Summary
ここでは、ブラジルの医療システムの需要を満たすために、その後のサソリの抗毒素生産に毒を提供することを目的として、大規模な Tityus serrulatus Lutz and Mello(ブラジルの黄色いサソリ)の飼育に成功した維持および毒抽出プロトコルを紹介します。
Abstract
サソリの毒は、いくつかの熱帯および亜熱帯諸国で公衆衛生上の問題です。 Tityusのserrulatus Lutz and Mello, 1922 (ブラジルの黄色いサソリ) は、ブラジルで年間約 150,000 件の毒素感染例の原因であり、そのうち 10% は生命を脅かす毒の影響を逆転させるために抗毒素治療を必要としています。そのため、数千匹の T. serrulatus 個体が毒液抽出のために管理された飼育下で維持され、その後、サソリの抗毒素の全国供給の生産に使用されます。Instituto Butantan は、ブラジルの主要な抗毒素製造研究所であり、ブラジルの医療システムに約 70,000 バイアルのサソリ抗毒素を提供しています。したがって、畜産プロトコルと毒液抽出方法は、大規模で標準化された毒液生産を成功させるための重要なポイントです。この記事の目的は、 T. serrulatus の飼育プロトコルについて説明し、飼育ルーチンと毒液抽出手順を網羅し、適正製造基準に従い、動物福祉を確保することです。これらの慣行により、最大20,000頭の動物を飼育下で維持することができ、抗毒素製造の需要に応じて毎月3,000〜5,000匹のサソリを搾乳し、平均90%の確実な抽出を達成しています。
Introduction
サソリは、約2,621種からなるクモ目、サソリ目に属する節足動物です1,2。これらの動物は地理的範囲が広く、南極大陸1を除くすべての大陸に生息しています。サソリによって引き起こされる毒は、世界中で毎年何千人もの人々の罹患率または死亡を引き起こします3。2019年には、これらの動物によって引き起こされた事故は年間120万件以上、死亡者は3,500人以上と推定されています。ブラジルでは、症例数は指数関数的に増加しており、2017年以降、年間100,000件以上に達しています4,5,6。過去数十年間にブラジルで観察された無秩序な都市化は、環境悪化と気候変動に関連して、適切な下水処理とゴミの定期的な収集と処分なしに、T. serrulatusなどの侵略的なサソリの増殖の条件を提供し、人間との接触を増やし、その結果、有害な事故を引き起こしました4,7,8.ブラジルには約178種のサソリがいるが、医学的に重要な刺傷はTityus属によって引き起こされ、4種(T. serrulatus、T. bahiensis、T. stigmurus、T. obscurus)が医学的に懸念されており、Tityus serrulatusが最も重篤な症例と死亡の原因となっている7,9。
Instituto Butantan は、ブラジルの主要な抗毒素製造研究所であり、ブラジルの医療システムに約 70,000 バイアルのサソリ抗毒素を提供しています。簡単に言うと、抗毒素製造に関与するステップには、ウマへの毒由来抗原の接種、血漿中のリッチ抗体の収集と精製が含まれ、その結果、5 mLのサソリ抗毒素バイアルが得られます。各バイアルは、抗毒素mLあたり少なくとも1mgのサソリ毒を中和することができる。節足動物の生物体質は、サソリの抗毒素の原料を供給する責任がある産業センターの不可欠な部分です。
ブタンタン研究所の節足動物生物は、もともと節足動物研究所と名付けられ、1967年に設立されました。しかし、1995年になってようやく、研究所は毒節足動物専用の施設に移転しました10,11。当時、サソリは温度が制御されていない12 m2の部屋で飼育され、約13の囲いに分散され、それぞれが最大300匹の動物を収容していました10。年々毒液の需要が増加し、それに伴い動物の数を増やす必要が生じ、毒液抽出プロセスの改善に伴い、2016年に大きな変化が起こりました。研究所はブタンタン研究所の産業中心地に統合され、節足動物生物群と改名されました。さらに、2016年には、Bioteriumは新しい専用施設に移転しました。新しいサソリの部屋は24m2の面積をカバーし、図1に示すように、約48個のポリプロピレン製の囲いがあり、それぞれに最大300匹の動物が収容されています。その結果、合計10,000〜20,000個体が管理された飼育下で維持され、年間を通じて変動します。サソリは、厳格な飼育プロトコルの下で慎重に管理され、高い生産需要を満たし、動物の世話に関する優れた慣行と倫理基準を遵守しながら、その福祉を確保しています。毒液抽出のために、図2Aに示すように、2つのエアフローキャビネットを収容する特定の部屋が設計および建設されました。これらのキャビネットは、抽出手順中に技術者が毒粒子を吸い込むのを防ぐための安全対策として機能します。合成エプロンやFFP2マスクなどの個人用保護具(PPE)は、汚染を防ぎ、安全を確保するために、技術者に義務付けられています。
