nevroinflammatorisk skade er den viktigste metoden for å ødelegge blod-hjernebarrieren, hovedsakelig inkludert fysiske metoder og kjemiske reagensmetoder. Førstnevnte benytter primært en tregassinkubator for å variere oksygeninnholdet i cellevekstmiljøet for å simulere hypoksiske forhold22, mens sistnevnte oppnås ved kunstig innføring av deoksyreagenser som CoCl2 til cellekulturmediet23. Cellene vil forbli i deoksygenert tilstand hvis Fe2+ erstattes av Co2 + i heme. Hvis Fe2+ substitueres med Co2+ i katalytisk gruppe, vil prolinhydroksylase- og aspartathydroksylaseaktivitet hemmes, noe som resulterer i akkumulering av hypoksiinduserbar faktor-1α (HIF-1α)24. Under vedvarende hypoksi utløser defosforyleringen av HIF-1α i cytoplasma celledød og aktiverer vaskulær endotelial vekstfaktor, noe som til slutt øker vaskulær permeabilitet. I tidligere studier 25,26 har det blitt godt demonstrert at hypoksi kan redusere uttrykket av endoteliale tette kryssproteiner betydelig for å øke permeabiliteten til BBB. I denne studien ble tidsmotstandskurven til bEnd.3-celler sådd i 24-brønnsplater målt for å skape en enkel BBB-modell. Ved hjelp av denne modellen karakteriserte vi endringene i celle TEER etter CoCl2-intervensjon for å konstruere en cellemodell som kan brukes til å screene medisiner for BBB-beskyttelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Musens hjerneavledede endotelceller.3 (bEnd.3) ble inokulert inn i kamrene i en 24-brønns plate for å konstruere en enkel in vitro-modell av BBB under spesifikke mediumforhold. TEER for normale celler og hypoksiske celler ble målt med TEER-måler (figur 1 og figur 2).
1. Forberedelse av løsning
- Klargjør DMEM-cellekulturmediet som inneholder FBS (10 %, v/v), 100 U/ml penicillin og 10 mg/ml streptomycin (se materialfortegnelse).
- Forbered 100 mM CoCl2 stamløsning ved å tilsette 1,30 mg CoCl2 til 100 μL DMSO-løsning.
MERK: Alle ovennevnte oppløsninger ble oppbevart ved 4 °C, og stamoppløsningen ble fortynnet i henhold til ønsket konsentrasjon før bruk. - Klargjør 5 % natriumhypoklorittoppløsning (v/v) ved å tilsette 2 ml natriumhypoklorittoppløsning til 38 ml dobbeltdestillert vann.
2. Cellekultur og celle levedyktighet
- Frø 1 ml bEnd.3 celler i kulturskål (100 mm) som inneholder DMEM-medium med en tetthet på 1 x 106 celler / ml og kultur ved 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2. Bytt medium hver 2 til 3 dager og subkultur cellene 2x i uken.
- Etter bEnd.3 celler vokser til 80% samløp, fordøye cellene med 0,25% trypsin i 30 s.
- Lag en suspensjon av bEnd.3 celler ved tetthet på 7 x 104 celler / ml ved hjelp av DMEM medium gjennom en celleteller. Deretter frø 100 μL bEnd.3 cellesuspensjon i en 96-brønnsplate.
- Etter celleadhesjon, rengjør cellene med PBS og kultur cellene med 100 μL kulturmedium eller legemiddelholdig medium (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) i 24 timer under de samme forholdene. Etter å ha fjernet mediet inne i brønnplaten og rengjort det med PBS, tilsett 100 μL CCK-8-løsning.
MERK: Ikke generer bobler i brønnen, noe som vil påvirke verdiene for optisk tetthet (OD). - Sett plater med 96 brønner ved 37 °C og rug i 1 time. Mål absorbansen til 96-brønnsplatene ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
MERK: For å unngå forskjeller i gruppen ble brønnplatene avkjølt til romtemperatur før deteksjon. - Beregn cellens levedyktighet indusert av forskjellige konsentrasjoner av CoCl2 i henhold til formelen [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Velg CoCl2-konsentrasjonen med en signifikant forskjell i cellelevedyktighetsreduksjon sammenlignet med kontrollgruppen for neste eksperiment.
