Summary
在这里，我们介绍了1922年大规模 的Tityus serrulatus Lutz和Mello（巴西黄蝎）饲养的成功维护和毒液提取方案，目的是为随后的蝎子抗蛇毒血清生产提供毒液，以满足巴西卫生系统的需求。
Abstract
蝎子毒液是几个热带和亚热带国家的公共卫生问题。 Tityus serrulatus Lutz 和 Mello，1922 年（巴西黄蝎子）每年在巴西造成约 150,000 例毒液中毒病例，其中 10% 需要抗蛇毒血清治疗以逆转危及生命的毒液效应。因此，数以千计的 锯齿锥虫 个体被维持在受控的圈养条件下进行毒液提取，随后用于生产国家供应的蝎子抗蛇毒血清。布坦坦研究所是巴西主要的抗蛇毒血清生产实验室，为巴西卫生系统提供约70,000瓶蝎子抗蛇毒血清。因此，饲养方案和毒液提取方法是成功实现大规模、标准化毒液生产的关键点。本文的目的是描述 锯齿毛虫 饲养的圈养协议，包括饲养程序和毒液提取程序，遵循良好的生产规范，并确保动物福利。这些做法允许饲养多达 20,000 只圈养动物，根据抗蛇毒血清生产需求每月挤奶 3,000 至 5,000 只蝎子，平均达到 90% 的阳性提取率。
Introduction
蝎子是属于蛛形纲的节肢动物，蝎子目，包括大约 2,621 种 1,2。这些动物的地理范围很广，分布在除南极洲以外的所有大陆1.蝎子引起的毒液毒液每年导致全球数千人发病或死亡3.据估计，2019 年，这些动物每年造成超过 120 万起事故和 3,500 人死亡。在巴西，病例数呈指数级增长，自 2017 年以来每年达到 100,000 多例4、5、6。过去几十年来，巴西观察到不受控制的城市化，没有充分的污水处理和定期收集和处置垃圾，与环境退化和气候变化有关，为入侵蝎子的繁殖提供了条件，如锯齿蝎，增加了与人类的接触，从而导致了有害事故4,7,8.巴西大约有 178 种蝎子，但具有医学重要性的蜇伤是由 Tityus 属引起的，其中四种（T. serrulatus、T. bahiensis、T. stigmurus 和 T. obscurus）是医学问题，其中 Tityus serrulatus 是造成最严重病例和死亡的原因 7,9.
布坦坦研究所是巴西主要的抗蛇毒血清生产实验室，为巴西卫生系统提供约70,000瓶蝎子抗蛇毒血清。简而言之，抗蛇毒血清生产所涉及的步骤包括在马中接种毒液衍生抗原，收集和纯化富抗体血浆，从而产生 5 mL 小瓶蝎子抗蛇毒血清。每瓶抗蛇毒血清至少能中和 1 毫克蝎子毒液。节肢动物生物群是工业中心不可分割的一部分，负责为蝎子抗蛇毒血清提供源材料。
布坦坦研究所的节肢动物生物馆最初被命名为节肢动物实验室，成立于 1967 年。然而，直到 1995 年，实验室才搬到了专门用于饲养有毒节肢动物10,11 的专用设施。当时，蝎子被饲养在一个 12 m2 的房间里，没有控制温度，分布在大约 13 个围栏中，每个围栏最多可容纳 300 只动物10.由于多年来对毒液的需求不断增加，随之而来的需要增加动物数量，以及毒液提取过程的改进，2016 年发生了重大变化。该实验室并入布坦坦研究所的工业中心，并更名为节肢动物生物馆。此外，在 2016 年，Bioterium 搬到了一个新的专用设施。新的蝎子室占地 24 m2，包含大约 48 个聚丙烯围栏，每个围栏最多可容纳 300 只动物，如图 1 所示。这导致总共有 10,000 到 20,000 人被维持在受控圈养条件下，全年都在变化。蝎子在严格的饲养规程下得到精心管理，以确保它们的福利，同时满足高生产要求并遵守动物护理的良好规范和道德标准。为了提取毒液，设计和建造了一个特定的房间，容纳了两个气流柜，如图2A所示。这些机柜作为安全措施，防止技术人员在提取过程中吸入毒液颗粒。技术人员必须配备个人防护装备 （PPE），包括合成围裙和 FFP2 口罩，以避免任何污染并确保他们的安全。
图1：节肢动物生物群的蝎子房间的一般视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：工作区 。 （A） 节肢动物生物群的毒液提取室的一般视图。（B） 气流柜工作台面。所有材料和设备都准备好并布置在气流柜工作台面的顶部。黑色箭头表示电刺激器装置，红色箭头表示镊子。 请点击这里查看此图的较大版本.
