Summary
Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.
Abstract
La barrera hematoencefálica (BHE) es una estructura fisiológica dinámica compuesta por células endoteliales microvasculares, astrocitos y pericitos. Al coordinar la interacción entre el tránsito restringido de sustancias nocivas, la absorción de nutrientes y la eliminación de metabolitos en el cerebro, la BHE es esencial para preservar la homeostasis del sistema nervioso central. La construcción de modelos in vitro de la BHE es una herramienta valiosa para explorar la fisiopatología de los trastornos neurológicos y crear tratamientos farmacológicos. Este estudio describe un procedimiento para crear un modelo de células BBB monocapa in vitro mediante la siembra de células bEnd.3 en la cámara superior de una placa de 24 pocillos. Para evaluar la integridad de la función de barrera celular, se utilizó el voltímetro de celda epitelial convencional para registrar la resistencia eléctrica transmembrana de las células normales y las células hipóxicas inducidas por CoCl2 en tiempo real. Anticipamos que los experimentos anteriores proporcionarán ideas efectivas para la creación de modelos in vitro de BHE y medicamentos para tratar trastornos de enfermedades del sistema nervioso central.
Introduction
La BHE es una interfaz biológica única entre la circulación sanguínea y el tejido nervioso, que está compuesta por células endoteliales vasculares, pericitos, astrocitos, neuronas yotras estructuras celulares. El flujo de iones, sustancias químicas y células entre la sangre y el cerebro está estrictamente regulado por esta barrera. Esta homeostasis protege los tejidos nerviosos contra toxinas y patógenos, al tiempo que permite el funcionamiento adecuado de los nervios del cerebro 2,3. Mantener la integridad de la BHE puede prevenir eficazmente el desarrollo y la progresión de trastornos que afectan al sistema nervioso central, como la disfunción neuronal, el edema y la neuroinflamación. Sin embargo, las propiedades fisiológicas únicas de la BHE impiden que más del 98% de los medicamentos de moléculas pequeñas y el 100% de los productos farmacéuticos macromoleculares entren enel sistema nervioso central. Por lo tanto, el aumento de la penetración de los medicamentos a través de la BHE durante el desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central es esencial para alcanzar la eficacia terapéutica 6,7. A pesar de que el cribado por simulación informática de sustratos ha aumentado significativamente la probabilidad de que los candidatos a fármacos crucen la barrera hematoencefálica, todavía se necesitan modelos fiables y asequibles in vitro/in vivo de la BHE para satisfacer las necesidades de la investigación científica8.
Una técnica rápida y asequible para el cribado de fármacos de alto rendimiento es el modelo in vitro 9. Para arrojar luz sobre los procesos fundamentales de los efectos de los medicamentos sobre la función de la BHE y su papel en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, se han creado una serie de modelos simplificados de BHE in vitro. En la actualidad, los modelos más comunes de BHE in vitro son los modelos monocapa, cocultivo, dinámico y microfluídico 10,11,12, construidos por células endoteliales vasculares y astrocitos, pericitos o microglía 13,14. Aunque los cultivos celulares 3D están más en línea con la estructura fisiológica de la barrera hematoencefálica15, su aplicación como medio de detección de fármacos para la barrera hematoencefálica sigue estando limitada por su intrincado diseño y su deficiente reproducibilidad. Por el contrario, el modelo monocapa in vitro es el más utilizado para investigar la BHE y es aplicable para determinar la expresión de transportadores de membrana y proteínas de unión estrecha en células particulares.
La medición de la resistencia eléctrica transmembrana (TEER) es una técnica para evaluar y monitorear la capa de células a través de la resistencia y evaluar la integridad celular y la permeabilidad de la barrera. Al insertar simultáneamente dos electrodos en el medio de crecimiento o en la solución tampón a cada lado de la monocapa, es posible medir la corriente alterna o la impedancia eléctrica a través de la capa compacta de la célula16,17. Con el fin de determinar si el modelo de BHE in vitro se ha creado correctamente, la medición de TEER se empleará generalmente como el estándar de oro18. Por otro lado, la tendencia de la acción de la medicación sobre la permeabilidad de la BHE puede predecirse con precisión midiendo el cambio en la resistencia eléctrica de la capa celular después de la afectación del fármaco19. Por ejemplo, Feng et al. descubrieron que el catalpol (el monómero activo primario de rehmanniae) podría revertir eficazmente la regulación a la baja inducida por lipopolisacáridos de las proteínas de unión estrecha en la BHE y aumentar el valor TEER de la capa20 de células endoteliales del cerebro de ratón.