3. Modell montering
- Skyll det øvre kammeret på 24-brønnplatene med PBS.
MERK: Celler vokste og smeltet sammen på bunnen av det øvre kammeret på 24-brønnsplaten, og tette kryss mellom celler ble gradvis dannet for å spille en barriererolle. Hvis endotelcellene som brukes i noen studier ikke er i stand til å danne en komplett barriere på PET-membraner uavhengig, er det nødvendig å belegge membranene med kollagen IV-løsning før celleinokulering. - Bland bEnd.3-cellene med DMEM-medium for å lage en suspensjon med en tetthet på 5 x 105 celler / ml ved hjelp av en virvelblander. Deretter frø 200 μL bEnd.3 cellesuspensjon på PET-membranen i det øvre kammeret av en 24-brønnplate (0,33 cm2, 0,4 μm membranporestørrelse).
MERK: Pilotstudien av denne protokollen fant ingen forskjell i resultatene ved bruk av 5 til 10 passasjer av bEnd.3-celler for eksperimenter. For å sikre sannsynligheten for vellykket modellering, vennligst se cellenummerintervallet for denne protokollen. - Tilsett 1200 μL komplett medium til platens nedre kammer for å sikre at det osmotiske trykket i de øvre og nedre kamrene har en tendens til å stabilisere seg. Det er forskjeller i volumet av medium tilsatt avhengig av typen; Sørg for at væskenivået i de øvre og nedre kamrene er flush.
- Bytt medium for det øvre kammeret og det nedre kammeret på et fast tidspunkt hver dag og overvåk motstandsverdien samtidig.
- Når du endrer mediet, vil integriteten til cellelaget bli skadet ved kunstig berøring eller overdreven bevegelse. For å unngå situasjonen ovenfor, fjern sakte det gamle mediet fra den ene siden med en pipette med undertrykk og tilsett sakte et nytt medium langs veggen under væskeutveksling.
4. Måling av TEER
- Før arbeidet begynner, plasser motstanden, 5% natriumhypoklorittløsning, 75% etanol og dobbeltdestillert vannoppløsning i et ultrarent bord. Slå på UV-bestrålingen i 30 minutter for å eliminere gjenværende bakterier og patogener.
- Plasser elektrodene i 5% natriumhypoklorittoppløsning med langsom risting i 3 s til 5 s, og senk deretter ned i 75% etanol i 15 minutter. Til slutt, overfør til PBS eller dobbel destillert vannoppløsning til bruk.
- Slå PÅ bryteren på baksiden av cellemotstandsmåleren, klikk Velg plate i henhold til parametrene i tabell 1, og velg 24-brønnplate.
- I henhold til operasjonsbehovene velger du riktig deteksjonssekvens. Vi valgte A1-prosedyre i denne studien.
- Sett inn en kΩ-motstand i høyre plugg for å kalibrere instrumentet. Hvis kalibreringsresultatet er 1000 ± 5 Ω, må du vurdere nøyaktigheten til instrumentet som normalt.
- Hvis kalibreringsresultatet ikke er 1000 Ω, klikker du på Mode Units på hovedgrensesnittet for å velge OHMS, og deretter klikker du Calibrate på hovedskjermen for å kalibrere instrumentet på nytt.
- Trekk ut kΩ-motstanden på høyre side og bytt måleelektroden med en tilkoblingsledning.
- Plasser elektroden i 24-brønnsplaten uten såceller vertikalt og klikk Blank Handling på hovedskjermen på instrumentet. Bakgrunnsverdien av platemotstanden uten frøede celler er ca. 134, 4 Ω.
- Sett de to elektrodene inn i de øvre og nedre kamrene på frøplaten med celler slik at cellelaget er mellom dem, og registrer deretter motstandsverdien ved å tråkke forsiktig på pedalen.
