Summary
Her præsenterer vi en optimeret protokol for cytokinesis-blokmikronukleusanalysen på kryopræserverede fuldblodsprøver. Denne optimerede metode til kryopræservering af fuldblod til mikronukleusanalyse er en pålidelig teknik til storskala prøveudtagning og multicenterundersøgelser og kan også bruges til andre blodrelaterede assays.
Abstract
In vitro cytokinesis-blok mikronucleus (CBMN) assay er en meget anvendt teknik i radiobiologisk forskning, biologisk dosimetri, genotoksicitetsundersøgelser og in vitro radiosensitivitetstest. Denne cytogenetiske metode er baseret på påvisning af mikrokerner i binucleerede celler som følge af kromosomale fragmenter, der hænger under celledeling. Friske fuldblodsprøver er den mest foretrukne prøvetype til CBMN-analysen. Ulemperne ved at arbejde med friske blodprøver omfatter imidlertid øjeblikkelig behandling efter blodindsamling og det begrænsede antal gentagne analyser, der kan udføres uden ekstra blodprøvetagning.
Da behovet for friske blodprøver kan være logistisk udfordrende, vil CBMN-analyse af kryopræserverede fuldblodsprøver være en stor fordel, især i store patientundersøgelser. Dette papir beskriver en protokol til frysning af fuldblodsprøver og til at udføre CBMN-analysen på disse frosne blodprøver. Blodprøver fra raske frivillige er blevet frosset og optøet på forskellige tidspunkter og derefter udsat for en modificeret mikronukleusanalyseprotokol. Resultaterne viser, at denne optimerede procedure gør det muligt at udføre CBMN-analysen på frosne blodprøver. Den beskrevne kryopræserveringsprotokol kan også være meget nyttig til andre cytogenetiske assays og en række funktionelle assays, der kræver prolifererende lymfocytter.
Introduction
Lige siden opdagelsen har brugen af ioniserende stråling (IR) været et spørgsmål om debat blandt forskere på grund af dets negative virkninger på levende væsener. Den skadelige virkning manifesteres normalt af DNA-skader såsom dobbeltstrengede brud (DSB'er), og manglende reparation af disse DSB'er fører til kromosomafvigelser og mutationer, som er vigtige kendetegn ved kræft 1,2. Sådanne kromosomafvigelser kan undersøges ved cytogene assays, såsom cytokinesis-blokmikronukleus-assayet (CBMN). Mikrokerner er forsinkede kromosomale fragmenter, der ikke kan inkorporeres i datterkerner og derfor efterlades under mitose.
CBMN er en almindeligt anvendt, pålidelig cytogenetisk teknik til vurdering af kromosomskader hos personer, der udsættes for in vivo eller in vitro ioniserende stråling. Enten frisk fuldblod eller isolerede mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) kan anvendes i CBMN-assayet. Frisk fuldblod er for det meste det biologiske materiale, der vælges, da isolering og behandling af PBMC'er kan være tidskrævende og ledsages af et tab af serumplasma, der fungerer som støttemedium for celleoverlevelse og vækst. For at opnå et godt binucleated celleudbytte skal frisk fuldblod behandles umiddelbart efter indsamling. Behovet for øjeblikkelig behandling kan dog være logistisk udfordrende under tidspres. Når mange prøver skal erhverves over en længere periode eller indsamles på steder væk fra behandlingscentrene, kan opbevaring af friske blodprøver desuden være en begrænsende faktor 3,4.
For at muliggøre gentagen MN-analyse hos samme individ/patient vil nedfrysning af blodprøver desuden være gavnlig. En måde at opbevare lymfocytter til senere anvendelse af CBMN-analysen er ved at fryse isolerede PBMC'er 5,6. Denne teknik kræver dog flere behandlingstrin, før PBMC'erne kan fryses. Kryopræservering af fuldblod vil derfor udgøre et enkelt og tidseffektivt alternativ til kryopræservering af isolerede PBMC'er. Der foreligger kun få oplysninger om anvendelsen af frosset fuldblod til cytogenetiske assays eller assays, der kræver proliferation af lymfocytter. Kun én artikel rapporterer om brugen af kryopræserveret fuldblod til metafaseanalyse7.