La respuesta neuroinflamatoria suele ser la principal causa del desequilibrio de la homeostasis de la BHE21. El tratamiento hipóxico para inducir lesiones neuroinflamatorias es el principal método para destruir la barrera hematoencefálica, incluyendo principalmente métodos físicos y métodos de reactivos químicos. El primero utiliza principalmente una incubadora de tres gases para variar el contenido de oxígeno en el entorno de crecimiento celular para simular condiciones hipóxicas22, mientras que el segundo se logra mediante la introducción artificial de reactivos desoxi como el CoCl2 en el medio de cultivo celular23. Las células permanecerán en una condición desoxigenada si el Fe2+ se sustituye por Co2+ en el hemo. Si el Fe2+ es sustituido por el Co2+ en el grupo catalítico, la actividad de la prolina hidroxilasa y la aspartato hidroxilasa se inhibirá, lo que resultará en una acumulación del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α)24. Bajo hipoxia persistente, la desfosforilación de HIF-1α en el citoplasma desencadena la muerte celular y activa el factor de crecimiento endotelial vascular, lo que en última instancia aumenta la permeabilidad vascular. En estudios previos25,26, se ha demostrado que la hipoxia puede reducir significativamente la expresión de proteínas de unión estrecha endotelial para aumentar la permeabilidad de la BHE. En este estudio, se midió la curva de resistencia temporal de las células bEnd.3 sembradas en placas de 24 pocillos para crear un modelo BBB sencillo. Utilizando este modelo, caracterizamos los cambios en el TEER celular después de la intervención con CoCl2 con el fin de construir un modelo celular que pueda utilizarse para detectar fármacos para la protección de la BHE.
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Protocol
NOTA: Se inocularon células endoteliales derivadas del cerebro de ratón.3 (bEnd.3) en las cámaras de una placa de 24 pocillos para construir un modelo in vitro simple de BHE en condiciones específicas del medio. Los TEER de células normales e hipóxicas se midieron con medidor TEER (Figura 1 y Figura 2).
1. Preparación de la solución
- Prepare el medio de cultivo celular DMEM que contenga FBS (10%, v/v), 100 U/mL de penicilina y 10 mg/mL de estreptomicina (ver Tabla de Materiales).
- Prepare 100 mM de solución madre de CoCl2 añadiendo 1,30 mg de CoCl2 a 100 μL de solución de DMSO.
NOTA: Todas las soluciones anteriores se almacenaron a 4 °C y la solución madre se diluyó de acuerdo con la concentración deseada antes de su uso. - Prepare una solución de hipoclorito de sodio al 5% (v/v) agregando 2 ml de solución de hipoclorito de sodio a 38 ml de agua bidestilada.
2. Cultivo celular y viabilidad celular
- Siembre 1 mL de células bEnd.3 en placa de cultivo (100 mm) que contenga medio DMEM a una densidad de 1 x 106 células/mL y cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO2. Cambie el medio cada 2 o 3 días y subcultive las células 2 veces por semana.
- Después de que las células bEnd.3 crezcan hasta una confluencia del 80 %, digiera las células con tripsina al 0,25 % durante 30 s.
- Realice una suspensión de células bEnd.3 a una densidad de 7 x 104 células/ml utilizando medio DMEM a través de un contador de células. A continuación, siembre 100 μL de suspensión celular bEnd.3 en una placa de 96 pocillos.
- Después de la adhesión celular, limpie las células con PBS y cultive las células con 100 μL de medio de cultivo o medio que contenga fármaco (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) durante 24 h en las mismas condiciones. Después de retirar el medio dentro de la placa de pocillos y limpiarlo con PBS, agregue 100 μL de solución CCK-8.
