Summary
在这里，我们提出了一种优化的方案，用于对冷冻保存的全血样品进行胞质分裂阻滞微核测定。这种用于微核分析的全血冷冻保存优化方法是大规模取样和多中心研究的可靠技术，也可用于其他血液相关检测。
Abstract
体外胞质分裂阻滞微核 （CBMN） 测定是一种广泛用于放射生物学研究、生物剂量学、遗传毒性研究和体外放射敏感性测试的技术。这种细胞遗传学方法基于检测双核细胞中的微核，这是由于细胞分裂过程中染色体片段滞后而产生的。新鲜全血样本是CBMN检测的首选样本类型。然而，使用新鲜血液样本的缺点包括采血后立即处理，以及无需额外血液采样即可进行的重复分析次数有限。
由于对新鲜血液样本的需求在后勤方面可能具有挑战性，因此对冷冻保存的全血样本进行CBMN检测将具有很大的优势，尤其是在大规模患者研究中。本文描述了一种冷冻全血样本并对这些冷冻血液样本进行CBMN测定的方案。来自健康志愿者的血液样本在不同的时间点被冷冻和解冻，然后接受修改后的微核测定方案。结果表明，这种优化的程序可以对冷冻血液样本进行CBMN测定。所描述的冷冻保存方案对于其他细胞遗传学测定和需要增殖淋巴细胞的各种功能测定也非常有用。
Introduction
自发现以来，电离辐射 （IR） 的使用一直是研究人员争论的问题，因为它对生物有不利影响。有害影响通常表现为 DNA 损伤，例如双链断裂 （DSB），并且无法修复这些 DSB 会导致染色体畸变和突变，这是癌症的重要标志 1,2。这种染色体畸变可以通过细胞源性测定来检查，例如胞质分裂阻滞微核 （CBMN） 测定。微核是滞后的染色体片段，不能合并到子核中，因此在有丝分裂过程中会留下。
CBMN 是一种常用的可靠细胞遗传学技术，用于评估暴露于体内或体外电离辐射的个体的染色体损伤。新鲜全血或分离的外周血单核细胞 （PBMC） 可用于 CBMN 检测。新鲜全血主要是首选的生物材料，因为PBMC的分离和处理可能非常耗时，并且伴随着作为细胞存活和生长支持介质的血清血浆的损失。为了获得良好的双核细胞产量，应在采集后立即处理新鲜全血。然而，在时间限制下，立即处理的需要可能在物流上具有挑战性。此外，当许多样本应该在很长一段时间内采集或在远离处理中心的地点采集时，新鲜血液样本的储存可能是一个限制因素3,4。
此外，为了允许在同一个体/患者中重复进行 MN 分析，冷冻血液样本将是有益的。储存淋巴细胞以供以后应用CBMN测定的一种方法是冷冻分离的PBMC 5,6。然而，这种技术在冻结PBMC之前需要几个处理步骤。因此，全血的冷冻保存将是分离的PBMC冷冻保存的一种简单且省时的替代方案。 关于使用冷冻全血进行细胞遗传学检测或需要淋巴细胞增殖的检测的信息很少。只有一篇论文报道了使用冷冻保存的全血进行中期分析7.
由于全血的冷冻保存在生物监测、生物剂量学和放射敏感性评估领域具有许多优势，因此我们小组优化了全血冷冻保存方案，允许应用CBMN 测定 8。我们证明，冷冻保存的全血培养物中存在的淋巴细胞保持其基因组完整性和增殖能力至少 1 年。在本文中，我们详细描述了由 Beyls 等人 8 优化的冷冻保存程序和 CBMN 测定方案，并报告了对 30 名健康个体的冷冻血液样本获得的结果。对于CBMN测定，在 体外 用0.5、1和2 Gy的剂量照射血培养物，以评估冷冻保存的全血样本淋巴细胞中的MN反应。
Protocol
在这项研究中，通过静脉穿刺收集了 30 名年龄在 17 至 65 岁之间的健康供体的血样。来自 20 名捐献者的 MN 数据从 Beyls 等人的论文中重复使用8 血液 样本的收集符合比利时根特大学医院伦理委员会（注册号：2019/1565）的指南。已获得所有参与者的书面知情同意书。有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息 ，请参阅材料表 。
1. 采集血样
- 在开始之前，确保参与者的书面知情同意书可用，并正确遵守道德准则。
- 将血液收集到Li-肝素管中并在室温下储存，直到准备好进行冷冻保存。
2. 全血的冷冻保存
注意：细胞收获之前的所有步骤都在无菌层流气流中无菌进行。
- 要冷冻保存 1 mL 血液，通过混合 800 μL 胎牛血清 （FCS） 和 200 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 制备 1 mL 冷冻培养基。
注意：冷冻培养基的制备体积等于需要冷冻的血液样本。 - 对于全血的冷冻保存，将血液样本从肝素管转移到 15 或 50 mL 离心管中
注意：管子的容量取决于血液的体积。 - 以低速涡旋血液，连续但 滴加 等体积的冷冻培养基。
