Summary
Detta protokoll beskriver en pålitlig och effektiv in vitro-modell av hjärnans blodbarriär. Metoden använder cerebrala vaskulära endotelceller bEnd.3 från möss och mäter transmembrant elektriskt motstånd.
Abstract
Blod-hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk fysiologisk struktur som består av mikrovaskulära endotelceller, astrocyter och pericyter. Genom att samordna interaktionen mellan begränsad passage av skadliga ämnen, näringsupptag och metaboliteliminering i hjärnan är BBB avgörande för att bevara centrala nervsystemets homeostas. Att bygga in vitro-modeller av BBB är ett värdefullt verktyg för att utforska patofysiologin för neurologiska sjukdomar och skapa farmakologiska behandlingar. Denna studie beskriver en procedur för att skapa en in vitro monolager BBB-cellmodell genom att plantera bEnd.3-celler i den övre kammaren på en 24-håls platta. För att bedöma integriteten hos cellbarriärfunktionen användes den konventionella epitelcellvoltmetern för att registrera det transmembrana elektriska motståndet hos normala celler och CoCl2-inducerade hypoxiska celler i realtid. Vi förväntar oss att ovanstående experiment kommer att ge effektiva idéer för skapandet av in vitro-modeller av BBB och läkemedel för att behandla sjukdomar i centrala nervsystemet.
Introduction
BBB är ett unikt biologiskt gränssnitt mellan blodcirkulation och nervvävnad, som består av vaskulära endotelceller, pericyter, astrocyter, neuroner och andra cellulära strukturer1. Flödet av joner, kemikalier och celler mellan blodet och hjärnan regleras strikt av denna barriär. Denna homeostas skyddar nervvävnaderna mot gifter och patogener samtidigt som den möjliggör lämplig drift av hjärnans nerver 2,3. Att upprätthålla BBB:s integritet kan effektivt förhindra utveckling och progression av sjukdomar som påverkar det centrala nervsystemet, såsom neuronal dysfunktion, ödem och neuroinflammation4. De unika fysiologiska egenskaperna hos BBB förhindrar dock att mer än 98 % av småmolekylära läkemedel och 100 % av makromolekylära läkemedel kommer in i det centrala nervsystemet5. Därför är det viktigt att öka penetrationen av läkemedel genom BBB under utvecklingen av läkemedel för det centrala nervsystemet för att uppnå terapeutisk effekt 6,7. Även om datorsimuleringsscreening av substrat avsevärt har ökat sannolikheten för att läkemedelskandidater passerar BBB, behövs fortfarande tillförlitliga och prisvärda in vitro/in vivo BBB-modeller för att möta behoven av vetenskaplig forskning8.
En snabb och prisvärd teknik för läkemedelsscreening med hög kapacitet är in vitro-modell 9. För att belysa de grundläggande processerna för läkemedels effekter på BBB-funktion och deras roll i utveckling och progression av sjukdom har en serie förenklade in vitro-modeller skapats. För närvarande är de vanliga in vitro BBB-modellerna monolager-, samkultur-, dynamiska och mikrofluidiska modeller 10,11,12, konstruerade av vaskulära endotelceller och astrocyter, pericyter eller mikroglia 13,14. Även om 3D-cellkulturer är mer i linje med den fysiologiska strukturen hos BBB15, är deras tillämpning som ett sätt att screena läkemedel för BBB fortfarande begränsad av deras intrikata design och undermåliga reproducerbarhet. Däremot är monolagermodellen in vitro den som oftast används för att undersöka BBB och är tillämplig för att bestämma uttrycket av membrantransportörer och tight junction-proteiner i vissa celler.