节肢动物生物群中约90%的 锯齿蝎 子来自不同的地点，由市政卫生人员收集，作为这些动物监测和控制计划的一部分。这些蝎子在城市地区被捕获，然后作为合作计划的一部分被送往布坦坦研究所。 锯齿蝎 是孤雌生殖的，这意味着出生是从未受精卵发育后代的结果，没有异性个体的存在12.由于这种类型的繁殖，一些动物在我们的设施中被圈养出生，并按照如下所述的类似饲养方案进行饲养，直到它们达到成年期。一旦它们达到成虫阶段，它们就会被添加到毒液提取程序中。抵达后，蝎子会接受初步筛选，健康状况良好的蝎子将被饲养在最多可容纳 350 只的集体围栏中，按其来源划分。对于每个围栏，每天填写一份控制表，提供有关喂食日期和提供的猎物类型（蟋蟀或蟑螂）、供水、清洁程序、死亡动物数量以及围栏内剩余活动物数量的数据。
在预先安排的议程中，动物受到电刺激，然后将数百个体的毒液冻干，从而产生成批的冻干毒液。从该工艺中获得的标准化毒液作为制造过程的一部分用于马免疫，并为活性物质和最终产品的质量控制提供参考物质。
世界上很少有设施能够饲养如此多的蝎子，并按照良好的生产规范和动物的道德使用进行大量毒液提取，就像布坦坦研究所的节肢动物生物群所做的那样。因此，我们的目标是描述 锯齿 蝎饲养中使用的蝎子维持方案和毒液提取程序，它们成功地为蝎子抗蛇毒血清的生产提供了必要量的毒液。
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Protocol
涉及无脊椎动物的协议免于布坦坦研究所动物使用和护理委员会的批准。然而，这里描述的蝎子的维护遵循道德参数，并且根据物种的需要尊重动物福利。
1. 住房
- 将蝎子饲养在公共聚丙烯容器中，作为围栏（高 35 厘米，宽 35.5 厘米，长 72 厘米），最多可容纳 350 只动物。
- 将饲养动物围栏的房间保持在24°C（±0.5°C）的受控温度下，在灯打开10小时和灯关闭14小时的光循环中。
- 在每个容器的外壳地板（底部）上铺上牛皮纸，在四面八方的边缘用遮蔽胶带固定，这样动物就不会进入纸下面（图3A）。
- 使用四个纸板托盘（蛋托盘）作为垂直基材，堆叠在容器的一侧，每个托盘之间放置一块硬纸板（图3B，C）。
- 在外壳的另一侧放置一个浅聚丙烯托盘（水托盘），其中包含浸泡的棉花作为动物的水源（图3B）。
- 保持容器不带盖以增加气流。在外壳内表面的顶部和上角放置一条约10厘米的自粘塑料胶带，以使墙壁足够光滑，以防止动物从容器中逸出（图3A）。
图 3：外壳和外壳准备 。 （A） 箭头表示底部的牛皮纸，边缘用遮蔽胶带固定。虚线表示放置在外壳内表面顶部的自粘塑料胶带。（B） 垂直基材（堆在容器一侧的蛋托）和放置在另一侧的浅聚丙烯托盘（水托盘）。（C） 垂直基材细节：在两个托盘之间用硬纸板起球的蛋托。（D）层层放置的纸板和蛋托，模拟 了沙氏毛蛾 的自然黑暗和潮湿栖息地。 （E） 饲养在基质中的动物。 请点击这里查看此图的较大版本.