- Forsikre deg om at elektroden ikke berører cellene i det øvre kammeret og bunnen av det nedre kammeret. Bløtleggingstiden til elektroden i løsningen har ingen effekt på motstandsverdien, og det er bare nødvendig å sørge for at elektroden er i riktig posisjon.
- Oppnå TEER-verdier (Ωcm2) ved å multiplisere elektriske motstandsverdier (ohm) med bunnområdet (cm2) i det øvre kammeret, som i ligningen:
TEER (Ωcm2) = Motstand (Ω) x Sinnsats (cm2) - Tegn et linjeplott av TEER-Time (i dager). Når motstandsverdien ikke øker ytterligere med tiden (målt over dager), bør du vurdere at cellen dannet en barriere.
NOTW: Den monolags BBB-modellen av bEnd.3-celler vil bli vellykket konstruert ved å dyrke bEND.3-celler med parametrene i denne studien i ca. 6 dager. TEER for bEnd.3-cellemonolagsmodellen varierte fra 16,49 ± 2,12 Ωcm2 til 27,59 ± 1,50 Ωcm2 innen 6 dager (n = 8, gjennomsnittlig ± SD).
5. Barriereødeleggelse og statistisk analyse
- I henhold til TEER-tidskurven velger du brønnene med barrierefunksjon og deler dem inn i kontrollgruppen og CoCl2-gruppen (n = 4).
- Legg til dyrkningsmedium og kulturmedium inneholdende 300 μMCoCl2 (200 μL) i henholdsvis kontrollgruppen og CoCl2-gruppens øvre kammer.
- Pådag resistensverdiene til kontroll- og CoCl2-gruppene ved 12 timer og 24 timer inkubasjon ved 37 °C ved hjelp av prosedyren beskrevet i trinn 4.
- Bruk kommersiell programvare for å kartlegge trenden for TEER-verdier av barrieren til celler dyrket med eller uten 300 μM CoCl2.
- Bruk statistisk analyseprogramvare for å analysere forskjellen i resistensverdier mellom CoCl2-behandlede celler og normale celler (n = 4, * p < 0, 0, ** p < 0, 0, *** p < 0, 001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tillot registrering av endringer i motstandsverdiene til celler i henhold til parametrene angitt i transendotelial motstandsmåleren. Levedyktigheten til bEnd.3-celler (antall levende celler) behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CoCl2 ble screenet ved CCK-8-analyse. Større celleskader produsert av CoCl2 ble representert ved lavere celle levedyktighet. Vi fant at 300 μMCoCl2 var signifikant cytotoksisk in vitro, og denne konsentrasjonen ble brukt til de neste forsøkene (figur 3A). Ved å overvåke vekstmotstandsendringene i bEnd.3 fant vi at celle TEER-verdiene begynte å stabilisere seg på den 5. dagen. Hypoksisk skade indusert ved tilsetning av 300 μM CoCl2 til platens øvre kammer på den 6. dagen resulterte i en signifikant reduksjon i TEER-verdier sammenlignet med kontrollen ved både 12 timer og 24 timer (figur 3B). Funksjonen til cellebarrieren kan indirekte vurderes av TEER-verdien, og en nedgang i TEER-verdien indikerer nedbrytningen av cellebarrieren. TEER-verdien på 300 μM CoCl2-gruppen falt sammenlignet med kontrollgruppen etter inkubasjon i 24 timer (figur 3C). Den nevnte forskningen viste at skade på BBB in vitro-modellen kan skyldes et hypoksisk miljø forårsaket av CoCl2.