Da kryopræservering af fuldblod ville give mange fordele inden for bioovervågning, biodosimetri og radiosensitivitetsvurdering, optimerede vores gruppe en kryopræserveringsprotokol for fuldblod, der tillader anvendelse af CBMN-assay8. Vi påviste, at lymfocytter, der er til stede i kryopræserverede fuldblodskulturer, bevarer deres genomiske integritet og spredningskapacitet i mindst 1 år. I dette metodepapir beskriver vi detaljeret kryopræserveringsproceduren og CBMN-assayprotokollen, som blev optimeret af Beyls et al.8, og rapporterer fund opnået for frosne blodprøver på 30 raske individer. Til CBMN-analysen blev blodkulturerne bestrålet in vitro med doser på 0,5, 1 og 2 Gy for at vurdere MN-responset i lymfocytter af kryopræserverede fuldblodprøver.
Protocol
Til denne undersøgelse blev blodprøver indsamlet ved venipunktur fra 30 raske donorer i alderen 17 til 65 år. MN-data fra 20 donorer blev genbrugt fra Beyls et al.8 Indsamling af blodprøverne er i overensstemmelse med retningslinjerne fra den etiske komité på Gent Universitetshospital (registreringsnummer: 2019/1565), Belgien. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle deltagerne. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. Indsamling af blodprøver
- Før du starter, skal du sikre dig, at skriftligt informeret samtykke fra deltagerne er tilgængeligt, og etiske retningslinjer følges korrekt .
- Opsaml blod i Li-heparinrør og opbevar ved stuetemperatur, indtil det er klar til behandling til kryopræservering.
2. Kryopræservering af fuldblod
BEMÆRK: Alle trin indtil cellehøstning udføres aseptisk i steril laminær luftstrøm.
- For at kryopræservere 1 ml blod fremstilles 1 ml frysemedium ved at blande 800 μL føtalt kalveserum (FCS) og 200 μL dimethylsulfoxid (DMSO).
BEMÆRK: Frysemediet fremstilles i et volumen svarende til de blodprøver, der skal fryses. - Til kryopræservering af fuldblod overføres blodprøven fra det hepariniserede rør til 15 eller 50 ml centrifugerør
BEMÆRK: Rørets kapacitet afhænger af blodets volumen. - Vortex blodet ved lav hastighed med kontinuerlig, men dråbevis tilsætning af et lige så stort volumen frysemedium.
- Overfør 2 ml blodfryseblanding til kryoialer (2 ml), hvor hver prøve har 1 ml blodprøve blandet med 1 ml fryseblanding.
- Trinvis gradvis frysning
- Kryoer overføres til en kryobox, der indeholder isopropanol, og anbringes i fryser (-80 °C) natten over.
- Overfør cryovialerne til flydende nitrogen til langvarig brug.
3. Optøning af kryopræserveret blod
BEMÆRK: For at begrænse den samlede tid for optøningsprocessen må der maksimalt håndteres 8 kryoialer (2 ml hver) ad gangen.
- Præparation
- Forvarm 200 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) til 37 °C før optøning af blodet.
- Forbered en arbejdsløsning af det krævede dyrkningsmedium under sterile forhold. Sørg for, at medium pr. kultur indeholder 1,6 ml komplet medium: Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) medier suppleret med penicillin / streptomycin (0,5%), 0,2 ml FCS, 20 μL natriumpyruvat og 2 μL β-mercaptoethanol.
BEMÆRK: Da et betydeligt antal blodlegemer kan gå tabt under optøning, dyrkes det optøede blod i små brønde som 24-brøndplader med et samlet volumen på 2 ml. Der anvendes en multibrøndplade pr. dosis. - For hver dyrkningsbrønd angives donorkoden og A/B på låget sammen med dato og dosis som foreslået nedenfor (figur 1).