Mätning av transmembrant elektriskt motstånd (TEER) är en teknik för att utvärdera och övervaka cellskiktet över motståndet och utvärdera barriärens cellintegritet och permeabilitet. Genom att samtidigt föra in två elektroder i odlingsmediet eller buffertlösningen på vardera sidan av monolagret är det möjligt att mäta växelströmmen eller den elektriska impedansen genom cellens kompakta skikt16,17. För att avgöra om in vitro-BBB-modellen har skapats på ett korrekt sätt kommer mätningen av TEER vanligtvis att användas som guldstandard18. Å andra sidan kan trenden för läkemedelsverkan på BBB-permeabilitet exakt förutsägas genom att mäta förändringen i celskiktets elektriska motstånd efter läkemedelsinblandning19. Till exempel upptäckte Feng et al. att catalpol (den primära aktiva monomeren av rehmanniae) effektivt kunde vända den lipopolysackaridinducerade nedregleringen av tight junction-proteiner i BBB och höja TEER-värdet i mushjärnans endotelcellslager20.
Det neuroinflammatoriska svaret är vanligtvis den främsta orsaken till BBB-homeostasobalans21. Hypoxisk behandling för att inducera neuroinflammatorisk skada är den huvudsakliga metoden för att förstöra blod-hjärnbarriären, främst inklusive fysikaliska metoder och kemiska reagensmetoder. Den förstnämnda använder främst en tregasinkubator för att variera syrehalten i celltillväxtmiljön för att simulera hypoxiska förhållanden22, medan den senare uppnås genom att artificiellt introducera deoxireagenser såsom CoCl2 till cellodlingsmediet23. Cellerna kommer att förbli i ett syrefattigt tillstånd om Fe2+ ersätts med Co2+ i hemet. Om Fe2+ substitueras med Co2+ i den katalytiska gruppen hämmas prolinhydroxylas- och aspartathydroxylasaktiviteten, vilket resulterar i en ackumulering av hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α)24. Under ihållande hypoxi utlöser defosforyleringen av HIF-1α i cytoplasman celldöd och aktiverar vaskulär endotelial tillväxtfaktor, vilket i slutändan ökar vaskulär permeabilitet. I tidigare studier 25,26 har det väl visats att hypoxi signifikant kan minska uttrycket av endoteliala tight junction-proteiner för att öka permeabiliteten av BBB. I denna studie mättes tidsresistanskurvan för bEnd.3-celler sådda i 24-hålsplattor för att skapa en enkel BBB-modell. Med hjälp av denna modell karakteriserade vi förändringarna i cell-TEER efter CoCl2-intervention för att konstruera en cellmodell som kan användas för att screena läkemedel för BBB-skydd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Endotelceller från mushjärna.3 (bEnd.3) inokulerades i kamrarna på en 24-hålsplatta för att konstruera en enkel in vitro-modell av BBB under specifika mediumförhållanden. TEER för normala celler och hypoxiska celler mättes med TEER-mätare (figur 1 och figur 2).
1. Beredning av lösningen
- Bered DMEM-cellodlingsmediet som innehåller FBS (10 %, v/v), 100 E/ml penicillin och 10 mg/ml streptomycin (se materialförteckning).
- Bered 100 mM stamlösning av CoCl2 genom att tillsätta 1,30 mg CoCl2 till 100 μl DMSO-lösning.
OBS: Alla ovanstående lösningar förvarades vid 4 °C och stamlösningen späddes enligt önskad koncentration före användning. - Bered 5 % natriumhypokloritlösning (v/v) genom att tillsätta 2 ml natriumhypokloritlösning till 38 ml dubbeldestillerat vatten.
2. Cellodling och cellviabilitet
- Frö 1 ml bEnd.3-celler i odlingsskål (100 mm) innehållande DMEM-medium med en densitet av 1 x 106 celler/ml och kultur vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 % CO2 . Byt medium var 2:e till 3:e dag och subodla cellerna 2 gånger i veckan.
- Efter bEnd.3-cellerna växer till 80 % sammanflöde, smält cellerna med 0,25 % trypsin i 30 s.
- Gör en suspension av bEnd.3-celler med en densitet på 7 x 104 celler/ml med hjälp av DMEM-medium genom en cellräknare. Kärna sedan 100 μL bEnd.3-cellsuspension i en 96-hålsplatta.