図1:節足動物生物群のサソリの部屋の全体像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:作業エリア 。 (A)節足動物生物群の毒液抽出室の全景。(B)気流のキャビネットの作業面。すべての材料と機器は準備され、エアフローキャビネットの作業面の上部に配置されます。黒矢印は電気刺激装置を示し、赤矢印は鉗子を示す。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
節足動物生物群に生息する T. serrulatus サソリの約90%は、これらの動物の監視・管理プログラムの一環として地方自治体の保健機関によって収集された、さまざまな場所に由来しています。サソリは都市部で捕獲され、共同プログラムの一環としてブタンタン研究所に送られます。 T. serrulatus scorpionsは単為生殖であり、異性の個体がいなくても、未受精卵からの子孫の発達の結果として誕生が起こることを意味する12。このタイプの繁殖により、一部の動物は私たちの施設で飼育下で生まれ、以下に説明するのと同様の飼育プロトコルに従って、成体期に達するまで維持されます。成虫の段階に達すると、毒の抽出ルーチンに追加されます。到着すると、サソリは最初のスクリーニングを受け、健康状態の良いサソリは、最大350個体を含む集団囲いに保管され、起源ごとに分けられます。各囲いについて、管理フォームに毎日記入し、給餌日と提供された獲物の種類(コオロギまたはゴキブリ)、給水、清掃手順、死んだ動物の数、および飼育室内に残っている生きている動物の数に関するデータを提供します。
事前にスケジュールされたアジェンダでは、動物に電気刺激を与え、その結果生じる数百人の毒液を凍結乾燥し、凍結乾燥毒液のバッチを作成します。このプロセスから得られた標準化された毒液は、製造プロセスの一部として馬の予防接種に使われるだけでなく、活性物質と最終製品の品質管理のための標準物質を提供します。
ブタンタン研究所の節足動物生物群で行われているように、これほど多くのサソリを飼育し、適正製造慣行と動物の倫理的使用に従って大量の毒液抽出を行うことができる施設は、世界でもほとんどありません。したがって、私たちの目的は、サソリの抗毒素の生産に必要な量の毒を首尾よく提供する 、T. serrulatus の飼育で使用されるサソリの維持プロトコルと毒抽出手順を説明することです。
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Protocol
無脊椎動物を含むプロトコルは、動物の使用とケアに関するInstituto Butantanの委員会の承認を免除されています。しかし、ここで述べるサソリの飼育は倫理的な基準に従い、動物福祉は種のニーズに応じて尊重される。
1. 住まい
- サソリは、最大350匹の動物を含む囲い(高さ35 cm、幅35.5 cm、長さ72 cm)として、共同のポリプロピレン容器に保管してください。
- 動物の囲いが収容されている部屋は、ライトが点灯した状態で24時間、ライトがオフの状態で14時間の光サイクルで、24°C(±0.5°C)の制御された温度に維持されます。
- 各容器の囲いの床(底部)をクラフト紙で裏打ちし、動物が紙の下に入り込まないように、四方の端をマスキングテープで固定します(図3A)。
- 4つの段ボールトレイ(卵トレイ)を垂直基板として使用し、容器の片側に積み重ね、各トレイの間に硬い段ボールシートを置きます(図3B、C)。
- 囲いの反対側に浅いポリプロピレントレイ(水トレイ)を置き、動物の水源として浸した綿を入れます(図3B)。
- 空気の流れを増やすために、容器に蓋をしないで保管してください。囲いの内面の上部と上部の角に約10cmの粘着性プラスチックテープのストリップを配置して、動物が容器から逃げないように壁を十分に滑らかにします(図3A)。
図3:筐体と筐体の準備。 (A)矢印は底面にクラフト紙を貼り、端をマスキングテープで固定した状態です。点線は、エンクロージャーの内面の上部に貼られた粘着性のプラスチックテープを示します。(B)縦の基板(容器の片側に積み上げられた卵トレイ)と反対側に置かれた浅いポリプロピレントレイ(水トレイ)。(C)垂直基板の詳細:2つのトレイの間に硬質の段ボールシートを挟んだ卵トレイ。(D)段ボールシートと卵トレイを層状に配置し、T. serrulatusの自然の暗くて湿った生息地をシミュレートします。 (E)基質に収容された動物。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
2.衛生習慣