- 将 2 mL 血液冷冻混合物转移到冷冻管 （2 mL） 中，其中每个等分试样有 1 mL 血液样本与 1 mL 冷冻混合物混合。
- 逐步逐步冻结
- 将冷冻管转移到含有异丙醇的冷冻箱中，并放入冰箱（-80°C）过夜。
- 将冷冻管转移到液氮中长期使用。
3. 冷冻保存的血液解冻
注意：为了限制解冻过程的总时间，一次最多应处理 8 个冻存管（每个 2 mL）。
- 制备
- 在解冻血液之前，将200 mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）预热至37°C。
- 在无菌条件下制备所需培养基的工作溶液。确保每次培养的培养基含有 1.6 mL 完全培养基：补充有青霉素/链霉素 （0.5%）、0.2 mL FCS、20 μL 丙酮酸钠和 2 μL β-巯基乙醇的罗斯韦尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基。
注意：由于解冻时可能会丢失大量血细胞，因此解冻的血液在总体积为 2 mL 的 24 孔板等小孔中培养。每剂使用一个多孔板。 - 对于每个培养孔，在盖子上注明供体代码和A / B以及日期和剂量，如下所示（图1）。
图 1：用于培养用于微核测定的全血的 24 孔板的建议布局。 标记孔并在盖子上的适当位置标明供体代码。对于每个患者样本，重复的孔应彼此相邻。请注意，它是 10 x 10 准直器的建议布局，可以根据准直器或样品的大小进行更改。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 解冻和培养全血的步骤
- 将水浴加热至37°C。
- 从液氮中取出所需的冷冻管（数量取决于剂量等要求）。
注意：一个冷冻管含有 1 mL 血液和 1 mL 冷冻培养基。因此，可以用来自一个冷冻卵管的血液建立两个培养物。 - 在温水浴中部分解冻冷冻管（直到仍然看到小冰晶）。
- 从水浴中取出小瓶，并用无菌纸巾清洁小瓶的外部。
- 在无菌层流罩中，非常缓慢地打开小瓶，以防止管内形成的气泡溢出。
- 重悬每个小瓶的内容物，并将它们单独转移到 15 mL 锥形离心管（每小瓶 1 管）中。
- 向相应的试管中滴加 1 mL 温热 （37 °C） PBS，同时轻轻旋转试管。用 P1000 移液器重悬。
- 为了稀释和均匀洗涤，滴加7 mL预热的PBS（37°C），并用P1000移液管重悬。
- 在室温下以180× g （设置为 加速1，制动1）离心血液8分钟。
- 在此等待步骤中，用 500 μL PBS 填充空孔（将要培养细胞的孔除外）。
- 将孔板放回培养箱中预热。
- 离心完成后，小心地除去上清液，留下约1 mL，以避免干扰细胞沉淀。
- 用P1000移液管将沉淀重悬于剩余的上清液中。
- 将8mL温热的PBS（37°C）滴加到相应的试管中，同时轻轻旋转试管。然后，用P1000移液器重悬。
- 将重悬的血液以180× g 离心8分钟（ 设置为加速度9，制动9）。
- 在此等待步骤中，将 200 μL 培养基转移到每个标记的孔中。
- 将板放回培养箱中以保持37°C。
- 离心后，以连续运动除去上清液（以避免干扰松散的细胞沉淀），但留下约80μL的上清液。
- 向沉淀中加入 280 μL FCS（室温）并重悬（总体积为 360 μL）。
- 将 180 μL 细胞悬液转移到每个孔中并重悬（= 0.5 mL “血液”/培养物）。现在，每个孔中的总体积为 380 μL，形成 2 mm 的培养基层。
- 在辐照前，将板在37°C的CO2 培养箱中孵育至少10分钟。
4. G0 MN测定
- 从培养箱中取出培养板，并在室温下用所需剂量（例如 0.5、1 和 2 Gy X 射线（220 kV、13 mA、0.15 mm Cu）照射细胞培养物。使用假辐照样品作为对照来鉴定自发的 MN 产量。
- 辐照后，立即向每个孔中加入1.62mL培养基（37°C）。
- 为了刺激 T 淋巴细胞中的细胞分裂，向每个孔中加入 40 μL 植物血凝素 （PHA） 并彻底重悬。
- 将这些板放回培养箱（5%CO 2,37°C）。
注意：这将是测定的 开始时间 。 - 通过每孔加入 8 μL 细胞松弛素 B （6 μg/mL） 在刺激后 23 小时阻断胞质分裂并适当重悬。
- 在刺激/培养时间后70小时收获细胞培养物。将细胞重悬并转移到 15 mL 试管中。用 2 mL PBS 冲洗每个孔，并将该 PBS 加入相应的 15 mL 试管中。
- 在室温下以180× g离心管8分钟。
- 弃去上清液，但在沉淀上留下约500μL。
- 涡旋沉淀（全速），在涡旋的同时，缓慢滴加2mL冷氯化钾（KCl，4°C）。