- Efter cellvidhäftning, rengör cellerna med PBS och odla cellerna med 100 μL odlingsmedium eller läkemedelsinnehållande medium (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) i 24 timmar under samma förhållanden. Efter att ha tagit bort mediet inuti brunnsplattan och rengjort det med PBS, tillsätt 100 μL CCK-8-lösning.
OBS: Generera inte bubblor i brunnen, vilket kommer att påverka värdena för optisk densitet (OD). - Placera 96-brunnsplattor i 37 °C miljö och inkubera i 1 timme. Mät absorbansen hos 96-hålsplattorna vid 450 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
OBS: För att undvika skillnader inom gruppen kyldes brunnsplattorna till rumstemperatur före detektion. - Beräkna cellviabiliteten inducerad av olika koncentrationer av CoCl2 enligt formeln [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Välj CoCl2-koncentrationen med en signifikant skillnad i cellviabilitetsreduktion jämfört med kontrollgruppen för nästa experiment.
3. Montering av modell
- Skölj den övre kammaren på 24-brunnsplattorna med PBS.
OBS: Celler växte och smälte samman i botten av den övre kammaren på 24-hålsplattan, och täta korsningar mellan cellerna bildades gradvis för att spela en barriärroll. Om endotelcellerna som används i vissa studier inte kan bilda en fullständig barriär på PET-membran oberoende av varandra, krävs beläggning av membranen med kollagen IV-lösning före cellinokulering. - Blanda bEnd.3-cellerna med DMEM-medium för att göra en suspension med en densitet av 5 x 105 celler/ml med hjälp av en virvelblandare. Frö sedan 200 μL bEnd.3-cellsuspension på PET-membranet i den övre kammaren på en 24-hålsplatta (0,33 cm2, 0,4 μm membranporstorlek).
OBS: Pilotstudien av detta protokoll fann ingen skillnad i resultat vid användning av 5 till 10 passager av bEnd.3-celler för experiment. För att säkerställa sannolikheten för framgångsrik modellering, se cellnummerintervallet för detta protokoll. - Tillsätt 1200 μL komplett medium till plattans nedre kammare för att säkerställa att det osmotiska trycket i de övre och nedre kamrarna tenderar att stabiliseras. Det finns skillnader i volymen av tillsatt medium beroende på typ; Se till att vätskenivån i de övre och nedre kamrarna är jämn.
- Byt medium i den övre kammaren och den nedre kammaren vid en fast tidpunkt varje dag och övervaka motståndsvärdet samtidigt.
- Vid byte av medium kommer celskiktets integritet att skadas av konstgjord beröring eller överdriven rörelse. För att undvika ovanstående situation, ta långsamt bort det gamla mediet från ena sidan med en undertryckspipett och tillsätt långsamt ett nytt medium längs väggen under vätskeutbytet.
4. Mätning av TEER
- Innan arbetet påbörjas, placera motståndet, 5 % natriumhypokloritlösning, 75 % etanol och dubbel destillerad vattenlösning i ett ultrarent bord. Slå på UV-bestrålningen i 30 minuter för att eliminera kvarvarande bakterier och patogener.
- Placera elektroderna i 5 % natriumhypokloritlösning under långsam skakning i 3 s till 5 s och sänk sedan ner dem i 75 % etanol i 15 minuter. Överför slutligen till PBS eller dubbel destillerad vattenlösning fram till användning.
- Slå PÅ omkopplaren på baksidan av cellmotståndsmätaren, klicka på Välj platta enligt parametrarna i tabell 1 och välj 24-brunnsplatta.
- Välj lämplig detekteringssekvens beroende på operationsbehoven. Vi valde A1-procedur i denna studie.
- Sätt i ett kΩ-motstånd i den högra kontakten för att kalibrera instrumentet. Om kalibreringsresultatet är 1000 ± 5 Ω, betrakta instrumentets noggrannhet som normal.
- Om kalibreringsresultatet inte är 1000 Ω, klicka på Lägesenheter på huvudgränssnittet för att välja OHMS och klicka sedan på Kalibrera på huvudskärmen för att kalibrera om instrumentet.
- Dra ut kΩ-motståndet på höger sida och byt ut mätelektroden mot en anslutningskabel.
