Summary
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor de cytokinese-blok-micronucleustest op gecryopreserveerde volbloedmonsters. Deze geoptimaliseerde methode voor cryopreservatie van volbloed voor micronucleusanalyse is een betrouwbare techniek voor grootschalige bemonstering en multicenter studies en kan ook worden gebruikt voor andere bloedgerelateerde tests.
Abstract
De in vitro cytokinese-block micronucleus (CBMN)-test is een veelgebruikte techniek in radiobiologisch onderzoek, biologische dosimetrie, genotoxiciteitsstudies en in vitro radiosensitiviteitstesten. Deze cytogenetische methode is gebaseerd op de detectie van micronuclei in tweekernige cellen die het gevolg zijn van chromosomale fragmenten die achterblijven tijdens de celdeling. Verse volbloedmonsters zijn het meest geprefereerde monstertype voor de CBMN-test. De nadelen van het werken met verse bloedmonsters zijn echter de onmiddellijke verwerking na bloedafname en het beperkte aantal herhaalde analyses dat kan worden uitgevoerd zonder extra bloedafname.
Aangezien de behoefte aan verse bloedmonsters logistiek uitdagend kan zijn, zou CBMN-test op ingevroren volbloedmonsters van groot voordeel zijn, vooral in grootschalige patiëntenstudies. Dit artikel beschrijft een protocol om volbloedmonsters in te vriezen en de CBMN-test uit te voeren op deze ingevroren bloedmonsters. Bloedmonsters van gezonde vrijwilligers zijn op verschillende tijdstippen ingevroren en ontdooid en vervolgens onderworpen aan een aangepast micronucleustestprotocol. De resultaten tonen aan dat deze geoptimaliseerde procedure de uitvoering van de CBMN-test op ingevroren bloedmonsters mogelijk maakt. Het beschreven cryopreservatieprotocol kan ook zeer nuttig zijn voor andere cytogenetische tests en een verscheidenheid aan functionele tests waarvoor prolifererende lymfocyten nodig zijn.
Introduction
Sinds de ontdekking is het gebruik van ioniserende straling (IR) een punt van discussie geweest onder onderzoekers vanwege de nadelige effecten op levende wezens. Het schadelijke effect manifesteert zich meestal door DNA-schade zoals dubbelstrengs breuken (DSB's), en het niet repareren van deze DSB's leidt tot chromosomale afwijkingen en mutaties, die belangrijke kenmerken zijn van kanker 1,2. Dergelijke chromosomale afwijkingen kunnen worden onderzocht door middel van cytogene tests zoals de cytokinese-block micronucleus (CBMN)-test. Micronuclei zijn achterblijvende chromosomale fragmenten die niet in dochterkernen kunnen worden opgenomen en daarom tijdens mitose achterblijven.
CBMN is een veelgebruikte, betrouwbare cytogenetische techniek om chromosomale schade te beoordelen bij personen die zijn blootgesteld aan in vivo of in vitro ioniserende straling. Zowel vers volbloed als geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) kunnen worden gebruikt in de CBMN-test. Vers volbloed is meestal het biologische materiaal bij uitstek, aangezien de isolatie en verwerking van PBMC's tijdrovend kan zijn en gepaard gaat met een verlies van serumplasma dat fungeert als het ondersteunende medium voor celoverleving en groei. Om een goede opbrengst aan tweekernige cellen te bereiken, moet vers volbloed onmiddellijk na afname worden verwerkt. De noodzaak van onmiddellijke verwerking kan echter een logistieke uitdaging zijn onder tijdsdruk. Bovendien, wanneer veel monsters over een langere periode moeten worden verkregen of op punten buiten de verwerkingscentra moeten worden verzameld, kan de opslag van verse bloedmonsters een beperkende factor 3,4 zijn.
Verder, om herhaalde MN-analyse bij dezelfde persoon/patiënt mogelijk te maken, zou het bevriezen van bloedmonsters gunstig zijn. Een manier om lymfocyten op te slaan voor latere toepassing van de CBMN-test is door geïsoleerde PBMC's 5,6 in te vriezen. Deze techniek vereist echter verschillende verwerkingsstappen voordat de PBMC's kunnen worden ingevroren. Daarom zou cryopreservatie van volbloed een eenvoudig en tijdbesparend alternatief zijn voor de cryopreservatie van geïsoleerde PBMC's. Er is weinig informatie beschikbaar over het gebruik van ingevroren volbloed voor cytogenetische tests of tests die de proliferatie van lymfocyten vereisen. Slechts één artikel maakt melding van het gebruik van gecryopreserveerd volbloed voor metafase-analyse7.