注意: 衛生ルーチンは、完全メンテナンスと部分メンテナンスの2つのメンテナンス手順に分かれています。最初のものは、動物に餌をやった2日後、または囲いが毒抽出のために選択されたときに行われます。動物に餌を与えないときは、部分的なメンテナンスが行われます。
- メンテナンスの完了
- セクション1で説明したように、新しい基材(卵トレイ、段ボール、クラフト紙)ときれいな水トレイを備えた清潔なエンクロージャーを準備します。
- 長い鉗子を使用して、水トレイをエンクロージャーから取り外します。水トレイにサソリがいる場合は、それらを取り除き、清潔なエンクロージャーに入れます。
- すべての卵トレイと段ボールシートで手順2.1.2で説明したのと同じ手順を繰り返し、すべてのサソリを取り除き、清潔なエンクロージャーに入れます。
- トレイを取り外した後、エンクロージャーの床に残っているすべてのサソリを取り除き、きれいなエンクロージャーに入れます。死骸を考慮し、適切に廃棄してください。残りの生きている獲物(昆虫)をすべて集めて、囲いから取り除きます。
- エンクロージャーからすべての使い捨て基板(卵トレイ、段ボールシート、クラフト紙)を取り除き、適切に廃棄します。衛生のために再利用可能なアイテム(水トレイとポリプロピレン容器)を送ってください。
注:再利用可能なアイテムの衛生管理は、0.5%次亜塩素酸塩と中性洗剤を組み合わせて行われます。衛生製品または溶液を使用した後は、材料を流水で完全かつ豊富にすすぐことが義務付けられています。
- 部分的なメンテナンス
注意: 部分的なメンテナンスは、死んだサソリの死骸やその他の望ましくない破片を取り除くことを目的として、すべての基板(卵トレイとクラフト紙)を検査することで構成されますが、基板を廃棄したり、エンクロージャーを変更したりする必要はありません。- 長い鉗子を使用して検査を行い、各卵トレイをそっと持ち上げ、老廃物を取り除きます。
- 必要に応じて、1つ以上の卵トレイを清潔なものと交換します。
- 長い鉗子を使用して、水トレイを清潔なものと完全に交換します。ウォータートレイのサソリをエンクロージャーの別の部分にある卵トレイに移します。
3.給餌
- 毒の抽出スケジュールに従って、15日ごとに動物に餌を与えます。毒液抽出の7日前と7日後に搾乳される動物に餌を与えます。
- 給餌には、ゴキブリ(Phoetalia pallida)とコオロギ(Gryllus sp.)を交互に与えます。
- 動物のエネルギー摂取量に応じて食物の量を計算します。囲い内の3〜5匹のサソリごとに1匹の獲物を提供します。
- 計算された獲物の数を数え、それらを生きたまま囲いの中に置き、完全なメンテナンスの前に2日間放置します(セクション2.1)。
- ゴキブリを差し出すときは、炭酸カルシウムとアルコール溶液を囲いの上部に塗布します。この解決策により、ゴキブリが滑って囲いの側面を登ることができなくなり、昆虫が逃げるのを防ぎます。
4. 毒の抽出
注:毒抽出ルーチンで使用される動物は、成体または成体前です。ブラジルの黄色いサソリの完全な性成熟(成体期)を決定することは難しいため、体長が5〜7 cmの動物が手順の対象となると判断されました。
- 2〜3か月ごとに各動物を搾乳します。
- 毒液を採取する日に、囲いの中で生きている動物をすべて数え、長い鉗子を使ってガラス容器に移します(図4)。
- エアフローキャビネットの作業面の上部で使用するすべての材料と機器を準備して配置します。電気刺激装置の電源コードをコンセントに差し込み、電気刺激装置とエアフローキャビネットの電源を入れます(図2B)。
- 電位(電極間の電位差):540 mV、ストレス(電気パルスの持続時間):2 ms、アクション(テルソン有機組織の加熱を減少させる、使用される効力を緩和する間欠性):70%、サイクル(周期的な繰り返しを調整):1秒、および強度(動物の筋肉を循環する電流): 0.75ミリアンペア。
- 次の手順に従って、テルソンが静止するように各動物を手動で拘束します。
- 動物のメタソーマをまっすぐな鉗子で保持します(図5A)。
- 湾曲した鉗子でテルソンを固定します(図5B)。
- テルソンを手で拘束します(図5C、D)。
- 拘束後、導電性溶液を使用することなく、テルソンを電気刺激装置導体に直接接触させます。電気ショックは、毒腺の不随意の筋肉収縮を引き起こし、その結果、毒液が放出されます。
- 電気刺激装置の導体の近くに置かれたプラスチック製のマイクロチューブに毒液を直接集めます(図6)。
- 次に、次の手順に従って、動物をガラス容器に戻します。
- 動物のテルソンを手から湾曲した鉗子に移します。
- 動物をガラス容器の底にそっと置きます。
- 手順4.4〜4.7を、ガラスの受取人に入れた各動物で実行します。
- ガラスの受取人の中のすべての動物が搾乳されたら、それらを囲いに戻します。
- 採取した毒液は、凍結乾燥プロセスまで-20°Cで保存してください。