Figur 1: Foreslået layout af en 24-brønds plade til dyrkning af fuldblod til mikronukleusanalysen. Marker hullerne, og angiv donorkoderne på passende steder på låget. For hver patientprøve skal duplikatbrønde være ved siden af hinanden. Bemærk, at det er et suggestivt layout for en 10 x 10 kollimator og kan ændres i henhold til størrelsen på kollimatoren eller prøverne. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Trin til optøning og dyrkning af fuldblod
- Vandbadet opvarmes til 37 °C.
- Tag de nødvendige kryoialer ud af det flydende nitrogen (antallet afhænger af kravene såsom antallet af doser).
BEMÆRK: En kryovial indeholder 1 ml blod og 1 ml frysemedium. Derfor kan to kulturer oprettes med blod fra en kryovinal. - Optø kryoialerne delvist i varmtvandsbadet (indtil små iskrystaller stadig ses).
- Tag hætteglassene ud af vandbadet og rengør ydersiden af hætteglassene med sterilt tissuepapir.
- I en steril laminær luftstrømshætte skal hætteglassene åbnes meget langsomt for at forhindre, at luftbobler, der dannes inde i rørene, spildes ud.
- Resuspender indholdet af hvert hætteglas og overfør dem individuelt til et 15 ml konisk centrifugeglas (1 tube pr. hætteglas).
- Til de respektive rør tilsættes dråbevis 1 ml varm (37 °C) PBS, mens røret forsigtigt drejes. Resuspender med en P1000-pipette.
- Til fortynding og ensartet vask tilsættes dråbevis 7 ml forvarmet PBS (37 °C) og opslæmmes igen med en P1000-pipette.
- Blodet centrifugeres i 8 minutter ved 180 × g (med indstilling ved acceleration 1, bremse 1) ved stuetemperatur.
- Under dette ventetrin fyldes de tomme huller (bortset fra den, hvor cellerne skal dyrkes) med 500 μL PBS.
- Placer brøndpladerne tilbage i inkubatoren for at forvarme.
- Når centrifugeringen er afsluttet, fjernes supernatanten forsigtigt, og der efterlades ca. 1 ml for ikke at forstyrre cellepellet.
- Pellet i den resterende supernatant resuspenderes med en P1000-pipette.
- Der tilsættes dråbevis 8 ml varm PBS (37 °C) i de respektive reagensglas, mens rørene forsigtigt drejes rundt. Derefter opslæmmes med en P1000-pipette.
- Det resuspenderede blod centrifugeres i 8 minutter ved 180 × g (med indstilling ved acceleration 9, bremse 9).
- Under denne ventetid overføres 200 μL dyrkningsmedium til hver af de markerede huller.
- Opbevar pladerne tilbage i inkubatoren for at forblive ved 37 °C.
- Efter centrifugeringen fjernes supernatanten i kontinuerlig bevægelse (for at undgå at forstyrre den løse cellepellet), men der efterlades ca. 80 μl supernatant.
- Til pelleten tilsættes 280 μL FCS (stuetemperatur) og resuspenderes (til et samlet volumen på 360 μL).
- Der overføres 180 μL af cellesuspensionen til hvert hul og resuspenderes (= 0,5 ml "blod"/kultur). Det samlede volumen i hver brønd er nu 380 μL, hvilket resulterer i et 2 mm mellemlag.
- Pladerne inkuberes i en CO2 -inkubator ved 37 °C i mindst 10 minutter før bestråling.
4. G0 MN-analyse
- Tag pladerne ud af inkubatoren og bestråle cellekulturen med nødvendige doser såsom 0,5, 1 og 2 Gy røntgenstråler (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) ved stuetemperatur. Brug fingerbestrålede prøver som kontrol til at identificere spontane MN-udbytter.
- Umiddelbart efter bestrålingen tilsættes 1,62 ml næringssubstrat (37 °C) til hvert hul.
- For at stimulere celledeling i T-lymfocytter tilsættes 40 μL phytohemagglutinin (PHA) til hver brønd og resuspenderes grundigt.
- Disse plader anbringes tilbage i inkubatoren (5% CO2, 37 ° C).
BEMÆRK: Dette vil være starttidspunktet for analysen. - Bloker cytokinesen 23 timer efter stimulering ved at tilsætte 8 μL cytochalasin B (6 μg/ml) pr. hul og resuspender korrekt.
- Høst cellekulturerne 70 timer efter stimulering / kulturtid. Resuspender og overfør cellerne til et 15 ml rør. Skyl hvert hul med 2 ml PBS, og tilsæt denne PBS til det respektive 15 ml rør.
- Centrifuger glassene i 8 minutter ved 180 × g ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, men der lades ca. 500 μL over pelletten.
- Vortex pellet (ved fuld hastighed) og mens hvirvelstrømmen tilsættes langsomt dråbevis 2 ml koldt kaliumchlorid (KCl, 4 ° C).
- Centrifuger straks cellerne ved 180 × g i 8 min.
- Supernatanten kasseres, så ca. 500 μL af supernatanten er tilbage.
- Vortex pellet (ved fuld hastighed) og under hvirvelstrømmen tilsættes langsomt dråbevis 2 ml koldt fikseringsmiddel 1 (Methanol / eddikesyre / ringeopløsning i et forhold på 4: 1: 5).
- Prøveglassene efterlades natten over ved 4 °C (mindst 12 timer og højst 96 timer).
- Centrifuger i 8 min ved 180 × g.
- Supernatanten kasseres.
- Vortex pellet (ved fuld hastighed) og mens hvirvelstrømmen, tilsættes langsomt dråbevis 2 ml koldt fikseringsmiddel 2 (methanol / eddikesyre i et forhold på 4: 1).
- Centrifuger i 8 min ved 180 × g.
- Supernatanten kasseres.
- Vortex pellet (ved fuld hastighed) og tilsæt derefter langsomt (dråbevis), mens hvirvelstrøm, 2 ml koldt fikseringsmiddel 2 til pelleten.
- Lad prøveglassene stå ved 4 °C (mindst 12 timer og højst 96 timer).
- Rengør diasene med isopropanol og mærk dem ordentligt.
BEMÆRK: Brug trykte klistermærker til at mærke, da markørblæk let tørres af under behandling. - Prøveglassene centrifugeres i 8 minutter ved 180 × g.
- Supernatanten overføres til et andet glas for at koncentrere cellerne i overensstemmelse med pellets størrelse.
- Vortex pellet.
- Slip 40 μL af de faste celler på et tørt og rent dias.
- Lad diasene tørre ved stuetemperatur. Opbevar diasene i en kasse eller plet med det samme til observation.
5. Acridin orange (AO) farvning
- Dyp objektglassene i AO-pletten i 1 min, efterfulgt af en hurtig vask i det destillerede vand, og læg derefter objektglassene i fosfatbuffer (pH 6,8) i 1 min.
- Tag objektglassene ud af bufferopløsningen, og tør bagsiden af objektglassene med rent silkepapir, og læg objektglassene på et rent silkepapir.
- Slip 20 μL fosfatbufferen oven på objektglasset, og dæk den forsigtigt med en ren dæksel, så du undgår luftbobler.
- Forsegl disse dias med silikonecement.
BEMÆRK: Da AO er lysfølsom og falmer over tid, anbefales det at score diasene inden for 5 dage efter farvning for en flot kontrast og fluorescens. Opbevar altid rutsjebaner i et kølerum (4 °C), når de ikke undersøges.
6. Scoring farvede dias
- Placer dit dias under et fluorescensmikroskop og undersøg 1.000 binucleated celler (BN'er). Tæl manuelt MN'er, som er en af de seks biomarkører for toksicitet. For at gøre dette skal to uafhængige scorere undersøge 500 BN-celler / dias under samme forstørrelse.
BEMÆRK: Følgende er nogle højdepunkter i scoringskriterierne, som anbefalet af Fenech for at score de farvede dias9- Vælg en BN-celle ved at kigge efter pænt afrundede celler med intakt cytoplasma med to velmærkede kerner af omtrent samme størrelse, regelmæssig form og farvningsmønster. Sørg for, at cytoplasmaet i BN-cellen kan skelnes fra cytoplasmaet i den tilstødende celle.