- Placera elektroden i 24-hålsplattan utan såddceller vertikalt och klicka på Blank Handling på instrumentets huvudskärm. Bakgrundsvärdet för plattresistansen utan sådda celler är cirka 134,4 Ω.
- Sätt in de två elektroderna i de övre och nedre kamrarna på den sådda plattan med celler så att cellskiktet är mellan dem, och registrera sedan motståndsvärdet genom att försiktigt trampa på pedalen.
- Se till att elektroden inte vidrör cellerna i den övre kammaren och botten av den nedre kammaren. Blötläggningstiden för elektroden i lösningen har ingen effekt på resistansvärdet, och det är bara nödvändigt att se till att elektroden är i rätt läge.
- Erhåll TEER-värden (Ωcm2) genom att multiplicera elektriska resistansvärden (ohm) med den nedre arean (cm2) av den övre kammaren, som i ekvationen:
TEER (Ωcm2) = Motstånd (Ω) xS-insats (cm2) - Rita ett linjediagram över TEER-Time (i dagar). När motståndsvärdet inte ökar ytterligare med tiden (mätt över dagar), betrakta cellen som en barriär.
ANMÄRKNINGAR: Monolayer BBB-modellen av bEnd.3-celler kommer att konstrueras framgångsrikt genom att odla bEND.3-celler med parametrarna i denna studie under cirka 6 dagar. TEER för bEnd.3-cellens monolagermodell varierade från 16,49 ± 2,12 Ωcm2 till 27,59 ± 1,50 Ωcm2 inom 6 dagar (n=8, medelvärde ± SD).
5. Barriärförstöring och statistisk analys
- Enligt TEER-tidskurvan, välj brunnarna med barriärfunktion och dela upp dem i kontrollgruppen och CoCl2-gruppen (n = 4).
- Tillsätt odlingssubstratet och odlingssubstratet som innehåller 300 μM CoCl2 (200 μL) i kontrollgruppen respektive CoCl2-gruppens övre kammare.
- Detektera resistansvärdena för kontroll- och CoCl2-grupperna vid 12 timmars och 24 timmars inkubation vid 37 °C med hjälp av det förfarande som beskrivs i steg 4.
- Använda kommersiell programvara för att kartlägga trenden för TEER-värden för barriären hos celler odlade med eller utan 300 μM CoCl2.
- Använd statistisk analysprogramvara för att analysera skillnaden i resistensvärden mellan CoCl2-behandlade celler och normala celler (n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll gjorde det möjligt att registrera förändringar i cellernas resistansvärden enligt de parametrar som ställts in i transendotelresistormätaren. Viaabiliteten hos bEnd.3-celler (antal levande celler) som behandlades med olika koncentrationer av CoCl2 screenades med CCK-8-analys. Större cellskador orsakade av CoCl2 representerades av lägre cellviabilitet. Vi fann att 300 μM CoCl2 var signifikant cytotoxiskt in vitro, och denna koncentration användes för de följande experimenten (figur 3A). Genom att övervaka tillväxtmotståndsförändringarna i bEnd.3 fann vi att cellernas TEER-värden började stabiliseras på den 5:e dagen. Hypoxisk skada inducerad av tillsats av 300 μM CoCl2 till plattans övre kammare på den 6:e dagen resulterade i en signifikant minskning av TEER-värdena jämfört med kontrollen vid både 12 och 24 timmars tidpunkter (figur 3B). Cellbarriärens funktion kan indirekt bedömas med hjälp av TEER-värdet, och en minskning av TEER-värdet indikerar cellbarriärens nedbrytning. TEER-värdet för 300 μM CoCl2-gruppen sjönk jämfört med kontrollgruppen efter inkubation i 24 timmar (figur 3C). Den tidigare nämnda forskningen visade att skador på BBB in vitro-modellen kan orsakas av en hypoxisk miljö orsakad av CoCl2.
