Her presenterer vi en optimalisert protokoll for cytokinese-blokk mikronukleusanalysen på kryopreserverte fullblodprøver. Denne optimaliserte metoden for kryopreservering av fullblod for mikronukleusanalyse er en pålitelig teknikk for storskala prøvetaking og multisenterstudier, og kan også brukes til andre blodrelaterte analyser.
In vitro cytokinesis-blokk mikronukleus (CBMN) analysen er en mye brukt teknikk i radiobiologisk forskning, biologisk dosimetri, gentoksisitetsstudier og in vitro radiosensitivitetstesting. Denne cytogenetiske metoden er basert på påvisning av mikrokjerner i binukleerte celler som følge av kromosomale fragmenter som henger etter under celledeling. Ferske fullblodprøver er den mest foretrukne prøvetypen for CBMN-analysen. Ulempene ved å arbeide med ferske blodprøver inkluderer imidlertid umiddelbar behandling etter blodprøvetaking og det begrensede antallet gjentatte analyser som kan utføres uten ekstra blodprøvetaking.
Siden behovet for ferske blodprøver kan være logistisk utfordrende, vil CBMN-analyse på kryopreserverte fullblodprøver være til stor fordel, spesielt i store pasientstudier. Dette papiret beskriver en protokoll for å fryse hele blodprøver og å utføre CBMN-analysen på disse frosne blodprøvene. Blodprøver fra friske frivillige har blitt frosset og tint på forskjellige tidspunkter og deretter utsatt for en modifisert mikronukleusanalyseprotokoll. Resultatene viser at denne optimaliserte prosedyren tillater utførelsen av CBMN-analysen på frosne blodprøver. Den beskrevne kryopreserveringsprotokollen kan også være svært nyttig for andre cytogenetiske analyser og en rekke funksjonelle analyser som krever prolifererende lymfocytter.
Helt siden oppdagelsen har bruken av ioniserende stråling (IR) vært et spørsmål om debatt blant forskere på grunn av dets negative effekter på levende vesener. Den skadelige effekten manifesteres vanligvis av DNA-skader som dobbeltstrengede brudd (DSB), og manglende reparasjon av disse DSBene fører til kromosomavvik og mutasjoner, som er viktige kjennetegn på kreft 1,2. Slike kromosomavvik kan undersøkes ved cytogene analyser som cytokinese-blokk mikronukleus (CBMN) analyse. Mikrokjerner er laggende kromosomale fragmenter som ikke kan inkorporeres i datterkjerner og derfor blir etterlatt under mitose.
CBMN er en vanlig brukt, pålitelig cytogenetisk teknikk for å vurdere kromosomskader hos individer utsatt for in vivo eller in vitro ioniserende stråling. Enten ferskt fullblod eller isolerte mononukleære celler i perifert blod (PBMC) kan brukes i CBMN-analysen. Friskt fullblod er for det meste det biologiske materialet du velger, siden isolering og behandling av PBMC kan være tidkrevende og ledsages av tap av serumplasma som fungerer som støttemedium for celleoverlevelse og vekst. For å oppnå et godt binucleated celleutbytte, bør friskt fullblod behandles umiddelbart etter innsamling. Behovet for umiddelbar behandling kan imidlertid være logistisk utfordrende under tidspress. Videre, når mange prøver skal samles over en lengre periode eller samles inn på punkter borte fra behandlingssentrene, kan lagring av ferske blodprøver være en begrensende faktor 3,4.
Videre, for å tillate gjentatt MN-analyse hos samme person/pasient, vil frysing av blodprøver være gunstig. En måte å lagre lymfocytter for senere bruk av CBMN-analysen er ved å fryse isolerte PBMCer 5,6. Denne teknikken krever imidlertid flere behandlingstrinn før PBMC-ene kan fryses. Derfor vil kryopreservering av fullblod representere et enkelt og tidseffektivt alternativ til kryopreservering av isolerte PBMCer. Det foreligger lite informasjon om bruk av frosset fullblod til cytogenetiske analyser eller analyser som krever spredning av lymfocytter. Bare ett papir rapporterer bruk av kryopreservert fullblod for metafaseanalyse7.