Figur 1: Instrumenter og tilbehør for måling av TEER. (AB) Drift hovedgrensesnitt for TEER-måleren. (VG Nett) En plate med 24 brønner. (E) Løsningen som kreves for rengjøring og desinfeksjon av elektroden. (F) Standard motstand kreves for kalibrering av TEER-måleren. (VG Nett) Elektroden og lokal forstørrelse. (I) Fotpedal ble brukt til å samle inn data. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flytdiagrammer over transmembranmotstanden til bEnd.3-celler registrert ved hjelp av en transendotelial motstandsmåler. (A) Cellekultur. (B) bEnd.3-cellene ble sådd i platenes øvre kammer, og en tett cellebarriere ble dannet ved å fylle brønnplatene med medium for å støtte deres vekst og differensiering. (C) Cellens barrierefunksjonelle integritet ble vurdert ved å overvåke TEER. (D) CoCl2 ble brukt til å etterligne det hypoksiske miljøet for å indusere nedsatt cellebarrierefunksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Salidroside opprettholder integriteten til barrierefunksjonen til bEnd.3-celler ved å lindre CoCl 2-indusert hypoksisk skade. (A) Effekt av CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) på levedyktigheten til bEnd.3-celler (n = 6, CoCl2-gruppe vs kontrollgruppe ***p <0,001, gjennomsnittlig ± SD). (B) Plott av endringer i TEER-verdier av bEnd.3-celler behandlet med normalt medium eller 300 μM CoCl2(n=4, dag 1 vs dag 2-6: ##p<0.01, ###p<0.001, dag 6 vs dag 6.5 - 7: **p<0.01, gjennomsnitt ± SD). (C) TEER-endringer av celler etter 24 timer hypoksisk skade (n = 4, CoCl2 gruppe vs kontrollgruppe ***p < 0,001, gjennomsnitt ± SD). Enveis ANOVA og Tukeys test ble utført, og s<0,05 ble vurdert som signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parametere | Opsjon |
| Velg plate | 24-brønn |
| Deteksjon bestilling | A1 |
| Modus enheter | Ω |
| Standard motstand | 1 kΩ |
Tabell 1: Angi parametere for TEER-måleren. Parameterinnstillingene og programvalget til instrumentet kreves for påvisning av celleresistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et av de mest utviklede kroppsorganene, hjernen styrer et bredt spekter av intrikate fysiologiske prosesser, inkludert minne, kognisjon, hørsel, lukt og bevegelse27. Hjernen er et av menneskekroppens mest kompliserte og syke organer på samme tid. Forekomsten av mange sykdommer i sentralnervesystemet viser en økende tendens år over år på grunn av faktorer som luftforurensning, uregelmessige spisemønstre og andre faktorer 27,28,29. Det er interessant at begynnelsen og utviklingen av noen sykdommer i sentralnervesystemet, som hjerneslag, epilepsi og Alzheimers sykdom (AD), er nært korrelert med veksten av BBB 30,31,32. Det grunnleggende konseptet for behandling av de fleste lidelser med hjernedysfunksjon kan være opprettelsen av nye terapier eller medisiner for å opprettholde BBB-funksjonell homeostase. Dessverre kan de fleste medisiner ikke komme inn i hjerneparenkymet for å utføre sine vitale funksjoner på grunn av BBBs hydrofobisitet og dens unike løsemiddeltransportmetode 14,33. For å øke sannsynligheten for at en medisin vil lykkes, er det en god strategi å lage nye BBB-modeller som kan brukes til molekylær screening med høy gjennomstrømning.