Figur 1: Instrument och tillbehör för mätning av TEER. (A-B) Drifthuvudgränssnitt för TEER-mätaren. (C-D) En platta med 24 brunnar. (E) Den lösning som krävs för rengöring och desinfektion av elektroder. F) Standardresistans krävs för kalibrering av TEER-mätaren. (G-H) Elektroden och den lokala förstoringen. (I) Fotpedal användes för att samla in data. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flödesscheman över transmembranresistansen hos bEnd.3-celler registrerade med hjälp av en transendotelial resistormätare. (A) Cellodling. (B) BEnd.3-cellerna såddes i plattornas övre kammare, och en tät cellbarriär bildades genom att fylla brunnsplattorna med medium för att stödja deras tillväxt och differentiering. (C) Cellernas barriärfunktionella integritet bedömdes genom övervakning av TEER. (D) CoCl2 användes för att efterlikna den hypoxiska miljön för att inducera nedsatt cellbarriärfunktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Salidrosid bibehåller integriteten hos barriärfunktionen hos bEnd.3-celler genom att lindra CoCl2-inducerad hypoxisk skada. (A) Effekten av CoCl2 (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM) på livskraften hos bEnd.3-celler (n = 6, CoCl2-gruppen jämfört med kontrollgruppen ***p<0,001, medelvärde ± SD). (B) Diagram över förändringar i TEER-värden för bEnd.3-celler behandlade med normalt medium eller 300 μM CoCl2(n=4, dag 1 jämfört med dag 2-6: ##p<0.01, ###p<0.001, dag 6 jämfört med dag 6.5 - 7: **p<0.01, medelvärde ± SD). (C) TEER-förändringar av celler efter 24 timmars hypoxisk skada (n=4, CoCl2-gruppen jämfört med kontrollgruppen ***p<0,001, medelvärde ± SD). Envägs ANOVA och Tukeys test utfördes, och p<0,05 ansågs vara signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parametrar | Alternativ |
| Välj platta | 24-Brunnar |
| Ordning för identifiering | A1 |
| Lägesenheter | Ω |
| Standard-motstånd | 1 kΩ |
Tabell 1: Ställ in parametrar för TEER-mätaren. Parameterinställningarna och programvalet av instrumentet krävs för detektering av cellmotstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärnan är ett av de mest utvecklade kroppsorganen och styr ett brett spektrum av intrikata fysiologiska processer, inklusive minne, kognition, hörsel, luktoch rörelse. Hjärnan är ett av människokroppens mest komplicerade och sjuka organ på samma gång. Förekomsten av många sjukdomar i centrala nervsystemet visar en ökande tendens från år till år på grund av faktorer som luftföroreningar, oregelbundna matvanor och andra faktorer 27,28,29. Det är intressant att början och utvecklingen av vissa sjukdomar i centrala nervsystemet, såsom stroke, epilepsi och Alzheimers sjukdom (AD), är nära korrelerade med tillväxten av BBB 30,31,32. Det grundläggande konceptet för behandling av de flesta sjukdomar med hjärndysfunktion kan vara skapandet av nya terapier eller mediciner för att upprätthålla BBB-funktionell homeostas. Tyvärr kan de flesta läkemedel inte komma in i hjärnans parenkym för att utföra sina vitala funktioner på grund av BBB:s hydrofobicitet och dess unika transportmetod för lösta ämnen14,33. För att öka sannolikheten för att ett läkemedel kommer att bli framgångsrikt är det en bra strategi att skapa nya BBB-modeller som kan användas för storskalig molekylär screening.