- Scor en MN og bemærk, at den er morfologisk identisk med, men mindre end hovedkernerne; selv den største MN kan ikke være mere end 1/3 af diameteren af hovedkernerne. Scor kun en MN, hvis den ikke berører hovedkernerne, eller i det mindste kan den mikronukleare grænse skelnes fra grænsen for hovedkernerne.
Representative Results
For at validere protokollens reproducerbarhed udførte vi MN-analysen på kryopræserverede blodprøver fra 30 raske frivillige i alderen 17 til 65 år. Gruppens gennemsnitsalder er 35 år. Kryopræserveringstiden varierede fra 1 uge til 154 uger. Efter at have udsat hele blodcellekulturen for forskellige strålingsdoser (0,5, 1 og 2 Gy) blev mikrokerneudbyttet i 1.000 BN-celler undersøgt under et mikroskop. Pænt afrundede binucleerede celler (som det kan ses i figur 2) indikerer en vellykket hentning af sunde levedygtige celler fra kryopræserverede fuldblodsprøver. Det skal bemærkes, at lymfocytternes strålingsrespons forblev stabil efter langtidsopbevaring ved ultralave temperaturer (flydende nitrogen). Denne observation er i overensstemmelse med den forventede respons fra friske blodprøver.
Figur 2: Mikrokerner som observeret i binucleerede celler udtaget fra en frossen fuldblodsprøve, der blev kryopræserveret for 1 år siden. (a) forstørrelse 200x, (b) forstørrelse 400x; Pile, der peger på MN'erne. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Med øgede strålingsdoser (0,5, 1 og 2 Gy) blev der observeret en lineær-kvadratisk stigning i mikronukleusudbyttet (tabel 1 og figur 3). MN-udbyttet i fingerbestrålede kontrolprøver (0 Gy) repræsenterer de baggrunds-MN-udbytter, der hovedsagelig er resultatet af forsinkede kromosomer.
| Dosis (Gy) | 0 | 0.5 | 1 | 2 |
| Gennemsnitlig | 18 | 107 | 247 | 601 |
| SD | 10.8 | 23.9 | 53.3 | 101.1 |
| CV (%) | 59.9 | 22.3 | 21.6 | 16.8 |
| Interval | 5-41 | 62-140 | 139-324 | 395-755 |
Tabel 1: Interval og variationskoefficient sammen med gennemsnitlig MN-udbytte, som observeret i kryopræserverede fuldblodsprøver fra 30 raske donorer, hvilket indikerer interindividuel variabilitet. Forkortelser: CV = variationskoefficient; SD = standardafvigelse.
Figur 3: Mikronukleiudbytter som observeret i kontrolprøver og bestrålede kryopræserverede fuldblodsprøver fra 30 donorer. Kryopræserveringsperioderne varierede fra 1 uge til 154 uger. Punktplotgraf viser individuelle værdier. Linjer i klynger repræsenterer den gennemsnitlige ± SD for gruppen. Forkortelser: MN = mikrokerner; BN = binucleated. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at undersøge den interindividuelle variation i individers MN-udbytte blev variationskoefficienten (CV) beregnet ( se tabel 1). For strålingsinduceret MN blev der opnået et CV < 25% for alle doser (0,5, 1 og 2 Gy), hvilket indikerer god reproducerbarhed af den modificerede protokol.
Discussion
Den modificerede protokol til anvendelse af CBMN-analysen er en relativt nem og bekvem måde at opbevare blodprøver i løs vægt på. Proceduren skitserer alle de små, men vigtige detaljer, der skal tages hånd om under kryopræservering og CBMN-assayet. Andre laboratorieprotokoller bruger normalt 10% DMSO i fryseblandingen, mens vores fryseblanding indeholder 20% DMSO sammen med 80% FCS7. Da denne fryseblanding tilsættes i lige store mængder til hele blodprøven, er den endelige koncentration også 10% DMSO. For at forbedre celleoverlevelsesraten og stimulere celledeling tilføjer vi 1% natriumpyruvat og 0,1% beta-mercaptoethanol til det komplette dyrkningsmedium (cRPMI). Dette er i overensstemmelse med cellekulturprotokollen etableret af vores forskningsgruppe 6,8.