Omdat cryopreservatie van volbloed veel voordelen zou bieden op het gebied van biomonitoring, biodosimetrie en stralingsgevoeligheidsbeoordeling, heeft onze groep een cryopreservatieprotocol voor volbloed geoptimaliseerd dat de toepassing van de CBMN-test8 mogelijk maakt. We hebben aangetoond dat lymfocyten die aanwezig zijn in gecryopreserveerde volbloedculturen hun genomische integriteit en proliferatiecapaciteit gedurende ten minste 1 jaar behouden. In dit methodedocument beschrijven we in detail de cryopreservatieprocedure en het CBMN-testprotocol, dat is geoptimaliseerd door Beyls et al.8, en rapporteren we bevindingen die zijn verkregen voor ingevroren bloedmonsters van 30 gezonde personen. Voor de CBMN-test werden de bloedkweken in vitro bestraald met doses van 0,5, 1 en 2 Gy om de MN-respons in lymfocyten van gecryopreserveerde volbloedmonsters te beoordelen.
Protocol
Voor dit onderzoek werden bloedmonsters verzameld door middel van venapunctie van 30 gezonde donoren tussen 17 en 65 jaar. MN-gegevens van 20 donoren werden hergebruikt uit het artikel van Beyls et al.8 De afname van de bloedstalen gebeurt volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie van het Universitair Ziekenhuis Gent (registratienummer:2019/1565), België. Van alle deelnemers werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. Afname van bloedmonsters
- Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat schriftelijke geïnformeerde toestemming van de deelnemers beschikbaar is en dat ethische richtlijnen correct worden gevolgd.
- Verzamel bloed in Li-Heparine-buisjes en bewaar het bij kamertemperatuur totdat het klaar is voor verwerking voor cryopreservatie.
2. Cryopreservatie van volbloed
OPMERKING: Alle stappen tot het oogsten van cellen worden aseptisch uitgevoerd in een steriele laminaire luchtstroom.
- Om 1 ml bloed te cryopreservatie, maakt u 1 ml vriesmedium door 800 μL foetaal kalfsserum (FCS) en 200 μl dimethylsulfoxide (DMSO) te mengen.
OPMERKING: Het vriesmedium wordt bereid in een volume dat gelijk is aan de bloedmonsters die moeten worden ingevroren. - Voor cryopreservatie van volbloed brengt u het bloedmonster over van de gehepariniseerde buis naar centrifugebuisjes van 15 of 50 ml
OPMERKING: De capaciteit van het buisje is afhankelijk van het volume van het bloed. - Draai het bloed met lage snelheid met continue maar druppelsgewijze toevoeging van een gelijk volume vriesmedium.
- Breng 2 ml bloedbevriezingsmengsel over in cryovials (2 ml) waarbij elk aliquot 1 ml bloedmonster gemengd met 1 ml vriesmengsel bevat.
- Stapsgewijs geleidelijk invriezen
- Breng cryovials over in een cryobox met isopropanol en zet ze een nacht in de vriezer (-80 °C).
- Breng de cryovials over in vloeibare stikstof voor langdurig gebruik.
3. Ontdooien van gecryopreserveerd bloed
NOTITIE: Om de totale tijd van het ontdooiproces te beperken, mogen maximaal 8 cryovials (elk 2 ml) tegelijk worden gehanteerd.
- Voorbereiding
- Verwarm 200 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor tot 37 °C voordat het bloed wordt ontdooid.
- Bereid een werkoplossing van het benodigde kweekmedium onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat het medium per cultuur 1,6 ml compleet medium bevat: media van het Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) aangevuld met penicilline/streptomycine (0,5%), 0,2 ml FCS, 20 μl natriumpyruvaat en 2 μl β-mercaptoethanol.
OPMERKING: Aangezien een aanzienlijk aantal bloedcellen verloren kan gaan tijdens het ontdooien, wordt het ontdooide bloed gekweekt in kleine putjes zoals platen met 24 putjes met een totaal volume van 2 ml. Per dosis wordt één plaat met meerdere putjes gebruikt. - Vermeld voor elk kweekputje de donorcode en A/B op het deksel, samen met de datum en de dosis, zoals hieronder voorgesteld (figuur 1).