2. 卫生习惯
注意： 卫生程序分为两个维护程序：完全维护和部分维护。第一个是在喂养动物后2天或选择围栏进行毒液提取时进行的。当动物没有被喂食时，进行部分维护。
- 全面维护
- 如第 1 节所述，准备一个带有新基材（蛋托、纸板和牛皮纸）和干净水托的干净外壳。
- 使用长镊子，从外壳上取下水盘。如果水盘上有蝎子，请将它们取出并放入干净的外壳中。
- 对所有蛋托和纸板重复步骤 2.1.2 中描述的相同步骤，取出所有蝎子并将它们放入干净的外壳中。
- 取下托盘后，取出所有留在外壳地板上的蝎子，并将它们放入干净的外壳中。请务必考虑任何尸体并妥善丢弃它们。收集所有剩余的活猎物（昆虫）并将它们从围栏中取出。
- 从外壳中取出所有一次性基材（蛋托、纸板和牛皮纸）并正确丢弃。将可重复使用的物品（水盘和聚丙烯容器）送去进行卫生。
注意： 可重复使用物品的卫生是用 0.5% 次氯酸盐和中性清洁剂进行的。使用任何卫生产品或溶液后，必须用流水彻底冲洗材料。
- 部分维护
注意： 部分维护包括检查所有基材（蛋托和牛皮纸），目的是去除死蝎子尸体和其他不需要的碎屑，但不要丢弃基材或更换外壳。- 使用长镊子轻轻提起每个蛋托并清除废物进行检查。
- 如果需要，用干净的蛋托更换一个或多个蛋托。
- 使用长镊子用干净的水盘完全更换水盘。将水盘上的任何蝎子转移到外壳另一部分的蛋托上。
3. 喂食
- 根据毒液提取时间表，每15天喂一次动物。喂养在毒液提取前 7 天和提取毒液后 7 天挤奶的动物。
- 对于喂食，交替供应蟑螂（Phoetalia pallida）和蟋蟀（Gryllus sp.）。
- 根据动物的能量摄入量计算食物量;为围栏内的每 1 或 3 只蝎子提供 5 个猎物。
- 计算出的猎物数量并将它们活着放入围栏内，在完全维护之前将它们放置 2 天（第 2.1 节）。
- 提供蟑螂时，在外壳顶部周围涂抹碳酸钙和酒精溶液。该解决方案导致蟑螂打滑，无法爬上围栏的侧面，从而防止昆虫逃逸。
4.毒液提取
注意：毒液提取程序中使用的动物是成虫或成虫前。由于难以确定巴西黄蝎子的完全性成熟（成年期），因此确定体长为 5 至 7 厘米的动物有资格进行该手术。
- 每 2-3 个月给每头动物挤奶一次。
- 在提取毒液的当天，计算围栏内所有活的动物，并使用长镊子将它们转移到玻璃容器中（图4）。
- 准备和布置气流柜工作台面顶部要使用的所有材料和设备。将电刺激器电源线插入插座，然后打开电刺激器和气流柜（图 2B）。
- 使用以下电刺激器参数设置：电位（电极之间的电位差）：540 mV，应力（电脉冲持续时间）：2 ms，作用（间歇性以调节使用的效力，这将减少 telson 有机组织的加热）：70%，循环（调整循环重复）：1 s，强度（通过动物肌肉循环的电流）： 0.75毫安。
- 按照以下步骤手动约束每只动物，使 telson 静止不动：
- 用直镊子握住动物的变形体（图5A）。
- 用弯曲的镊子固定telson（图5B）。