NOTA: No genere burbujas en el pocillo, que afectarán los valores de densidad óptica (DO). - Coloque placas de 96 pocillos a un ambiente de 37 °C e incube durante 1 h. Mida la absorbancia de las placas de 96 pocillos a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
NOTA: Para evitar diferencias dentro del grupo, las placas de pocillos se enfriaron a temperatura ambiente antes de la detección. - Calcular la viabilidad celular inducida por diferentes concentraciones de CoCl2 según la fórmula [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Seleccione la concentración de CoCl2 con una diferencia significativa en la reducción de la viabilidad celular en comparación con el grupo de control para el siguiente experimento.
3. Montaje del modelo
- Enjuague la cámara superior de las placas de 24 pocillos con PBS.
NOTA: Las células crecieron y se fusionaron en la parte inferior de la cámara superior de la placa de 24 pocillos, y las uniones estrechas entre las células se formaron gradualmente para desempeñar un papel de barrera. Si las células endoteliales utilizadas en algunos estudios no son capaces de formar una barrera completa en las membranas de PET de forma independiente, es necesario recubrir las membranas con una solución de colágeno IV antes de la inoculación celular. - Mezcle las celdas bEnd.3 con medio DMEM para hacer una suspensión a una densidad de 5 x 105 celdas/mL usando un mezclador de vórtice. A continuación, siembre 200 μL de suspensión celular bEnd.3 en la membrana PET en la cámara superior de una placa de 24 pocillos (0,33 cm2, tamaño de poro de la membrana de 0,4 μm).
NOTA: El estudio piloto de este protocolo no encontró diferencias en los resultados cuando se utilizaron de 5 a 10 pasajes de células bEnd.3 para experimentos. Para garantizar la probabilidad de un modelado exitoso, consulte el intervalo de número de celda de este protocolo. - Agregue 1200 μL de medio completo a la cámara inferior de la placa para asegurarse de que la presión osmótica de las cámaras superior e inferior tienda a estabilizarse. Existen diferencias en el volumen de medio añadido según el tipo; Asegúrese de que el nivel de líquido de las cámaras superior e inferior esté al ras del suelo.
- Cambie el medio de la cámara superior y la cámara inferior a una hora fija todos los días y controle el valor de resistencia al mismo tiempo.
- Al cambiar el medio, la integridad de la capa celular se dañará por el tacto artificial o el movimiento excesivo. Para evitar la situación anterior, retire lentamente el medio viejo de un lado con una pipeta de presión negativa y agregue lentamente un medio nuevo a lo largo de la pared durante el intercambio de fluidos.
4. Medición de TEER
- Antes de comenzar el trabajo, coloque la resistencia, la solución de hipoclorito de sodio al 5%, el etanol al 75% y la solución de agua destilada doble en una mesa ultralimpia. Encienda la irradiación UV durante 30 minutos para eliminar las bacterias y patógenos residuales.
- Coloque los electrodos en una solución de hipoclorito de sodio al 5% con agitación lenta durante 3 s a 5 s, y luego sumérjalos en etanol al 75% durante 15 min. Finalmente, transfiera a PBS o solución de agua doblemente destilada hasta su uso.
- Encienda el interruptor en la parte posterior del medidor de resistencia de celda, haga clic en Seleccionar placa de acuerdo con los parámetros de la Tabla 1 y seleccione Placa de 24 pocillos.
- De acuerdo con las necesidades de operación, seleccione la secuencia de detección adecuada. En este estudio se seleccionó el procedimiento A1 .
- Inserte una resistencia kΩ en el enchufe derecho para calibrar el instrumento. Si el resultado de la calibración es de 1000 ± 5 Ω, considere que la precisión del instrumento es normal.
- Si el resultado de la calibración no es de 1000 Ω, haga clic en Unidades de modo en la interfaz principal para seleccionar OHMS y, a continuación, haga clic en Calibrar en la pantalla principal para volver a calibrar el instrumento.