Figuur 1: Voorgestelde lay-out van een plaat met 24 putjes om volbloed te kweken voor de micronucleustest. Markeer de putjes en vermeld de donorcodes op de juiste plaatsen op het deksel. Voor elk patiëntmonster moeten dubbele putjes naast elkaar liggen. Merk op dat het een suggestieve lay-out is voor een collimator van 10 x 10 en kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van de collimator of monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Stappen voor het ontdooien en kweken van volbloed
- Verwarm het waterbad tot 37 °C.
- Haal de benodigde cryovials uit de vloeibare stikstof (het aantal is afhankelijk van de vereisten zoals het aantal doses).
OPMERKING: Een cryovial bevat 1 ml bloed en 1 ml vriesmedium. Daarom kunnen twee culturen worden opgezet met bloed uit één cryovial. - Ontdooi de cryovials gedeeltelijk in het warmwaterbad (totdat er nog kleine ijskristallen te zien zijn).
- Haal de injectieflacons uit het waterbad en reinig de buitenkant van de flacons met steriel tissuepapier.
- Open in een steriele laminaire luchtstroomkap de injectieflacons zeer langzaam om te voorkomen dat er luchtbellen in de buizen naar buiten lopen.
- Resuspendeer de inhoud van elke injectieflacon en breng deze afzonderlijk over in een conische centrifugebuis van 15 ml (1 buis per injectieflacon).
- Voeg druppelsgewijs 1 ml warme (37 °C) PBS toe aan de respectievelijke buisjes terwijl u de buis voorzichtig ronddraait. Resuspendeer met een P1000-pipet.
- Voeg voor verdunning en gelijkmatig wassen druppelsgewijs 7 ml voorverwarmde PBS (37 °C) toe en resuspendeer met een P1000-pipet.
- Centrifugeer het bloed gedurende 8 minuten bij 180 × g (met instelling bij versnelling 1, rem 1) bij kamertemperatuur.
- Vul tijdens deze wachtstap de lege putjes (behalve die waar de cellen worden gekweekt) met 500 μL PBS.
- Plaats de putplaten terug in de incubator om voor te verwarmen.
- Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u voorzichtig het supernatant en laat u ongeveer 1 ml achter om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord.
- Resuspendeer de pellet in het resterende supernatans met een P1000-pipet.
- Voeg druppelsgewijs 8 ml warme PBS (37 °C) toe aan de respectievelijke buisjes terwijl je de buisjes voorzichtig ronddraait. Resuspendeer daarna met een P1000-pipet.
- Centrifugeer het geresuspendeerde bloed gedurende 8 minuten bij 180 × g (met instelling bij acceleratie 9, rem 9).
- Breng tijdens deze wachtstap 200 μL kweekmedium over naar elk van de gemarkeerde putjes.
- Bewaar de platen terug in de broedstoof om op 37 °C te blijven.
- Verwijder na het centrifugeren het supernatans in een continue beweging (om verstoring van de losse celpellet te voorkomen), maar laat ongeveer 80 μL van het supernatant achter.
- Voeg aan de pellet 280 μL FCS (kamertemperatuur) toe en resuspendeer (tot een totaal volume van 360 μL).
- Breng 180 μL van de celsuspensie over naar elk putje en resuspendeer (= 0,5 ml "bloed"/kweek). Het totale volume in elke put is nu 380 μL, wat resulteert in een medium laag van 2 mm.
- Incubeer de platen vóór de doorstraling gedurende ten minste 10 minuten in een CO2 -incubator bij 37 °C.
4. G0 MN-test
- Haal de platen uit de incubator en bestraal de celkweek met de vereiste doses zoals 0,5, 1 en 2 Gy röntgenstralen (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) bij kamertemperatuur. Gebruik schijnbestraalde monsters als controles om spontane MN-opbrengsten te identificeren.
- Voeg onmiddellijk na de doorstraling 1,62 ml kweekmedium (37 °C) toe aan elk putje.
- Om de celdeling in T-lymfocyten te stimuleren, voegt u 40 μL fytohemagglutinine (PHA) toe aan elk putje en resuspendeert u grondig.
- Plaats deze platen terug in de incubator (5% CO2, 37 °C).