På grunn av den intrikate strukturen til den nevrovaskulære enheten har in vivo-modellen teoretisk en høyere grad av modellering av BBB-strukturen. På grunn av begrensningen av homologi mellom dyr og mennesker, kan imidlertid avvikene i BBB-transportører føre til at medisinscreening ikke har det forventede resultatet34. Tvert imot tilbyr in vitro-modeller fordelene ved å være billig, ha en rask deteksjonssyklus og kunne brukes til screening med høy gjennomstrømning, noe som bedre kan tjene målene for nevrologisk sykdomsforskning. Med utviklingen av vitenskap og teknologi blir flere og flere in vitro-modeller som ligner den fysiologiske strukturen til BBB opprettet og forbedret. I tillegg til skillet mellom simuleringsteknikker for statiske og dynamiske plattformer, er det betydelige forskjeller i celletyper og tall som brukes35. Såing endotelceller i bunnen av det øvre kammeret er den enkleste BBB-cellemodellen og en utmerket tilnærming for transportkinetikk og cellesignalvei36. Kokulturmodeller legger til interaksjoner med pericytter eller gliaceller på grunnlag av monolagsceller, men disse modellene er ofte begrenset av manglende evne til å oppnå nøyaktig celleposisjonering og rettet kontroll12. Den dynamiske modellen med 2D- og 3D-struktur er for tiden den mest nøyaktige representasjonen av det dynamiske mikromiljøet til BBB in vitro; Det er imidlertid viktig å merke seg at utviklingen av denne modellen innebærer omfattende tidligere design- og valideringsarbeid. Å velge riktig BBB-modell i samsvar med de reelle behovene til forskningen kan oppnå mer nøyaktige eksperimentelle resultater.
Evalueringsmetodene for den funksjonelle integriteten til BBB in vitro-modellen inkluderer vanligvis en permeabilitetstest og transmembran motstandsverditest. Den førstnevnte oppnås hovedsakelig ved å vurdere permeabiliteten til fluoresceinmerkede makromolekylære stoffer. Metoden er enkel og presis, men strukturen i cellelaget endres etter at det fluorescerende stoffet passerer gjennom, noe som resulterer i lav prøveutnyttelse37. Denne mangelen kompenseres effektivt av utviklingen av TEER-deteksjonsmetoden. De to elektrodene ble plassert på begge sider av cellelaget, og integriteten til barrierefunksjonen ble vurdert ved å måle ionestrømmotstanden over cellebarrieren38. Den totale motstanden ble trukket fra miljømotstanden, slik som kulturmembranmotstand og middels motstand, og multiplisert med arealet av kulturmembranen for å oppnå den endelige BBB-motstanden (TEER, Ωcm2) 39. En høyere verdi av TEER-verdier representerer en høyere grad av tette kryss mellom celler. TEER-måling av operasjonen er enkel og ikke-invasiv, cellebarrierefunksjon når motstand er dannet, vil være i et stabilt område. Denne funksjonen gjør det mulig for operatøren å opprettholde lignende TEER-verdier selv ved bruk av forskjellige instrumenter under standard driftsforhold. Bare temperaturen og plasseringen av elektrodeinnsettingen krever ekstra oppmerksomhet fra operatøren. Økningen av temperatur og elektroden som berører bunnen vil redusere cellemotstanden.
I denne studien ble en enkel BBB-monolagscellemodell in vitro vellykket konstruert ved å evaluere den tidsmessige motstanden til bEnd.3-celler i platens øvre kammer. Det hypoksiske miljøet indusert av CoCl2forstyrret det stramme krysset mellom endotelceller, noe som signifikant reduserte TEER i forhold til normale celler. I følge dette eksperimentet har protokollen beskrevet i standardprosessen for å lage en in vitro BBB-modell en høy suksessrate og repeterbarhet. Bare såtettheten må endres hvis dette eksperimentet kjøres med forskjellige brønnplatespesifikasjoner og væskenivåene i platenes øvre og nedre kamre er flush. Imidlertid vil TEER-verdien bli noe påvirket av elektrodens feil plassering og det elektriske feltets heterogenitet gjennom cellelaget12. I de fleste tilfeller vil TEER bli bekreftet samtidig ved immunfluorescens og permeabilitetsdeteksjon, avhengig av studiekravene til ulike BBB-modeller. Denne cellemodellen vil bli forbedret i fremtiden for å skjerme ut medisiner som kan opprettholde BBB-skaden forårsaket av hypoksi. Avslutningsvis vil bruken av TEER-deteksjonsteknologi sannsynligvis ha en betydelig innvirkning på etableringen av medisiner og terapistrategier for nevrologiske sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi setter pris på den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (82274207 og 82104533), Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) og Xinglin Scholar Research Promotion Project fra Chengdu University of TCM (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A.
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M.
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al.
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