- Extraiga la resistencia kΩ del lado derecho y sustituya el electrodo de medición por un cable de conexión.
- Coloque el electrodo en la placa de 24 pocillos sin sembrar celdas verticalmente y haga clic en Manipulación de piezas en bruto en la pantalla principal del instrumento. El valor de fondo de la resistencia de la placa sin células sembradas es de aproximadamente 134,4 Ω.
- Inserte los dos electrodos en las cámaras superior e inferior de la placa sembrada con celdas de modo que la capa de celdas quede entre ellas, y luego registre el valor de resistencia pisando suavemente el pedal.
- Asegúrese de que el electrodo no toque las celdas de la cámara superior y la parte inferior de la cámara inferior. El tiempo de remojo del electrodo en la solución no tiene ningún efecto sobre el valor de resistencia, y solo es necesario asegurarse de que el electrodo esté en la posición correcta.
- Obtener los valores de TEER (Ωcm2) multiplicando los valores de resistencia eléctrica (ohmios) por el área inferior (cm2) de la cámara superior, como en la ecuación:
TEER (Ωcm2) = Resistencia (Ω) xinserto S (cm2) - Dibuje un gráfico de líneas de TEER-Time (en días). Cuando el valor de resistencia no aumenta más con el tiempo (medido a lo largo de días), considere que la celda formó una barrera.
NOTW: El modelo monocapa BBB de células bEnd.3 se construirá con éxito mediante el cultivo de células bEND.3 con los parámetros de este estudio durante unos 6 días. El TEER del modelo monocapa de células bEnd.3 osciló entre 16,49 ± 2,12Ωcm2 y 27,59 ± 1,50Ωcm2 en 6 días (n=8, media ± DE).
5. Destrucción de barreras y análisis estadístico
- De acuerdo con la curva TEER - tiempo, seleccione los pozos con función barrera y divídalos en el grupo control y el grupo CoCl2 (n = 4).
- Añadir el medio de cultivo y el medio de cultivo que contienen 300 μM de CoCl2 (200 μL) en la cámara superior del grupo control y del grupo CoCl2 , respectivamente.
- Detectar los valores de resistencia de los grupos control y CoCl2 a las 12 h y a las 24 h de incubación a 37 °C mediante el procedimiento descrito en el paso 4.
- Utilice software comercial para mapear la tendencia de los valores de TEER de la barrera de células cultivadas con o sin 300 μM de CoCl2.
- Utilice un software de análisis estadístico para analizar la diferencia en los valores de resistencia entre las células tratadas con CoCl2 y las células normales (n = 4, * p< 0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).
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Representative Results
Este protocolo permitió el registro de cambios en los valores de resistencia de las celdas de acuerdo con los parámetros establecidos en el medidor de resistencia transendotelial. La viabilidad de las células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas con diferentes concentraciones de CoCl2 se examinó mediante el ensayo CCK-8. El mayor daño celular producido por el CoCl2 estuvo representado por una menor viabilidad celular. Encontramos que 300 μM de CoCl2 eran significativamente citotóxicos in vitro, y esta concentración se utilizó para los siguientes experimentos (Figura 3A). Al monitorear los cambios en la resistencia al crecimiento en bEnd.3, encontramos que los valores de TEER celular comenzaron a estabilizarse en el5º día. La lesión hipóxica inducida por la adición de 300 μM de CoCl2 a la cámara superior de la placa en el6º día dio lugar a una disminución significativa de los valores de TEER en comparación con el control en los puntos de tiempo de 12 h y 24 h (Figura 3B). La función de la barrera celular se puede evaluar indirectamente por el valor TEER, y una disminución en el valor TEER indica la ruptura de la barrera celular. El valor de TEER del grupo de 300 μM de CoCl2 disminuyó en comparación con el grupo control después de la incubación durante 24 h. (Figura 3C). La investigación antes mencionada demostró que el daño al modelo in vitro de BHE puede ser causado por un ambiente hipóxico causado por el CoCl2.