NOTITIE: Dit is de starttijd van de test. - Blokkeer de cytokinese 23 uur na stimulatie door 8 μL cytochalasine B (6 μg/ml) per putje toe te voegen en goed te resuspenderen.
- Oogst de celculturen 70 uur na stimulatie/kweektijd. Resuspendeer en breng de cellen over naar een buis van 15 ml. Spoel elk putje af met 2 ml PBS en voeg dit PBS toe aan de betreffende tube van 15 ml.
- Centrifugeer de buisjes gedurende 8 minuten bij 180 × g, bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatans weg, maar laat ongeveer 500 μL over de pellet.
- Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg tijdens het vortexen langzaam druppelsgewijs 2 ml koud kaliumchloride (KCl, 4 °C) toe.
- Centrifugeer de cellen onmiddellijk bij 180 × g gedurende 8 minuten.
- Gooi de supernatant weg en laat ongeveer 500 μl van de supernatant over.
- Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg tijdens het vortexen langzaam druppelsgewijs 2 ml koud fixeermiddel 1 toe (methanol/azijnzuur/ringeroplossing in een verhouding van 4:1:5).
- Laat de monsterbuisjes een nacht bij 4 °C staan (minimaal 12 uur en maximaal 96 uur).
- Centrifugeer gedurende 8 minuten op 180 × g.
- Gooi de supernatant weg.
- Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg tijdens het vortexen langzaam druppelsgewijs 2 ml koud fixatief 2 toe (methanol/azijnzuur in een verhouding van 4:1).
- Centrifugeer gedurende 8 minuten op 180 × g.
- Gooi de supernatant weg.
- Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg dan langzaam (druppelsgewijs), terwijl je vortexeert, 2 ml koud fixeermiddel 2 toe aan de pellet.
- Laat de monsterbuisjes bij 4 °C staan (minimaal 12 uur en maximaal 96 uur).
- Reinig de objectglaasjes met isopropanol en label ze op de juiste manier.
OPMERKING: Gebruik bedrukte stickers om te labelen, aangezien markeerinkt gemakkelijk kan worden weggeveegd tijdens de verwerking. - Centrifugeer de monsterbuisjes gedurende 8 minuten bij 180 × g.
- Breng het supernatans over in een andere buis om de cellen te concentreren op basis van de grootte van de pellet.
- Draai de pellet vortex.
- Laat 40 μL van de vaste cellen op een droog en schoon glaasje vallen.
- Laat de glaasjes drogen op kamertemperatuur. Bewaar de objectglaasjes in een doos of beits ze onmiddellijk ter observatie.
5. Acridine oranje (AO) kleuring
- Dompel de objectglaasjes 1 minuut onder in AO-kleurstof, gevolgd door een snelle wasbeurt in het gedestilleerde water en plaats de objectglaasjes vervolgens 1 minuut in fosfaatbuffer (pH 6,8).
- Haal de glaasjes uit de bufferoplossing en droog met schoon tissuepapier de achterkant van de glaasjes af en leg de glaasjes op een schoon tissuepapier.
- Laat 20 μL van de fosfaatbuffer op het objectglaasje vallen en dek het voorzichtig af met een schoon dekglaasje, vermijd luchtbellen.
- Sluit deze glaasjes af met siliconencement.
OPMERKING: Aangezien AO lichtgevoelig is en na verloop van tijd vervaagt, wordt aanbevolen om de dia's binnen 5 dagen na kleuring te scoren voor een mooi contrast en fluorescentie. Bewaar objectglaasjes altijd in een koelcel (4 °C) als ze niet worden onderzocht.
6. Puntendelven van bevlekte dia's
- Plaats uw objectglaasje onder een fluorescentiemicroscoop en onderzoek 1.000 tweekernige cellen (BN's). Tel handmatig MN's, een van de zes biomarkers van toxiciteit. Om dit te doen, laat twee onafhankelijke scorers 500 BN-cellen/glaasje onderzoeken onder dezelfde vergroting.
OPMERKING: Hieronder volgen enkele hoogtepunten van de scoringscriteria, zoals aanbevolen door Fenech om de gekleurde objectglaasjes te scoren9- Selecteer een BN-cel door te zoeken naar mooi afgeronde cellen met intact cytoplasma, met twee goed onderscheiden kernen van ongeveer dezelfde grootte, regelmatige vorm en kleurpatroon. Zorg ervoor dat het cytoplasma van de BN-cel te onderscheiden is van het cytoplasma van de aangrenzende cel.