図4:ガラス容器の中のサソリ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:毒液抽出の抑制手順。 (A)まっすぐな鉗子で拘束されたメタソーマ(黒矢印)。(B)湾曲した鉗子で固定されたテルソン(黒矢印)。(C)鉗子から手への拘束されたテルソンの移行。(D) 手で拘束されたテルソン。手袋を使用すると、サソリが爪で材料をつかむ可能性があり、手順の最後にサソリを解放するのが難しくなり、事故のリスクが大幅に高まるため、動物を素手で扱うことをお勧めします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:毒の抽出。 電気刺激装置(黄色矢印)の近くに配置されたプラスチック製のマイクロチューブ(白い矢印)。毒液滴は、処置中、室温に保たれたチューブに直接集められます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
各手順に対して30の標準作業手順書(SOP)が作成され、技術者間での手順の再現性と品質パラメータへの準拠が保証されています。摘出術後の平均死亡率は約12%であり、電気刺激のルーチンと、処置を適用することでストレス要因がうまく減少する飼育環境を考慮すると、低いと考えられる。
動物の健康を保つために、箱の一方の端に綿と水で覆われたトレイが置かれ、反対側には段ボールシートと卵トレイが層状に配置され、 T. serrulatus の自然の暗くて湿った生息地をシミュレートします(図3D、E)。記載された基質は、限られた空間で多数の動物を維持し、十分な避難所と空間を提供し、したがってそれらの福祉を確保するのに有効であることが証明されている。
毎年、T. serrulatusの毒液の生産量は80グラムを超え、これは13グラム以上の凍結乾燥毒液に相当します。1頭当たりの平均搾乳量、頭数、月当たりの毒液量などの生産指標を、表1、図7、図8、図9に比較して収集しています。 3つのグラフは正の近似曲線を示しており、正のピアソン相関係数(それぞれR = 0.68;R = 0.84;およびR = 0.74)。抗毒素製造の需要に応じて毎月約3,000〜5,000匹のサソリが搾乳され、平均90%の正抽出が行われています。ほとんどの動物は、施設での生産生活中に5回以上の毒液抽出手順を受けており、これは動物の寿命、罹患率または毒腺の損傷の低さ、および死亡率の低さを反映しています。サソリから得られる毒の量は、より多く抽出されたサソリから得られる量は減少していますが、それでも生産的であると述べることが重要です。
図7:動物ごとに抽出された凍結乾燥毒液の月間比較(2012-2022)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:月ごとに抽出された凍結乾燥毒の比較(2012-2022) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:月ごとのサソリの抽出数の比較(2012-2022)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 年 | 凍結乾燥毒液 動物あたり抽出/月(mg) | 抽出された動物の数/月(x1.000) | 凍結乾燥毒液の月量(g) |
| 2012 | 0.025±0.04 | 1.0 ± 0.3 | 0.26 ± 0.08 |
| 2013 | 0.026±0.04 | 0.9±0.2 | 0.24±0.08 |
| 2014 | 0.029±0.04 | 1.3 ± 0.2 | 0.39 ± 0.1 |
| 2015 | 0.026 ± 0.1 | 1.1 ± 0.4 | 0.38 ± 0.12 |
| 2016 | 0.027±0.02 | 1.5 ± 0.6 | 0.4±0.14 |
| 2017 | 0.027±0.04 | 2.1 ± 0.4 | 0.6±0.16 |
| 2018 | 0.026±0.04 | 3.3 ± 0.8 | 0.9±0.24 |
| 2019 | 0.026±0.01 | 5.8 ± 1.4 | 1.5 ± 0.4 |
| 2020 | 0.03 ± 0.04 | 2.3 ± 1.5 | 0.76±0.3 |
| 2021 | 0.03 ± 0.04 | 3.3 ±1.1 | 1.07 ± 0.4 |
| 2022 | 0.03 ± 0.04 | 3.6 ± 1.4 | 1.1 ± 0.5 |
表1:生産指標の比較(2012-2022)。
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Discussion