Figura 1: Instrumentos y accesorios para la medición de TEER. (A-B) Interfaz principal de operación del medidor TEER. (C-D) Una placa de 24 pocillos. (E) La solución requerida para la limpieza y desinfección de electrodos. (F) Se requiere resistencia estándar para la calibración del medidor TEER. (G-H) El electrodo y el aumento local. (I) Se utilizó un pedal para recopilar datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagramas de flujo de la resistencia transmembrana de las células bEnd.3 registradas con un medidor de resistencia transendotelial. (A) Cultivo celular. (B) Las células bEnd.3 se sembraron en la cámara superior de las placas, y se formó una densa barrera celular llenando las placas de pocillos con medio para apoyar su crecimiento y diferenciación. (C) La integridad funcional de barrera de las células se evaluó mediante el monitoreo de TEER. (D) El CoCl2 se utilizó para imitar el entorno hipóxico para inducir una función de barrera celular deteriorada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Salidroside mantiene la integridad de la función de barrera de las células bEnd.3 al aliviar la lesión hipóxica inducida por CoCl2. (A) Efecto de CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) sobre la viabilidad de las células bEnd.3 (n = 6, grupo CoCl2 vs grupo control ***p<0,001, media ± DE). (B) Gráfico de los cambios en los valores de TEER de las células bEnd.3 tratadas con medio normal o 300 μM CoCl2 (n = 4, Día 1 vs Día 2-6: # #p<0.01, # #p< 0.001, Día 6 vs Día 6.5 - 7: **p<0.01, media ± DE). (C) Cambios en las células TEER después de 24 h de lesión hipóxica (n = 4, grupo CoCl2 vs grupo control ***p<0,001, media ± DE). Se realizó ANOVA de una vía y prueba de Tukey, y se consideró significativa la p<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetros | Opción |
| Seleccionar placa | 24 pocillos |
| Orden de detección | A1 |
| Unidades de modo | Ω |
| Resistencia estándar | 1 kΩ |
Tabla 1: Establecer los parámetros del medidor TEER. La configuración de los parámetros y la selección del programa del instrumento son necesarios para la detección de la resistencia de la célula.
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Discussion
El cerebro, uno de los órganos corporales más desarrollados, controla una amplia gama de intrincados procesos fisiológicos, como la memoria, la cognición, la audición, el olfato yel movimiento. El cerebro es uno de los órganos más complicados y enfermos del cuerpo humano al mismo tiempo. La aparición de muchos trastornos del sistema nervioso central muestra una tendencia creciente año tras año debido a factores como la contaminación del aire, los patrones de alimentación irregulares y otros factores 27,28,29. Es interesante que el inicio y la progresión de algunas enfermedades del sistema nervioso central, como el accidente cerebrovascular, la epilepsia y la enfermedad de Alzheimer (EA), estén estrechamente correlacionados con el crecimiento de la BHE 30,31,32. El concepto básico para el tratamiento de la mayoría de los trastornos con disfunción cerebral puede ser la creación de nuevas terapias o medicamentos para mantener la homeostasis funcional de la BHE. Desafortunadamente, la mayoría de los medicamentos no pueden entrar en el parénquima cerebral para realizar sus funciones vitales debido a la hidrofobicidad de la BHE y su método único de transporte de solutos14,33. Para aumentar la probabilidad de que un medicamento tenga éxito, es una buena estrategia crear nuevos modelos de BHE que puedan utilizarse para el cribado molecular de alto rendimiento.