Selvom problemet med celleklumpning under optøning ikke kunne løses fuldstændigt i denne protokol, var celleadskillelse bedre end de andre konventionelle protokoller. I stedet for konsekvent, abrupt tilsætning af dyrkningsmedier for at genvinde celler efter optøning opnåede vi bedre resultater, når forvarmet PBS (37 °C) blev tilsat dråbevis under vasketrinnene. Denne forbedring hjælper med at reducere cellulær stress og minimerer klumpning med en dokumenteret høj genopretning af celler. Desuden kunne der ikke observeres nogen klar forskel i cellelevedygtighed, når PBS blev brugt over RPMI. Gruppen har valideret, at kryopræserveringsperiodens længde (op til 1 år) ikke vil påvirke MN-udbyttet, både i bestrålede og ikke-bestrålede prøver 6,8. Undersøgelser tyder på, at god cellelevedygtighed og spredning af PBMC'er kan opnås ved gradvis frysning ved lave temperaturer (flydende nitrogen) efterfulgt af gradvis tilsætning af forvarmet medium under optøning af10,11. Forskere har vist, at underpopulationerne af T-lymfocytter i optøet fuldblod er sammenlignelige med dem, der observeres i optøede PBMC'er12. Endvidere er det bevist, at celleundertyper genfundet fra kryopræserverede fuldblodsprøver svarer til dem, der observeres i friske fuldblodsprøver13,14.
Hvis vi undersøger de vejledende resultater opnået i rapporten, ser vi, at den lineære kvadratiske stigning med dosis (figur 3) er i overensstemmelse med andre litteraturrapporter om lineær energioverførsel (LET)-inducerede mikrokerner15,16. Variabiliteten i MN-udbytter observeret i de kryopræserverede fuldblodsprøver (tabel 1) ligger på linje med den, der er rapporteret for friske fuldblodsdyrkninger 8,17,18. Den protokol, der er beskrevet detaljeret her, blev valideret på frisk og kryopræserveret fuldblod fra 20 raske frivillige8. Det nukleare delingsindeks (NDI), som er en vigtig parameter for celleproliferation observeret i denne rapport8, var i overensstemmelse med det, der blev foreslået for frisk fuldblod19,20. Samlet set giver denne optimerede protokol for kryopræservering af fuldblod og modificeret mikronukleusanalyse et bedre celleudbytte, og derfor anbefales tilpasning af denne protokol til radiofølsomhedsvurderinger. Da protokollens reproducerbarhed allerede er valideret8, foreslås det at have anvendelighed i store og multicenterundersøgelser.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke L. Pieters, T. Thiron og G. De Smet for deres tekniske support. Vi er taknemmelige for alle de frivillige, der donerede blod til undersøgelsen. Arbejdet blev støttet økonomisk af Forskningsfonden Flandern (FWO) under tilskud (T000118N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
| 24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
| 96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
| Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
| Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
| CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
| cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
| Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
| Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
| Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
| Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
| Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
| GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
| KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
| KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
| Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
| Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
| Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
| NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
| Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
| Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
| Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
| RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
| Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
| Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
| β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |
References
- Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors. Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).
- Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. Radiation-induced cell death and its mechanisms. Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).
- Roederer, M., et al. The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis. Cell. 161 (2), 387-403 (2015).
- Bankoglu, E. E., et al. Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay. Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).
- Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method. Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).
- Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells. Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125 (2020).
- Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies. Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).
- Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood. International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).
- Fenech, M.
- Ramachandran, H., et al. Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies. Cells. 1 (3), 313-324 (2012).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).
- Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).
- Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).
- Braudeau, C., et al. An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).
- Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response. Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).
- Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure. Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).
- Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability. Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).
- Pajic, J., et al. Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays. Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).
- Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).
- Miszczyk, J., Rawojć, K. Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation. International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).