記載された方法を適用することで、 T. serrulatus の個体を大量に飼育することができ、年間の毒の生産に必要なサソリの数を一貫して予測することができます。このようにして、抗毒素の製造プロセスに供給するのに十分な毒液のバッチを事前に提供することができます。同時に、メンテナンス、給餌、および毒液抽出のために事前に確立されたスケジュールの作成は、活動の重要な部分であり、説明されているプロトコルの遵守に役立ちます。したがって、継続的な生産を維持するためには、ルーチンの確立が必須です。
著者の知る限り、毒の生産を目的としたサソリの飼育飼育に関する科学的に記述されたプロトコルはありません。したがって、記載された方法の開発および適用は、本稿で提示されているように、生産数の増加を達成するための効率的で成功したプロトコルを提示することを目的としている。ここで紹介する毒液抽出のプロトコルは、大量の毒液を得る必要があるため、手順を可能な限り簡素化する目的で開発されたため、以前に説明した他の方法論とは異なります。したがって、提示された方法は、短期間に多数の動物を抽出することを可能にし、その結果、抗毒素生産に必要な相当量の毒液を得ることができる。特筆すべきは、毒液採取作業中に動物の取り扱いに携わる技術者が、厳しい訓練を受けていることです。
図は表1に示したデータを示しており、2012年から2022年にかけて、 1匹あたりの凍結乾燥毒液、月ごとの凍結乾燥毒液抽出量、サソリの月あたり抽出数との間に強い関係があるため、提示されたマーカーに直線的な増加があったことを示しています。1匹当たりの凍結乾燥毒液の抽出量は年々わずかに増加しているが、2016年以降、施設の物理的改善とSOPの開発・適用を反映して、月間毒液量とサソリの抽出数が顕著に増加した。2020年はコロナ禍で減少したが、翌年には増加に転じた。
記述された方法論の適用によって達成されたもう一つの重要な目的は、動物福祉でした。プロトコルは、T. serrulatusの生物学、飼育下での種の必需品、および自由生活時のニーズとは異なる毒液生産ルーチンを考慮して開発されました5,12。この方法論の肯定的な結果は、サソリの福祉を尊重し、毒液生産の需要を満たしながら、多数の動物の標準化された方法を維持することに成功したことに加えて、動物の長い寿命に示されており、その多くが、記述された飼育下での生産生活中に5回以上の毒抽出手順を経ます。
使用するプロトコルに関係なく、サソリの飼育または毒の抽出に関与する技術者の継続的なトレーニングは、飼育ルーチンによる動物へのストレスを軽減し、その結果、生産パラメータを改善するために非常に重要です。サソリの操作中に人員が関与する事故の潜在的なリスクを減らすためにも、絶え間ないトレーニングが不可欠です。
ここで紹介する飼育プロトコルは、限られた空間に多数の T. serrulatus 個体を飼育する必要性から開発されたものであり、そのためには、この種の生物学と生理学が非常に重要でした。保持されている種の特異性に加えて、同じプロトコルは、わずかな調整で、他のいくつかのサソリ属および種に対して複製することができます。使用される材料は簡単に入手でき、安価であるため、提示された大規模な畜産の場合にメンテナンスが実行可能です。毒液抽出プロトコルに関しては、使用された電気刺激装置は特別に設計されており、他の抗毒素製造研究所で複製可能である可能性があります。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
何一つ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carboard sheet | NA | NA | |
| Egg tray | NA | NA | cardboard 36 places egg trays |
| Electro stimulator device | Instituto Butantan | ART-FV-01 | Internally designed for the venom extraction |
| Kraft paper | NA | NA | regular kraft paper |
| Making tape | NA | NA | White masking tape (24 mm x 50 m) |
| Polyproplene container | NA | NA | 70 L Polypropylene box (H – 35 cm, W – 35.5 cm, L - 72 cm) |
| Polyproplene tray | NA | NA | Polypropylene tray (H – 3.0 cm, W – 18.5 cm, L - 30 cm) |
| Self-adhesive plastic | NA | NA |
References
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