- 用手束缚telson（图5C，D）。
- 约束后，将telson与电刺激器导体直接接触，无需使用导电溶液。电击导致毒液腺的肌肉不自主收缩，随后毒液喷射。
- 将毒液滴直接收集到靠近电刺激器导体的塑料微管中（图6）。
- 接下来，按照以下步骤将动物放回玻璃容器中：
- 将动物的端子从手转移到弯曲的镊子上。
- 将动物轻轻地放在玻璃容器的底部。
- 对玻璃杯中的每只动物执行步骤4.4-4.7。
- 在玻璃杯中挤奶的所有动物都挤完奶后，将它们放回围栏内。
- 将收集的毒液储存在-20°C，直到冻干过程。
图4：玻璃容器中的蝎子。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：毒液提取的限制程序 。 （A） 用直镊子（黑色箭头）束缚的 Metassoma。（B） Telson用弯曲的镊子固定（黑色箭头）。（C） 将受约束的端子从镊子转移到手上。（D） 特尔森被手束缚。建议徒手处理动物，因为当使用手套时，蝎子会用爪子抓住材料，因此在手术结束时难以释放它们，并大大增加了发生事故的风险。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：毒液提取。 放置在靠近电刺激器（黄色箭头）的塑料微管（白色箭头）。在手术过程中，毒液滴被直接收集到保持在室温的管中。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
每个程序都制定了30个标准操作程序（SOP），确保了技术人员之间程序的可重复性并符合质量参数。提取程序后的平均死亡率约为 12%，考虑到电刺激程序和圈养环境，通过应用程序成功降低了压力因素，这可以被认为是低的。
为了保持动物的健康，在盒子的一端放置一个覆盖着棉花和水的托盘，而纸板和蛋托则在另一侧分层放置，模拟 了 T. serrulatus 的自然黑暗和潮湿栖息地（图 3D、E）。所描述的基质已被证明可有效将大量动物维持在密闭空间内，提供足够的庇护所和空间，从而确保它们的福利。
每年，锯齿锥虫毒液的产量超过80克液体毒液，相当于超过13克冻干毒液。我们一直在收集生产指标，例如每头动物挤奶的平均毒液、动物数量和每月获得的毒液量，如表 1、图 7、图 8 和图 9 所示。 三张图显示正趋势线，表示正皮尔逊相关系数（分别为R=0.68;R= 0.84;和 R= 0.74）。根据抗蛇毒血清的生产需求，每月挤奶约3,000至5,000只蝎子，平均90%的阳性提取率。大多数动物在设施中的生产寿命期间都会接受五次以上的毒液提取程序，这反映了动物的寿命长、发病率或毒腺损伤率低以及死亡率低。重要的是要指出，从被提取更多次的蝎子中获得的毒液量有所减少，但它们仍然具有生产力。
图7：2012-2022年每只动物每月提取的冻干毒液比较。 请点击这里查看此图的较大版本.
图8：每月冻干毒液提取量比较（2012-2022） 请点击这里查看此图的较大版本.