- Scoor een MN en merk op dat het morfologisch identiek is aan, maar kleiner is dan de hoofdkernen; zelfs de grootste MN kan niet meer zijn dan 1/3 van de diameter van de hoofdkernen. Scoor een MN alleen als het de hoofdkernen niet raakt of als ten minste de micronucleaire grens te onderscheiden is van de grens van de hoofdkernen.
Representative Results
Om de reproduceerbaarheid van het protocol te valideren, voerden we de MN-test uit op gecryopreserveerde bloedmonsters van 30 gezonde vrijwilligers tussen 17 en 65 jaar. De gemiddelde leeftijd van de groep is 35 jaar. De cryopreservatietijd varieerde van 1 week tot 154 weken. Na blootstelling van de hele bloedcelkweek aan verschillende stralingsdoses (0,5, 1 en 2 Gy), werd de opbrengst van micronuclei in 1.000 BN-cellen onder een microscoop onderzocht. Mooi afgeronde tweekernige cellen (zoals te zien is in figuur 2) duiden op een succesvolle extractie van gezonde levensvatbare cellen uit gecryopreserveerde volbloedmonsters. Opmerkelijk is dat de stralingsrespons van lymfocyten stabiel bleef na langdurige opslag bij ultralage temperaturen (vloeibare stikstof). Deze observatie is in lijn met de verwachte respons van verse bloedmonsters.
Figuur 2: Micronuclei zoals waargenomen in tweekernige cellen die zijn verkregen uit een bevroren volbloedmonster dat 1 jaar geleden is ingevroren. (A) Vergroting 200x, (B) Vergroting 400x; Pijlen die naar de MN's wijzen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bij verhoogde stralingsdoses (0,5, 1 en 2 Gy) werd een lineair-kwadratische toename van de micronucleusopbrengst waargenomen (tabel 1 en figuur 3). De MN-opbrengsten in schijnbestraalde controlemonsters (0 Gy) vertegenwoordigen de MN-achtergrondopbrengsten die voornamelijk het gevolg zijn van achterblijvende chromosomen.
| Dosis (Gy) | 0 | 0.5 | 1 | 2 |
| Gemiddeld | 18 | 107 | 247 | 601 |
| SD | 10.8 | 23.9 | 53.3 | 101.1 |
| CV (%) | 59.9 | 22.3 | 21.6 | 16.8 |
| Bereik | 5-41 | 62-140 | 139-324 | 395-755 |
Tabel 1: Bereik en variatiecoëfficiënt samen met de gemiddelde MN-opbrengst, zoals waargenomen in ingevroren volbloedmonsters van 30 gezonde donoren, indicatief voor interindividuele variabiliteit. Afkortingen: CV = variatiecoëfficiënt; SD = standaarddeviatie.
Figuur 3: Opbrengst van micronuclei zoals waargenomen bij controle- en bestraalde ingevroren volbloedmonsters van 30 donoren. De cryopreservatieperioden varieerden van 1 week tot 154 weken. Spreidingsdiagramgrafiek toont individuele waarden. Lijnen in clusters vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van de groep. Afkortingen: MN = micronuclei; BN = tweekernig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de interindividuele variatie in de MN-opbrengst van personen te onderzoeken, werd de variatiecoëfficiënt (CV) berekend (zie tabel 1). Voor stralingsgeïnduceerd MN werd een CV < 25% verkregen voor alle doses (0,5, 1 en 2 Gy), wat wijst op een goede reproduceerbaarheid van het gewijzigde protocol.
Discussion
Het aangepaste protocol voor de toepassing van de CBMN-test is een relatief eenvoudige en handige manier om bloedmonsters in bulk op te slaan. De procedure schetst alle minuscule maar belangrijke details die moeten worden verzorgd tijdens cryopreservatie en de CBMN-test. Andere laboratoriumprotocollen gebruiken normaal gesproken 10% DMSO in het vriesmengsel, terwijl ons vriesmengsel 20% DMSO samen met 80% FCS7 bevat. Aangezien dit vriesmengsel in gelijke volumes aan het volbloedmonster wordt toegevoegd, is de uiteindelijke concentratie ook 10% DMSO. Om de celoverleving te verbeteren en de celdeling te stimuleren, voegen we 1% natriumpyruvaat en 0,1% bèta-mercaptoethanol toe aan het complete kweekmedium (cRPMI). Dit is in overeenstemming met het celkweekprotocol dat is opgesteld door onze onderzoeksgroep 6,8.