Debido a la intrincada estructura de la unidad neurovascular, el modelo in vivo teóricamente tiene un mayor grado de modelado de la estructura de la BHE. Sin embargo, debido a la restricción de la homología entre animales y humanos, las variaciones en los transportadores de BHE pueden llevar a que el cribado de la medicación no tenga el resultado esperado34. Por el contrario, los modelos in vitro ofrecen las ventajas de ser baratos, tener un ciclo de detección rápido y poder utilizarse para el cribado de alto rendimiento, lo que puede servir mejor a los objetivos de la investigación de enfermedades neurológicas. Con el desarrollo de la ciencia y la tecnología, se están creando y mejorando cada vez más modelos in vitro que se asemejan mucho a la estructura fisiológica de la BHE. Además de la distinción entre las técnicas de simulación para plataformas estáticas y dinámicas, existen diferencias significativas en los tipos de células y en el número utilizado35. La siembra de células endoteliales en el fondo de la cámara superior es el modelo de células BBB más simple y un excelente enfoque para la cinética de transporte y la vía de señalización celular36. Los modelos de cocultivo añaden interacciones con pericitos o células gliales sobre la base de las células monocapa, pero estos modelos se ven frecuentemente limitados por la incapacidad de obtener un posicionamiento celular preciso y un control dirigido12. El modelo dinámico con estructura 2D y 3D es actualmente la representación más precisa del microambiente dinámico de la BHE in vitro; Sin embargo, es importante tener en cuenta que el desarrollo de este modelo implica un amplio esfuerzo previo de diseño y validación. Seleccionando el modelo BBB adecuado de acuerdo con las necesidades reales de la investigación se pueden obtener resultados experimentales más precisos.
Los métodos de evaluación de la integridad funcional del modelo in vitro de BHE suelen incluir una prueba de permeabilidad y una prueba de valor de resistencia transmembrana. El primero se logra principalmente mediante la evaluación de la permeabilidad de las sustancias macromoleculares marcadas con fluoresceína. El método es sencillo y preciso, pero la estructura de la capa celular cambia después del paso de la sustancia fluorescente, lo que resulta en una baja utilización de la muestra37. Esta deficiencia se compensa eficazmente con el desarrollo del método de detección TEER. Los dos electrodos se colocaron a ambos lados de la capa celular, y la integridad de la función de barrera se evaluó midiendo la resistencia de la corriente iónica a través de la barrera celular38. La resistencia total se restó de la resistencia ambiental, como la resistencia de la membrana de cultivo y la resistencia del medio, y se multiplicó por el área de la membrana de cultivo para obtener la resistencia final a la BHE (TEER, Ωcm2)39. Un valor más alto de los valores de TEER representa un mayor grado de uniones estrechas entre las células. La medición de TEER la operación es simple y no invasiva, la función de barrera celular una vez formada la resistencia estaría en un rango estable. Esta característica permite al operador mantener valores TEER similares incluso cuando se utilizan diferentes instrumentos en condiciones de funcionamiento estándar. Solo la temperatura y la colocación de la inserción del electrodo requieren una atención adicional por parte del operador. El aumento de la temperatura y el hecho de que el electrodo toque el fondo disminuirá la resistencia de la celda.
En este estudio, se construyó con éxito un modelo sencillo de célula monocapa BBB in vitro mediante la evaluación de la resistencia temporal de las células bEnd.3 en la cámara superior de la placa. El ambiente hipóxico inducido por CoCl2interrumpió la unión estrecha entre las células endoteliales, lo que redujo significativamente la TEER en comparación con las células normales. De acuerdo con este experimento, el protocolo descrito en el proceso estándar para crear un modelo de BHE in vitro tiene una alta tasa de éxito y repetibilidad. Solo es necesario modificar la densidad de siembra si este experimento se ejecuta con diferentes especificaciones de placas de pocillos y los niveles de líquido en las cámaras superior e inferior de las placas están al ras. Sin embargo, el valor de TEER se verá algo afectado por la ubicación incorrecta del electrodo y la heterogeneidad del campo eléctrico en toda la capa12 de la celda. En la mayoría de los casos, la TEER se confirmará simultáneamente mediante inmunofluorescencia y detección de permeabilidad en función de los requisitos de estudio de los distintos modelos de BHE. Este modelo celular se mejorará en el futuro para descartar los medicamentos que pueden sufrir el daño de la barrera hematoencefálica provocado por la hipoxia. En conclusión, es probable que el uso de la tecnología de detección TEER tenga un impacto significativo en la creación de medicamentos y estrategias terapéuticas para enfermedades neurológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274207 y 82104533), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012) y el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de MTC de Chengdu (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
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