- 立即将细胞以180× g 离心8分钟。
- 弃去上清液，留下约500μL上清液。
- 涡旋沉淀（全速），在涡旋的同时，缓慢滴加 2 mL 冷 固定剂 1 （甲醇/乙酸/林格溶液，比例为 4：1：5）。
- 将样品管在4°C下过夜（最短12小时，最多96小时）。
- 以180× g离心8分钟。
- 弃去上清液。
- 涡旋沉淀（全速），在涡旋的同时，缓慢滴加2mL冷 固定剂2 （甲醇/乙酸，比例为4：1）。
- 以180× g离心8分钟。
- 弃去上清液。
- 涡旋沉淀（全速），然后在涡旋的同时缓慢（滴加）2 mL 冷 固定剂 2 到沉淀中。
- 将样品管保持在4°C（最短12小时和最多96小时）。
- 用异丙醇清洁载玻片并正确标记它们。
注意： 使用打印的贴纸贴标签，因为记号笔墨水在加工时很容易擦掉。 - 将样品管以180× g离心8分钟。
- 将上清液转移到另一个管中，以根据沉淀的大小浓缩细胞。
- 涡旋颗粒。
- 将 40 μL 固定细胞滴入干燥干净的载玻片上。
- 让载玻片在室温下干燥。立即将载玻片存放在盒子或染色剂中以供观察。
5.吖啶橙（AO）染色
- 将载玻片浸入AO染色剂中1分钟，然后在蒸馏水中快速洗涤，然后将载玻片置于磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中1分钟。
- 从缓冲溶液中取出载玻片，并用干净的薄纸，擦干载玻片的背面，然后将载玻片放在干净的薄纸上。
- 将 20 μL 磷酸盐缓冲液滴在载玻片顶部，并用干净的盖玻片轻轻盖住，避免气泡。
- 用硅胶粘合剂密封这些载玻片。
注意：由于 AO 对光敏感并且会随着时间的推移而褪色，因此为了获得良好的对比度和荧光，建议在染色后 5 天内对载玻片进行评分。未检查时，始终将载玻片存放在冷藏室（4°C）中。
6. 对染色载玻片进行评分
- 将载玻片置于荧光显微镜下，检查 1,000 个双核细胞 （BN）。手动计算 MN，MN 是毒性的六种生物标志物之一。为此，请让两名独立的评分员在相同的放大倍率下检查 500 个 BN 细胞/载玻片。
注：以下是 Fenech 推荐的评分标准的一些亮点，用于对染色载玻片9 进行评分- 通过寻找具有完整细胞质的圆形细胞来选择 BN 细胞，这些细胞具有两个大小大致相同、形状规则和染色模式的明显区分的细胞核。确保BN细胞的细胞质与相邻细胞的细胞质可区分。
- 对 MN 进行评分，注意它在形态上与主核相同但小于主核;即使是最大的MN也不能超过主核直径的1/3。只有当MN不接触主核或至少微核边界与主核边界可区分时，才对MN进行评分。
Representative Results
为了验证方案的可重复性，我们对 30 名年龄在 17 至 65 岁之间的健康志愿者的冷冻保存血液样本进行了 MN 测定。该组的平均年龄为35岁。冷冻保存时间从1周到154周不等。将全血细胞培养物暴露于不同辐射剂量（0.5、1 和 2 Gy）后，在显微镜下检查 1,000 BN 细胞中的微核产量。圆润的双核细胞（如 图2所示）表明已成功从冷冻保存的全血样本中提取出健康的活细胞。值得注意的是，在超低温（液氮）下长期储存后，淋巴细胞的辐射反应保持稳定。这一观察结果与新鲜血液样本的预期反应一致。
图 2：从 1 年前冷冻保存的冷冻全血样本中提取的双核细胞中观察到的微核。 （A） 放大倍数 200 倍， （B） 放大倍数 400 倍;指向MN的箭头。 比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
随着辐射剂量（0.5、1和2 Gy）的增加，观察到微核产量呈线性二次增加（表1 和 图3）。假辐照对照样品中的MN产量（0 Gy）代表了背景MN产量，主要是滞后染色体的结果。
| 剂量 （Gy） | 0 | 0.5 | 1 | 2 |
| 平均 | 18 | 107 | 247 | 601 |
| 标清 | 10.8 | 23.9 | 53.3 | 101.1 |
| 简历 （%） | 59.9 | 22.3 | 21.6 | 16.8 |
| 范围 | 5-41 | 62-140 | 139-324 | 395-755 |
表 1：在 30 名健康供体的冷冻保存全血样本中观察到的变异范围和系数以及平均 MN 产量，表明个体间的变异性。 缩写：CV = 变异系数;SD = 标准偏差。
图 3：在 30 名供体的对照组和辐照冷冻保存的全血样本中观察到的微核产量。 冷冻保存期从 1 周到 154 周不等。散点图显示单个值。聚类中的线表示组的平均值±标准差。缩写：MN = 微核;BN = 双核。 请点击这里查看此图的较大版本.