Hoewel het probleem van het samenklonteren van cellen tijdens het ontdooien niet volledig kon worden opgelost in dit protocol, was de celsegregatie beter dan de andere conventionele protocollen. In plaats van consistente, abrupte toevoeging van kweekmedia om cellen na ontdooien te herstellen, kregen we betere resultaten wanneer voorverwarmde PBS (37 °C) druppelsgewijs werd toegevoegd tijdens de wasstappen. Deze verbetering helpt bij het verminderen van cellulaire stress en minimaliseert klonteren met een bewezen hoog herstel van cellen. Bovendien kon er geen duidelijk verschil in cellevensvatbaarheid worden waargenomen wanneer PBS werd gebruikt in plaats van RPMI. De groep heeft bevestigd dat de lengte van de cryopreservatieperiode (tot 1 jaar) geen invloed heeft op de MN-opbrengsten, zowel in bestraalde als niet-bestraalde monsters 6,8. Studies suggereren dat een goede cellevensvatbaarheid en proliferatie van PBMC's kan worden bereikt door geleidelijk in te vriezen bij lage temperaturen (vloeibare stikstof), gevolgd door geleidelijke toevoeging van voorverwarmd medium tijdens het ontdooien10,11. Onderzoekers hebben aangetoond dat de subpopulaties van T-lymfocyten in ontdooid volbloed vergelijkbaar zijn met die waargenomen in ontdooide PBMC's12. Verder is bewezen dat celsubtypes die zijn teruggevonden uit ingevroren volbloedmonsters vergelijkbaar zijn met die waargenomen in verse volbloedmonsters13,14.
Als we de indicatieve resultaten in het rapport bekijken, zien we dat de lineaire kwadratische toename met de dosis (figuur 3) in overeenstemming is met andere literatuurrapporten over lineaire energieoverdracht (LET)-geïnduceerde micronuclei15,16. De variabiliteit in MN-opbrengsten waargenomen in de gecryopreserveerde volbloedmonsters (tabel 1) ligt binnen het bereik van de variabiliteit die wordt gerapporteerd voor verse volbloedculturen 8,17,18. Het protocol dat hier in detail wordt beschreven, werd gevalideerd op vers en gecryopreserveerd volbloed van 20 gezonde vrijwilligers8. De kerndelingsindex (NDI), een belangrijke parameter voor celproliferatie die in dat rapport8 werd waargenomen, kwam overeen met de index die werd voorgesteld voor vers volbloed19,20. Alles bij elkaar genomen zorgt dit geoptimaliseerde protocol voor cryopreservatie van volbloed en gemodificeerde micronucleustest voor een betere celopbrengst en daarom wordt aanpassing van dit protocol aanbevolen voor stralingsgevoeligheidsbeoordelingen. Aangezien de reproduceerbaarheid van het protocol al is gevalideerd8, wordt gesuggereerd dat het toepasbaar is in grootschalige en multicenter studies.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs danken L. Pieters, T. Thiron en G. De Smet voor hun technische ondersteuning. We zijn alle vrijwilligers dankbaar die bloed hebben gedoneerd voor het onderzoek. Het werk werd financieel ondersteund door het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek- Vlaanderen (FWO) in het kader van Krediet (T000118N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
| 24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
| 96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
| Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
| Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
| CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
| cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
| Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
| Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
| Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
| Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
| Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
| GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
| KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
| KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
| Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
| Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
| Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
| NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
| Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
| Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
| Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
| RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
| Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
| Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
| β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |
References
- Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors. Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).
- Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. Radiation-induced cell death and its mechanisms. Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).
- Roederer, M., et al. The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis. Cell. 161 (2), 387-403 (2015).
- Bankoglu, E. E., et al. Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay. Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).
- Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method. Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).
- Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells. Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125 (2020).
- Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies. Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).
- Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood. International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).
- Fenech, M.
- Ramachandran, H., et al. Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies. Cells. 1 (3), 313-324 (2012).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).
- Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).
- Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).
- Braudeau, C., et al. An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).
- Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response. Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).
- Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure. Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).
- Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability. Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).
- Pajic, J., et al. Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays. Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).
- Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).
- Miszczyk, J., Rawojć, K. Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation. International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).