På grund av den intrikata strukturen hos den neurovaskulära enheten har in vivo-modellen teoretiskt sett en högre grad av modellering av BBB-strukturen. På grund av begränsningen av homologi mellan djur och människor kan dock variationerna i BBB-transportörer leda till att läkemedelsscreening inte får det förväntade resultatet34. Tvärtom erbjuder in vitro-modeller fördelarna med att vara billiga, ha en snabb detektionscykel och kunna användas för screening med hög kapacitet, vilket bättre kan tjäna målen för forskning om neurologiska sjukdomar. Med utvecklingen av vetenskap och teknik skapas och förbättras fler och fler in vitro-modeller som liknar BBB:s fysiologiska struktur. Förutom skillnaden mellan simuleringstekniker för statiska och dynamiska plattformar finns det signifikanta skillnader i vilka celltyper och antal som används35. Sådd av endotelceller i botten av den övre kammaren är den enklaste BBB-cellmodellen och ett utmärkt tillvägagångssätt för transportkinetik och cellsignalväg36. Samodlingsmodeller lägger till interaktioner med pericyter eller gliaceller på basen av monolagerceller, men dessa modeller begränsas ofta av oförmågan att få korrekt cellpositionering och riktad kontroll12. Den dynamiska modellen med 2D- och 3D-struktur är för närvarande den mest exakta representationen av den dynamiska mikromiljön hos BBB in vitro; Det är dock viktigt att notera att utvecklingen av denna modell innebär omfattande tidigare design- och valideringsinsatser. Genom att välja rätt BBB-modell i enlighet med forskningens verkliga behov kan man få mer exakta experimentella resultat.
Utvärderingsmetoderna för den funktionella integriteten hos BBB in vitro-modellen inkluderar vanligtvis ett permeabilitetstest och ett transmembranresistansvärdestest. Det förstnämnda åstadkoms huvudsakligen genom att bedöma permeabiliteten hos fluoresceinmärkta makromolekylära substanser. Metoden är enkel och exakt, men celskiktets struktur förändras efter att den fluorescerande substansen passerat, vilket resulterar i lågt provutnyttjande37. Denna brist kompenseras på ett effektivt sätt genom utvecklingen av TEER-detektionsmetoden. De två elektroderna placerades på båda sidor av cellskiktet, och barriärfunktionens integritet bedömdes genom att mäta jonströmsmotståndet över cellbarriären38. Den totala resistansen subtraherades från miljöresistansen, såsom odlingsmembranresistans och mediumresistans, och multiplicerades med kulturmembranets area för att erhålla den slutliga BBB-resistansen (TEER, Ωcm2)39. Ett högre värde på TEER-värden representerar en högre grad av täta korsningar mellan celler. TEER-mätningen av operationen är enkel och icke-invasiv, cellbarriärfunktionen när den väl har bildats skulle vara i ett stabilt intervall. Denna funktion gör det möjligt för operatören att bibehålla liknande TEER-värden även vid användning av olika instrument under standarddriftsförhållanden. Endast temperaturen och placeringen av elektrodinsättningen kräver extra uppmärksamhet från operatören. Temperaturökningen och elektroden som vidrör botten kommer att minska cellmotståndet.
I denna studie konstruerades framgångsrikt en enkel BBB-monolagercellmodell in vitro genom att utvärdera det temporala motståndet hos bEnd.3-celler i plattans övre kammare. Den hypoxiska miljön som inducerades av CoCl2störde den täta förbindelsen mellan endotelceller, vilket signifikant minskade TEER jämfört med normala celler. Enligt detta experimentprotokoll som beskrivs i standardprocessen för att skapa en in vitro BBB-modell har en hög framgångsfrekvens och repeterbarhet. Endast sådddensiteten behöver ändras om detta experiment körs med olika brunnsplattspecifikationer och vätskenivåerna i plattornas övre och nedre kammare är jämna. TEER-värdet kommer dock att påverkas något av elektrodens felaktiga placering och det elektriska fältets heterogenitet i hela cellager12. I de flesta fall kommer TEER att bekräftas samtidigt genom immunofluorescens- och permeabilitetsdetektion beroende på studiekraven för olika BBB-modeller. Denna cellmodell kommer att förbättras i framtiden för att sålla bort läkemedel som kan drabbas av de BBB-skador som orsakas av hypoxi. Sammanfattningsvis kommer användningen av TEER-detektionsteknik sannolikt att ha en betydande inverkan på skapandet av mediciner och terapistrategier för neurologiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (82274207 och 82104533), Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) och Xinglin Scholar Research Promotion Project vid Chengdu University of TCM (XKTD2022013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A.
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M.
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al.
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