为了研究人MN产量的个体间变异，计算了变异系数（CV）（见 表1）。对于辐射诱导的 MN，所有剂量（0.5、1 和 2 Gy）的 CV < 均为 25%，这表明修改后的方案具有良好的可重复性。
Discussion
CBMN测定应用的改进方案是一种相对简单方便的散装储存血液样本的方法。该程序概述了在冷冻保存和 CBMN 检测过程中需要注意的所有微小但重要的细节。其他实验室方案通常在冷冻混合物中使用 10% DMSO，而我们的冷冻混合物含有 20% DMSO 和 80% FCS7。由于这种冷冻混合物以等体积添加到全血样品中，因此最终浓度也是 10% DMSO。为了提高细胞存活率并刺激细胞分裂，我们在完全培养基 （cRPMI） 中加入 1% 丙酮酸钠和 0.1% β-巯基乙醇。这符合我们研究小组 6,8 建立的细胞培养方案。
尽管在该方案中无法完全解决解冻时细胞聚集的问题，但细胞分离优于其他常规方案。在洗涤步骤中滴加预热的PBS（37°C）时，我们获得了更好的结果，而不是一致，突然添加培养基来恢复解冻后的细胞。这种改进有助于减少细胞应激，并最大限度地减少结块，并证明细胞回收率高。此外，当PBS与RPMI相比，在细胞活力方面没有观察到明显差异。该小组已经证实，冷冻保存期的长度（长达 1 年）不会影响辐照和非辐照样品的 MN 产率 6,8。研究表明，在低温（液氮）下逐渐冷冻，然后在解冻时逐渐添加预热培养基，可以实现良好的细胞活力和 PBMC 的增殖10,11。研究人员已经表明，解冻的全血中 T 淋巴细胞的亚群与解冻的 PBMC 中观察到的亚群相当12.此外，已证明从冷冻保存的全血样本中回收的细胞亚型与在新鲜全血样本中观察到的细胞亚型相似13,14。
如果我们检查报告中获得的指示性结果，我们会看到随剂量的线性二次增加（图3）与其他关于线性能量转移（LET）诱导的微核的文献报道一致15,16。在冷冻保存的全血样品中观察到的MN产量的变异性（表1）与新鲜全血培养物报告的变异性8,17,18相同。此处详细描述的方案已在 20 名健康志愿者的新鲜和冷冻保存的全血上进行了验证8.核分裂指数 （NDI） 是该报告8 中观察到的细胞增殖的重要参数，与建议的新鲜全血19,20 一致。综上所述，这种优化的全血冷冻保存方案和改良的微核测定提供了更好的细胞产量，因此，建议将该方案用于放射敏感性评估。由于该协议的可重复性已经得到验证8，因此建议在大规模和多中心研究中具有适用性。
Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者感谢 L. Pieters、T. Thiron 和 G. De Smet 的技术支持。我们感谢所有为这项研究献血的志愿者。这项工作得到了格兰特（T000118N）下佛兰德斯研究基金会（FWO）的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
| 24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
| 96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
| Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
| Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
| CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
| cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
| Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
| Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
| Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
| Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
| Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
| GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
| KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
| KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
| Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
| Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
| Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
| NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
| Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
| Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
| Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
| RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
| Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
| Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
| β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |
References
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