图9：每月提取的蝎子数量比较（2012-2022年）。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 年 | 冻干毒液 每只动物每月提取量 （mg） | 每月提取的动物数量 （x1.000） | 每月冻干毒液量（g） |
| 2012 | 0.025 ± 0.04 | 1.0 ± 0.3 | 0.26 ± 0.08 |
| 2013 | 0.026 ± 0.04 | 0.9 ± 0.2 | 0.24 ± 0.08 |
| 2014 | 0.029 ± 0.04 | 1.3 ± 0.2 | 0.39 ± 0.1 |
| 2015 | 0.026 ± 0.1 | 1.1 ± 0.4 | 0.38 ± 0.12 |
| 2016 | 0.027 ± 0.02 | 1.5 ± 0.6 | 0.4 ± 0.14 |
| 2017 | 0.027 ± 0.04 | 2.1 ± 0.4 | 0.6 ± 0.16 |
| 2018 | 0.026 ± 0.04 | 3.3 ± 0.8 | 0.9 ± 0.24 |
| 2019 | 0.026 ± 0.01 | 5.8 ± 1.4 | 1.5 ± 0.4 |
| 2020 | 0.03 ± 0.04 | 2.3 ± 1.5 | 0.76 ± 0.3 |
| 2021 | 0.03 ± 0.04 | 3.3 ± 1.1 | 1.07 ± 0.4 |
| 2022 | 0.03 ± 0.04 | 3.6 ± 1.4 | 1.1 ± 0.5 |
表1：生产指标比较（2012-2022年）。
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Discussion
所描述方法的应用使我们能够保留大量的 锯齿虫 个体，并使我们对每年毒液生产所需的蝎子数量具有一致的可预测性。这样，我们就能够提前提供足够批次的毒液来供应抗蛇毒血清的制造过程。同时，制定预先制定的维护、喂养和毒液提取时间表是活动的重要组成部分，并有助于遵守所述方案。因此，必须建立例程以保持连续生产。
据作者所知，没有科学描述的关于以毒液生产为目的的圈养蝎子的协议。因此，所描述方法的开发和应用旨在提供一种高效且成功的方案，以实现更高的产量，如本文所述。这里介绍的毒液提取方案与先前描述的其他方法不同，因为它的开发目的是由于需要获得大量毒液，因此最大限度地简化程序。因此，所提出的方法允许在短时间内提取大量动物，从而获得抗蛇毒血清生产所需的大量毒液。需要强调的是，在毒液提取过程中参与处理动物的技术人员都经过严格培训。
图表说明了 表 1 中提供的数据，显示从 2012 年到 2022 年，由于年份与每只动物提取的冻干毒液、每月提取的冻干毒液和每月提取的蝎子之间存在密切关系，因此所呈现的标记物呈线性增长。多年来，每只动物提取的冻干毒液略有增加，但从2016年起，每月提取的毒液量和提取的蝎子数量显着增加，反映了设施的物理改进以及SOP的开发和应用。由于 COVID 大流行，这两个生产指标在 2020 年都有所下降，但在第二年又恢复了增长。
应用上述方法实现的另一个基本目标是动物福利。这些协议的制定考虑了 T. serrulatus 生物学、该物种在圈养条件下的必需品以及毒液生产程序，这与自由生活时的需求不同 5,12。该方法的积极成果，除了成功地保持了大量动物的标准化方式，同时尊重了蝎子的福利和满足毒液生产的需求外，还体现在动物的长寿命上，其中许多动物在所述的圈养条件下在其生产生活中经历了五次以上的毒液提取程序。
无论使用何种方案，对参与蝎子饲养或毒液提取的技术人员进行持续培训对于减少由于圈养程序而对动物造成的压力，从而改善生产参数都极为重要。持续的培训对于减少在操纵蝎子期间涉及人员的潜在事故风险也至关重要。
这里描述的饲养方案是根据在有限空间内饲养大量 锯齿虫 个体的必要性而制定的，为此，该物种的生物学和生理学非常重要。除了所保留物种的特异性外，相同的协议可以复制到其他几个蝎属和物种，只需稍作调整。所使用的材料易于获取且价格低廉，因此在所述的大规模饲养中维护是可行的。关于毒液提取方案，所使用的电刺激器是专门设计的，可以被其他抗蛇毒血清制造实验室复制。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carboard sheet | NA | NA | |
| Egg tray | NA | NA | cardboard 36 places egg trays |
| Electro stimulator device | Instituto Butantan | ART-FV-01 | Internally designed for the venom extraction |
| Kraft paper | NA | NA | regular kraft paper |
| Making tape | NA | NA | White masking tape (24 mm x 50 m) |
| Polyproplene container | NA | NA | 70 L Polypropylene box (H – 35 cm, W – 35.5 cm, L - 72 cm) |
| Polyproplene tray | NA | NA | Polypropylene tray (H – 3.0 cm, W – 18.5 cm, L - 30 cm) |
| Self-adhesive plastic | NA | NA |
References
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