Siden kryopreservering av fullblod ville gi mange fordeler innen biomonitorering, biodosimetri og radiosensitivitetsvurdering, optimaliserte vår gruppe en kryopreserveringsprotokoll for fullblod som tillater anvendelse av CBMN-analysen8. Vi viste at lymfocytter tilstede i kryopreserverte fullblodskulturer beholder sin genomiske integritet og proliferasjonskapasitet i minst 1 år. I dette metodepapiret beskriver vi i detalj kryopreserveringsprosedyren og CBMN-analyseprotokollen, som ble optimalisert av Beyls et al.8, og rapporterer funn oppnådd for frosne blodprøver av 30 friske individer. For CBMN-analysen ble blodkulturene bestrålt in vitro med doser på 0,5, 1 og 2 Gy for å vurdere MN-responsen i lymfocytter av kryopreserverte fullblodprøver.
Den modifiserte protokollen for anvendelse av CBMN-analysen er en relativt enkel og praktisk måte å lagre blodprøver i bulk. Prosedyren skisserer alle de små, men viktige detaljene som må tas vare på under kryopreservering og CBMN-analysen. Andre laboratorieprotokoller bruker normalt 10% DMSO i fryseblandingen, mens fryseblandingen vår inneholder 20% DMSO sammen med 80% FCS7. Da denne fryseblandingen tilsettes i like store mengder til hele blodprøven, er den endelige konsentrasjonen også 10% DMSO. For å forbedre celleoverlevelsen og stimulere celledeling tilsetter vi 1% natriumpyruvat og 0,1% beta-merkaptoetanol til det komplette dyrkningsmediet (cRPMI). Dette er i samsvar med cellekulturprotokollen etablert av vår forskningsgruppe 6,8.
Selv om problemet med celleklumping under tining ikke kunne løses fullstendig i denne protokollen, var cellesegregering bedre enn de andre konvensjonelle protokollene. I stedet for konsekvent, brå tilsetning av dyrkningsmedier for å gjenvinne celler etter tining, oppnådde vi bedre resultater når forvarmet PBS (37 °C) ble tilsatt dråpevis under vasketrinnene. Denne forbedringen bidrar til å redusere cellulær stress og minimerer klumping med påvist høy utvinning av celler. Videre kunne ingen klar forskjell i cellenes levedyktighet observeres når PBS ble brukt over RPMI. Det har blitt validert av gruppen at lengden på kryopreserveringsperioden (opptil 1 år) ikke vil påvirke MN-utbyttet, både i bestrålte og ikke-bestrålte prøver 6,8. Studier tyder på at god cellelevedyktighet og spredning av PBMC kan oppnås med gradvis frysing ved lave temperaturer (flytende nitrogen), etterfulgt av gradvis tilsetning av forvarmet medium mens tining10,11. Forskere har vist at underpopulasjonene av T-lymfocytter i tint fullblod er sammenlignbare med de som er observert i tinte PBMC12. Videre er det bevist at cellesubtyper gjenvunnet fra kryopreserverte fullblodprøver ligner de som er observert i ferske hele blodprøver13,14.
Ser vi på de veiledende resultatene i rapporten, ser vi at den lineære kvadratiske økningen med dose (figur 3) stemmer overens med andre litteraturrapporter om lineær energioverføring (LET)-induserte mikrokjerner15,16. Variasjonen i MN-utbytte observert i de kryopreserverte fullblodsprøvene (tabell 1) er i området med den som er rapportert for ferske fullblodskulturer 8,17,18. Protokollen beskrevet i detalj her ble validert på ferskt og kryopreservert fullblod av 20 friske frivillige8. Nukleær divisjonsindeks (NDI), som er en viktig parameter for celleproliferasjon observert i den rapporten8, var i samsvar med den som ble foreslått for friskt fullblod19,20. Samlet sett gir denne optimaliserte protokollen for kryopreservering av fullblod og modifisert mikronukleusanalyse et bedre celleutbytte, og derfor anbefales tilpasning av denne protokollen for radiosensitivitetsvurderinger. Siden reproduserbarheten av protokollen allerede er validert8, foreslås det å ha anvendelighet i store og multisenterstudier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke L. Pieters, T. Thiron og G. De Smet for deres tekniske støtte. Vi er takknemlige for alle frivillige som donerte blod til studien. Arbeidet ble støttet økonomisk av Research Foundation-Flanders (FWO) under Grant (T000118N).
15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |