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Cancer Research

क्रायोप्रेज़र्व्ड होल ब्लड पर माइक्रोन्यूक्लियस परख

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Radiobiology group, Department of Human Structure and Repair, Ghent University

Summary

यहां हम क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों पर साइटोकिन्सिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस परख के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। माइक्रोन्यूक्लियस विश्लेषण के लिए पूरे रक्त के क्रायोप्रिजर्वेशन की यह अनुकूलित विधि बड़े पैमाने पर नमूने और बहु-केंद्र अध्ययनों के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है और इसका उपयोग अन्य रक्त संबंधी परखों के लिए भी किया जा सकता है।

Abstract

इन विट्रो साइटोकिन्सिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस (सीबीएमएन) परख रेडियोबायोलॉजी अनुसंधान, जैविक डोसिमेट्री, जीनोटॉक्सिसिटी अध्ययन और इन विट्रो रेडियोसेंसिटिविटी परीक्षण में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। यह साइटोजेनेटिक विधि कोशिका विभाजन के दौरान क्रोमोसोमल टुकड़ों के परिणामस्वरूप द्विकेंद्रक कोशिकाओं में माइक्रोन्यूक्लिआई का पता लगाने पर आधारित है। ताजा पूरे रक्त के नमूने सीबीएमएन परख के लिए सबसे पसंदीदा नमूना प्रकार हैं। हालांकि, ताजा रक्त के नमूनों के साथ काम करने के नुकसान में रक्त संग्रह के बाद तत्काल प्रसंस्करण और दोहराया विश्लेषण की सीमित संख्या शामिल है जो अतिरिक्त रक्त नमूने के बिना किया जा सकता है।

चूंकि ताजा रक्त के नमूनों की आवश्यकता तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है, क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों पर सीबीएमएन परख का बहुत फायदा होगा, खासकर बड़े पैमाने पर रोगी अध्ययन में। यह पत्र पूरे रक्त के नमूनों को फ्रीज करने और इन जमे हुए रक्त नमूनों पर सीबीएमएन परख करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त के नमूने जमे हुए हैं और अलग-अलग समय बिंदुओं पर पिघले हुए हैं और फिर, एक संशोधित माइक्रोन्यूक्लियस परख प्रोटोकॉल के अधीन हैं। परिणाम दर्शाते हैं कि यह अनुकूलित प्रक्रिया जमे हुए रक्त के नमूनों पर सीबीएमएन परख के प्रदर्शन की अनुमति देती है। वर्णित क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रोटोकॉल अन्य साइटोजेनेटिक परखों और विभिन्न प्रकार के कार्यात्मक परख के लिए भी बहुत उपयोगी हो सकता है जिसमें लिम्फोसाइटों के प्रसार की आवश्यकता होती है।

Introduction

इसकी खोज के बाद से, आयनकारी विकिरण (आईआर) का उपयोग जीवित प्राणियों पर इसके प्रतिकूल प्रभावों के कारण शोधकर्ताओं के बीच बहस का विषय रहा है। हानिकारक प्रभाव आमतौर पर डीएनए क्षति जैसे डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) द्वारा प्रकट होता है, और इन डीएसबी की मरम्मत में विफलता से गुणसूत्र विपथन और उत्परिवर्तन होते हैं, जो कैंसर 1,2 की महत्वपूर्ण पहचान हैं। इस तरह के गुणसूत्र विपथन की जांच साइटोजेनिक परख जैसे साइटोकिन्सिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस (सीबीएमएन) परख द्वारा की जा सकती है। माइक्रोन्यूक्लिआई क्रोमोसोमल टुकड़े को पीछे छोड़ रहे हैं जिन्हें बेटी नाभिक में शामिल नहीं किया जा सकता है और इसलिए, माइटोसिस के दौरान पीछे छोड़ दिया जाता है।

सीबीएमएन आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली, विश्वसनीय साइटोजेनेटिक तकनीक है जो विवो या इन विट्रो आयनीकरण विकिरण के संपर्क में आने वाले व्यक्तियों में गुणसूत्र क्षति का आकलन करती है। सीबीएमएन परख में या तो ताजा पूरे रक्त या पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का उपयोग किया जा सकता है। ताजा संपूर्ण रक्त ज्यादातर पसंद की जैविक सामग्री है क्योंकि पीबीएमसी का अलगाव और प्रसंस्करण समय लेने वाला हो सकता है और सीरम प्लाज्मा के नुकसान के साथ होता है जो सेल अस्तित्व और विकास के लिए सहायक माध्यम के रूप में कार्य करता है। एक अच्छा द्विकेंद्रक कोशिका उपज प्राप्त करने के लिए, ताजा पूरे रक्त को संग्रह के तुरंत बाद संसाधित किया जाना चाहिए। हालांकि, समय की कमी के दौरान तत्काल प्रसंस्करण की आवश्यकता तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा, जब कई नमूनों को एक विस्तारित अवधि में प्राप्त किया जाना चाहिए या प्रसंस्करण केंद्रों से दूर बिंदुओं पर एकत्र किया जाना चाहिए, तो ताजा रक्त के नमूनों का भंडारण एक सीमित कारक 3,4 हो सकता है।

इसके अलावा, एक ही व्यक्ति/रोगी में बार-बार एमएन विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, रक्त के नमूनों को फ्रीज करना फायदेमंद होगा। सीबीएमएन परख के बाद के आवेदन के लिए लिम्फोसाइटों को स्टोर करने का एक तरीका पृथक पीबीएमसी 5,6 को फ्रीज करना है। हालाँकि, इस तकनीक को PBMC को जमे हुए होने से पहले कई प्रसंस्करण चरणों की आवश्यकता होती है। इसलिए, पूरे रक्त का क्रायोप्रिजर्वेशन पृथक पीबीएमसी के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक सरल और समय-कुशल विकल्प का प्रतिनिधित्व करेगा। साइटोजेनेटिक परख या परख के लिए जमे हुए पूरे रक्त के उपयोग के बारे में बहुत कम जानकारी उपलब्ध है जिसके लिए लिम्फोसाइटों के प्रसार की आवश्यकता होती है। केवल एक पेपर मेटाफ़ेज़ विश्लेषण7 के लिए क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त के उपयोग की रिपोर्ट करता है।

चूंकि पूरे रक्त का क्रायोप्रिजर्वेशन बायोमॉनिटरिंग, बायोडोसिमेट्री और रेडियोसेंसिटिविटी मूल्यांकन के क्षेत्र में कई फायदे प्रदान करेगा, इसलिए हमारे समूह ने पूरे रक्त के लिए एक क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जो सीबीएमएन परख8 के आवेदन की अनुमति देता है। हमने दिखाया कि क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त संस्कृतियों में मौजूद लिम्फोसाइट्स कम से कम 1 वर्ष के लिए अपनी जीनोमिक अखंडता और प्रसार क्षमता बनाए रखते हैं। इस विधि पत्र में, हम क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रक्रिया और सीबीएमएन परख प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं, जिसे बेयल्स एट अल 8 द्वारा अनुकूलित किया गया था, और 30 स्वस्थ व्यक्तियों के जमे हुए रक्त के नमूनों के लिए प्राप्त निष्कर्षों की रिपोर्ट करते हैं। CBMN परख के लिए, रक्त संस्कृतियों को क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त नमूनों के लिम्फोसाइटों में MN प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए 0.5, 1, और 2 Gy की खुराक के साथ इन विट्रो में विकिरणित किया गया था।

Protocol

इस अध्ययन के लिए, 17 से 65 वर्ष की आयु के 30 स्वस्थ दाताओं से वेनिपंक्चर द्वारा रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। 8 रक्त के नमूनों का संग्रह गेन्ट यूनिवर्सिटी अस्पताल (पंजीकरण संख्या: 2019/1565), बेल्जियम की आचार समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार है। सभी प्रतिभागियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और अभिकर्मकों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. रक्त के नमूनों का संग्रह

  1. शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रतिभागियों की लिखित सूचित सहमति उपलब्ध है और नैतिक दिशानिर्देशों का ठीक से पालन किया जाता है।
  2. ली-हेपरिन ट्यूबों में रक्त एकत्र करें और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए प्रसंस्करण के लिए तैयार होने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

2. पूरे रक्त का क्रायोप्रिजर्वेशन

नोट: सेल कटाई तक सभी चरणों बाँझ लामिना airflow में aseptically प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. रक्त के 1 एमएल को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए, भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के 800 माइक्रोन और डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) के 200 माइक्रोन को मिलाकर ठंड माध्यम का 1 एमएल बनाएं।
    नोट: ठंड माध्यम रक्त के नमूनों के बराबर मात्रा में तैयार किया जाता है जिसे जमे हुए होने की आवश्यकता होती है।
  2. पूरे रक्त के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, रक्त के नमूने को हेपरिनाइज्ड ट्यूब से 15 या 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें
    नोट: ट्यूब की क्षमता रक्त की मात्रा पर निर्भर करती है।
  3. भंवर रक्त को कम गति पर निरंतर लेकिन बूंद के साथ ठंड माध्यम के समान मात्रा के जोड़ के साथ।
  4. रक्त-फ्रीज मिश्रण के 2 एमएल को क्रायोवियल्स (2 एमएल) में स्थानांतरित करें जहां प्रत्येक विभाज्य में 1 एमएल रक्त नमूना 1 एमएल ठंड मिश्रण के साथ मिश्रित होता है।
  5. चरणबद्ध क्रमिक ठंड
    1. क्रायोवियल्स को आइसोप्रोपेनॉल युक्त क्रायोबॉक्स में स्थानांतरित करें और रात भर के लिए फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में डाल दें।
    2. लंबे समय तक उपयोग के लिए क्रायोवियल्स को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

3. क्रायोप्रेज़र्व्ड रक्त का विगलन

नोट: विगलन प्रक्रिया के कुल समय को सीमित करने के लिए, एक बार में अधिकतम 8 क्रायोवियल्स (2 एमएल प्रत्येक) को संभाला जाना चाहिए।

  1. तैयारी
    1. रक्त को पिघलाने से पहले बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 200 एमएल को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।
    2. बाँझ परिस्थितियों के तहत आवश्यक संस्कृति माध्यम का एक कार्यशील समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि प्रति संस्कृति माध्यम में पूर्ण माध्यम का 1.6 एमएल शामिल है: रोजवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) मीडिया पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.5%), एफसीएस के 0.2 एमएल, सोडियम पाइरूवेट के 20 माइक्रोन, और β-मर्कैप्टोथेनॉल के 2 माइक्रोन के साथ पूरक है।
      नोट: चूंकि विगलन करते समय रक्त कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या खो सकती है, इसलिए पिघले हुए रक्त को 2 एमएल की कुल मात्रा के साथ 24-अच्छी प्लेटों जैसे छोटे कुओं में सुसंस्कृत किया जाता है। प्रति खुराक एक बहु-अच्छी प्लेट का उपयोग किया जाता है।
    3. प्रत्येक संस्कृति के लिए अच्छी तरह से, दाता कोड और तारीख और खुराक के साथ ढक्कन पर ए / बी इंगित करें, जैसा कि नीचे सुझाया गया है (चित्र 1)।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोन्यूक्लियस परख के लिए पूरे रक्त संस्कृति के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली का सुझाव लेआउट. कुओं को चिह्नित करें और ढक्कन पर उपयुक्त स्थानों पर दाता कोड इंगित करें। प्रत्येक रोगी के नमूने के लिए, डुप्लिकेट कुओं एक दूसरे के निकट होना चाहिए. ध्यान दें कि यह 10 x 10 कोलिमेटर के लिए एक विचारोत्तेजक लेआउट है और इसे कोलिमेटर या नमूनों के आकार के अनुसार बदला जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. पूरे रक्त को पिघलाने और संवर्धन के लिए कदम
    1. पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. तरल नाइट्रोजन से आवश्यक क्रायोवियल्स को बाहर निकालें (संख्या खुराक की संख्या जैसी आवश्यकताओं पर निर्भर करती है)।
      नोट: एक क्रायोवियल में 1 एमएल रक्त और 1 एमएल फ्रीजिंग माध्यम होता है। इसलिए, एक क्रायोवियल से रक्त के साथ दो संस्कृतियों को स्थापित किया जा सकता है।
    3. गर्म पानी के स्नान में क्रायोवियल्स को आंशिक रूप से पिघलाएं (जब तक कि छोटे बर्फ के क्रिस्टल अभी भी दिखाई न दें)।
    4. पानी के स्नान से शीशियों को बाहर निकालें और बाँझ टिशू पेपर के साथ शीशियों के बाहर साफ करें।
    5. एक बाँझ लामिना airflow हुड में, बाहर फैल से ट्यूबों के अंदर गठित हवा के बुलबुले को रोकने के लिए बहुत धीरे धीरे शीशियों खुला.
    6. प्रत्येक शीशी की सामग्री को फिर से निलंबित करें और व्यक्तिगत रूप से उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (शीशी प्रति 1 ट्यूब) में स्थानांतरित करें।
    7. संबंधित ट्यूबों के लिए, धीरे-धीरे ट्यूब को घुमाते हुए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के ड्रॉपवाइज 1 एमएल जोड़ें। एक P1000 विंदुक के साथ पुन: निलंबित.
    8. कमजोर पड़ने और वर्दी धोने के लिए, पहले से गरम पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के ड्रॉपवाइज 7 एमएल जोड़ें और एक P1000 विंदुक के साथ फिर से निलंबित करें।
    9. कमरे के तापमान पर 180 × ग्राम ( त्वरण 1, ब्रेक 1 पर सेटिंग के साथ) पर 8 मिनट के लिए रक्त को अपकेंद्रित्र करें।
    10. इस प्रतीक्षा कदम के दौरान, पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ खाली कुओं (एक के अलावा जहां कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जाएगा) भरें।
    11. अच्छी तरह से प्लेटों को पहले से गरम करने के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    12. एक बार सेंट्रीफ्यूजेशन पूरा हो जाने के बाद, सेल गोली को परेशान करने से बचने के लिए लगभग 1 एमएल को पीछे छोड़ते हुए, सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    13. एक P1000 विंदुक के साथ शेष सतह पर तैरनेवाला में गोली resuspension.
    14. धीरे-धीरे ट्यूबों को घुमाते हुए संबंधित ट्यूबों में गर्म पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के ड्रॉपवाइज 8 एमएल जोड़ें। बाद में, एक P1000 विंदुक के साथ फिर से निलंबित.
    15. 180 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए पुन: निलंबित रक्त को अपकेंद्रित्र करें ( त्वरण 9, ब्रेक 9 पर सेटिंग के साथ)।
    16. इस प्रतीक्षा कदम के दौरान, चिह्नित कुओं में से प्रत्येक के लिए संस्कृति माध्यम के 200 माइक्रोन हस्तांतरण.
    17. प्लेटों को इनक्यूबेटर में वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर रहने के लिए रखें।
    18. centrifugation के बाद, एक सतत गति (ढीला सेल गोली परेशान से बचने के लिए) में सतह पर तैरनेवाला हटा दें, लेकिन सतह पर तैरनेवाला के लगभग 80 माइक्रोन के पीछे छोड़ दें.
    19. गोली के लिए, एफसीएस (कमरे के तापमान) के 280 माइक्रोन जोड़ें और फिर से निलंबित करें (360 माइक्रोन की कुल मात्रा में)।
    20. सेल निलंबन के 180 माइक्रोन को प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और फिर से निलंबित करें (= "रक्त" / संस्कृति का 0.5 एमएल)। प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा अब 380 माइक्रोन है, जिसके परिणामस्वरूप 2 मिमी मध्यम परत होती है।
    21. विकिरण से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेटों को सेते हैं।

4. G0 MN परख

  1. इनक्यूबेटर से प्लेटें बाहर निकालें और कमरे के तापमान पर 0.5, 1, और 2 Gy एक्स-रे (220 केवी, 13 एमए, 0.15 मिमी घन) जैसे आवश्यक खुराक के साथ सेल संस्कृति को विकिरणित करें। सहज एमएन पैदावार की पहचान करने के लिए नियंत्रण के रूप में नकली विकिरणित नमूनों का उपयोग करें।
  2. इसके तत्काल बाद विकिरण के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के 1.62 एमएल जोड़ें.
  3. टी-लिम्फोसाइटों में कोशिका विभाजन को प्रोत्साहित करने के लिए, प्रत्येक कुएं में फाइटोहेमाग्लूटिनिन (पीएचए) के 40 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह से निलंबित करें।
  4. इन प्लेटों को इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस) में वापस रखें।
    नोट: यह परख का शुरुआती समय होगा।
  5. साइटोकिनेसिस को 23 घंटे के बाद उत्तेजना के लिए प्रति अच्छी तरह से साइटोकैलेसिन बी (6 माइक्रोन / एमएल) के 8 माइक्रोन जोड़कर ब्लॉक करें और ठीक से फिर से निलंबित करें।
  6. सेल संस्कृतियों फसल 70 घंटे के बाद उत्तेजना / संस्कृति समय. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस के 2 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला और संबंधित 15 एमएल ट्यूब के लिए इस पीबीएस जोड़ें.
  7. कमरे के तापमान पर 180 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
  8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें लेकिन गोली पर लगभग 500 माइक्रोन छोड़ दें।
  9. गोली (पूरी गति से) भंवर और भंवर करते समय, धीरे-धीरे ठंडे पोटेशियम क्लोराइड (KCl, 4 डिग्री सेल्सियस) के ड्रॉपवाइज 2 एमएल जोड़ें।
  10. तुरंत 8 मिनट के लिए 180 × ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सतह पर तैरनेवाला के लगभग 500 माइक्रोन छोड़कर।
  12. गोली भंवर (पूरी गति से) और भंवर करते समय, धीरे-धीरे ठंड लगानेवाला 1 (4: 1: 5 के अनुपात में मेथनॉल / एसिटिक एसिड / रिंगर समाधान) के ड्रॉपवाइज 2 एमएल जोड़ें।
  13. नमूना ट्यूबों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (न्यूनतम 12 घंटे और अधिकतम 96 घंटे) पर छोड़ दें।
  14. 180 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  15. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  16. गोली भंवर (पूरी गति से) और भंवर करते समय, धीरे-धीरे ठंड लगानेवाला 2 (4: 1 के अनुपात में मेथनॉल / एसिटिक एसिड) के ड्रॉपवाइज 2 एमएल जोड़ें।
  17. 180 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  18. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  19. गोली भंवर (पूरी गति से) और फिर धीरे-धीरे (dropwise) जोड़ें, vortexing जबकि, ठंड लगानेवाला 2 गोली के लिए 2 एमएल.
  20. नमूना ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस (न्यूनतम 12 घंटे और अधिकतम 96 घंटे) पर छोड़ दें।
  21. स्लाइड्स को आइसोप्रोपानॉल से साफ करें और उन्हें ठीक से लेबल करें।
    नोट: लेबल करने के लिए मुद्रित स्टिकर का उपयोग करें क्योंकि प्रसंस्करण के दौरान मार्कर स्याही आसानी से मिटा दी जाती है।
  22. 180 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए नमूना ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
  23. गोली के आकार के अनुसार कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए सतह पर तैरनेवाला को दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  24. गोली भंवर.
  25. एक सूखी और साफ स्लाइड पर तय कोशिकाओं के 40 माइक्रोन ड्रॉप।
  26. स्लाइड्स कमरे के तापमान पर सूखी चलो. अवलोकन के लिए तुरंत एक बॉक्स या दाग में स्लाइड स्टोर करें।

5. Acridine नारंगी (एओ) धुंधला हो जाना

  1. 1 मिनट के लिए एओ दाग में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया, आसुत जल में एक त्वरित धोने के बाद, और फिर, 1 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर (पीएच 6.8) में स्लाइड जगह है.
  2. बफर समाधान से स्लाइड बाहर ले लो और साफ टिशू पेपर के साथ, स्लाइड के पीछे सूखी, और एक साफ टिशू पेपर पर स्लाइड डाल दिया.
  3. स्लाइड के शीर्ष पर फॉस्फेट बफर के 20 माइक्रोन ड्रॉप करें और धीरे से इसे एक साफ कवरस्लिप के साथ कवर करें, हवा के बुलबुले से बचें।
  4. इन स्लाइड्स को सिलिकॉन सीमेंट से सील करें।
    नोट: चूंकि एओ प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और समय के साथ फीका पड़ जाता है, एक अच्छा विपरीत और प्रतिदीप्ति के लिए, स्लाइड्स के स्कोरिंग धुंधला होने के 5 दिनों के भीतर सिफारिश की है. स्लाइड को हमेशा ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें, जब जांच न की जाए।

6. स्कोरिंग सना हुआ स्लाइड

  1. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के तहत अपनी स्लाइड प्लेस और 1,000 binucleated कोशिकाओं (बीएन) की जांच. मैन्युअल रूप से एमएन की गणना करें, जो विषाक्तता के छह बायोमार्कर में से एक हैं। ऐसा करने के लिए, दो स्वतंत्र स्कोरर एक ही आवर्धन के तहत 500 बीएन कोशिकाओं /
    नोट: स्कोरिंग मानदंड के कुछ मुख्य आकर्षण निम्नलिखित हैं, जैसा कि फेनेच द्वारा दाग वाली स्लाइड्स9 को स्कोर करने के लिए अनुशंसित किया गया है
    1. लगभग एक ही आकार, नियमित आकार, और धुंधला पैटर्न के दो अच्छी तरह से प्रतिष्ठित नाभिक के साथ, बरकरार cytoplasm के साथ अच्छी तरह गोल कोशिकाओं के लिए देख द्वारा एक बीएन सेल का चयन करें. सुनिश्चित करें कि बीएन सेल का साइटोप्लाज्म आसन्न सेल के साइटोप्लाज्म से अलग है।
    2. एक एमएन स्कोर करें, यह देखते हुए कि यह रूपात्मक रूप से समान है लेकिन मुख्य नाभिक से छोटा है; यहां तक कि सबसे बड़ा एमएन मुख्य नाभिक के व्यास के 1/3 से अधिक नहीं हो सकता है। एमएन को केवल तभी स्कोर करें जब यह मुख्य नाभिक को नहीं छूता है या कम से कम माइक्रोन्यूक्लियर सीमा मुख्य नाभिक की सीमा से अलग होती है।

Representative Results

प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता को मान्य करने के लिए, हमने 17 से 65 वर्ष की आयु के 30 स्वस्थ स्वयंसेवकों के क्रायोप्रेज़र्व्ड रक्त नमूनों पर एमएन परख का प्रदर्शन किया। समूह की औसत आयु 35 वर्ष है। क्रायोप्रिजर्वेशन का समय 1 सप्ताह से 154 सप्ताह तक था। पूरे रक्त कोशिका संस्कृति को विभिन्न विकिरण खुराक (0.5, 1, और 2 Gy) में उजागर करने के बाद, 1,000 बीएन कोशिकाओं में माइक्रोन्यूक्लिआई उपज की जांच माइक्रोस्कोप के तहत की गई थी। अच्छी तरह से गोल द्विकेंद्रक कोशिकाओं ( चित्रा 2 में देखा जा सकता है) क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों से स्वस्थ व्यवहार्य कोशिकाओं की एक सफल पुनर्प्राप्ति का संकेत मिलता है। ध्यान दें, लिम्फोसाइटों की विकिरण प्रतिक्रिया अल्ट्रा-कम तापमान (तरल नाइट्रोजन) पर दीर्घकालिक भंडारण के बाद स्थिर रही। यह अवलोकन ताजा रक्त के नमूनों से अपेक्षित प्रतिक्रिया के अनुरूप है।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोन्यूक्लिय, जैसा कि द्विकेंद्रक कोशिकाओं में देखा गया है, एक जमे हुए पूरे रक्त के नमूने से प्राप्त किया गया था जिसे 1 साल पहले क्रायोप्रेज़र्व्ड किया गया था। (ए) आवर्धन 200x, (बी) आवर्धन 400x; MNs की ओर इशारा करते हुए तीर. स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विकिरण (0.5, 1, और 2 Gy) की बढ़ी हुई खुराक के साथ, माइक्रोन्यूक्लियस उपज में एक रैखिक-द्विघात वृद्धि देखी गई(तालिका 1 और चित्रा 3)। नकली विकिरणित नियंत्रण नमूनों (0 Gy) में MN पैदावार पृष्ठभूमि MN पैदावार का प्रतिनिधित्व करती है जो मुख्य रूप से लैगिंग गुणसूत्रों का परिणाम होती है।

खुराक (Gy) 0 0.5 1 2
औसत निकालना 18 107 247 601
एसडी 10.8 23.9 53.3 101.1
सीवी (%) 59.9 22.3 21.6 16.8
श्रेणी 5-41 62-140 139-324 395-755

तालिका 1: औसत एमएन उपज के साथ भिन्नता की सीमा और गुणांक, जैसा कि 30 स्वस्थ दाताओं के क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त नमूनों में देखा गया है, अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का संकेत। संक्षिप्ताक्षर: CV = भिन्नता का गुणांक; SD = मानक विचलन।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोन्यूक्लिआई पैदावार जैसा कि नियंत्रण में देखा गया है और 30 दाताओं के विकिरणित क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त के नमूने। क्रायोप्रिजर्वेशन अवधि 1 सप्ताह से 154 सप्ताह तक थी। स्कैटर प्लॉट ग्राफ व्यक्तिगत मूल्यों को दर्शाता है। समूहों में रेखाएँ समूह के माध्य ± SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। संक्षिप्ताक्षर: MN = माइक्रोन्यूक्लिय; BN = द्विकेंद्रक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

व्यक्तियों की एमएन उपज में अंतर-वैयक्तिक भिन्नता की जांच करने के लिए, भिन्नता (सीवी) के गुणांक की गणना की गई थी ( तालिका 1 देखें)। विकिरण-प्रेरित MN के लिए, सभी खुराक (0.5, 1, और 2 Gy) के लिए 25% < एक CV प्राप्त किया गया था, जो संशोधित प्रोटोकॉल की अच्छी प्रजनन क्षमता को इंगित करता है।

Discussion

सीबीएमएन परख के आवेदन के लिए संशोधित प्रोटोकॉल थोक में रक्त के नमूनों को स्टोर करने का एक अपेक्षाकृत आसान और सुविधाजनक तरीका है। प्रक्रिया सभी मिनट लेकिन महत्वपूर्ण विवरणों की रूपरेखा तैयार करती है जिन्हें क्रायोप्रिजर्वेशन और सीबीएमएन परख के दौरान ध्यान रखने की आवश्यकता होती है। अन्य लैब प्रोटोकॉल सामान्य रूप से फ्रीजिंग मिश्रण में 10% DMSO का उपयोग करते हैं, जबकि हमारे फ्रीजिंग मिश्रण में 80% FCS7 के साथ 20% DMSO होता है। चूंकि यह ठंड मिश्रण पूरे रक्त के नमूने में समान मात्रा में जोड़ा जाता है, अंतिम एकाग्रता भी 10% डीएमएसओ है। सेल जीवित रहने की दर में सुधार करने और कोशिका विभाजन को प्रोत्साहित करने के लिए, हम पूर्ण संस्कृति माध्यम (सीआरपीएमआई) में 1% सोडियम पाइरूवेट और 0.1% बीटा-मर्कैप्टोथेनॉल जोड़ते हैं। यह हमारे शोध समूह 6,8 द्वारा स्थापित सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के अनुसार है.

हालांकि विगलन करते समय सेल क्लंपिंग की समस्या को इस प्रोटोकॉल में पूरी तरह से हल नहीं किया जा सका, सेल अलगाव अन्य पारंपरिक प्रोटोकॉल से बेहतर था। विगलन के बाद कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए संस्कृति मीडिया के लगातार, अचानक जोड़ के बजाय, हमने बेहतर परिणाम प्राप्त किए जब धोने के चरणों के दौरान प्रीवार्म्ड पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) को ड्रॉपवाइज जोड़ा गया था। यह सुधार सेलुलर तनाव को कम करने में मदद करता है और कोशिकाओं की एक सिद्ध उच्च वसूली के साथ क्लंपिंग को कम करता है। इसके अलावा, आरपीएमआई पर पीबीएस का उपयोग किए जाने पर सेल व्यवहार्यता में कोई स्पष्ट अंतर नहीं देखा जा सकता है। यह क्रायोप्रिजर्वेशन अवधि (1 वर्ष तक) की लंबाई एमएन पैदावार को प्रभावित नहीं करेगी, दोनों विकिरणित और गैर-विकिरणित नमूनों 6,8 में, समूह द्वारा मान्य किया गया है। अध्ययनों से पता चलता है कि पीबीएमसी की अच्छी सेल व्यवहार्यता और प्रसार कम तापमान (तरल नाइट्रोजन) पर क्रमिक ठंड के साथ प्राप्त किया जा सकता है, इसके बाद10,11 विगलन करते समय प्रीवार्म्ड माध्यम के क्रमिक जोड़ के बाद। शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि पिघले हुए पूरे रक्त में टी-लिम्फोसाइटों की उप-आबादी पिघले हुए पीबीएमसी12 में देखी गई लोगों के बराबर है। इसके अलावा, यह साबित होता है कि क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों से बरामद सेल उपप्रकार ताजा पूरे रक्त के नमूनों13,14में देखे गए लोगों के समान हैं।

यदि हम रिपोर्ट में प्राप्त सांकेतिक परिणामों की जांच करते हैं, तो हम देखते हैं कि खुराक के साथ रैखिक द्विघात वृद्धि (चित्रा 3) रैखिक ऊर्जा हस्तांतरण (एलईटी) प्रेरित माइक्रोन्यूक्लिआई15,16 पर अन्य साहित्य रिपोर्टों के साथ समझौते में है। क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त के नमूनों (तालिका 1) में देखी गई एमएन पैदावार में परिवर्तनशीलता ताजा पूरे रक्त संस्कृतियों 8,17,18 के लिए रिपोर्ट की गई सीमा में है। यहाँ विस्तार से वर्णित प्रोटोकॉल 20 स्वस्थ स्वयंसेवकों8 के ताजा और cryopreserved पूरे रक्त पर मान्य किया गया था. परमाणु विभाजन सूचकांक (एनडीआई), जो उस रिपोर्ट8 में मनाया सेल प्रसार का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, ताजा पूरे रक्त19,20 के लिए सुझाए गए एक के साथ समझौते में था। एक साथ लिया, पूरे रक्त और संशोधित micronucleus परख के cryopreservation के इस अनुकूलित प्रोटोकॉल एक बेहतर सेल उपज प्रदान करता है और इसलिए, रेडियोसंवेदनशीलता आकलन के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन की सिफारिश की है. चूंकि प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता पहले से ही8 मान्य किया गया है, इसलिए बड़े पैमाने पर और बहु-केंद्र अध्ययनों में प्रयोज्यता का सुझाव दिया गया है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अपने तकनीकी समर्थन के लिए एल पीटर्स, टी थिरोन और जी डी स्मेट को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम उन सभी स्वयंसेवकों के शुक्रगुजार हैं जिन्होंने अध्ययन के लिए रक्तदान किया। इस काम को ग्रांट (T000118N) के तहत रिसर्च फाउंडेशन- फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Greiner 188271
24-well cell suspension plate  VWR 734-2779
96% alcohol ChemLab CL00.1807.2500
Acetic acid Merck life science 8,18,75,52,500
Acridine orange Merck life science 235474-5g
CaCl2 Merck life science C5670-100g
cover slips VWR 631-1365 22 x 50
Cryobox (Mr.Frosty) Nalgene, Sigma Aldrich
Cryovials 2ml Novolab A04573
Cytochalsin B  Merck life science C6762-10 10 mg
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Merck life science D4540-500ml
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fischer scientific 10270-106
Fixative 1 Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5
Fixative 2 Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1
GURR buffer Thermo Fischer scientific 10582013 phosphate buffer (pH 6.8)
KCl Merck life science 1,04,93,60,250 75 mM
KH2PO4 Merck life science 1,04,87,30,250
Li-heparin tubes BD Life sciences 367526-LH170 I.U. BD Vacutainer
Methanol fisher scinetific M/4000/17
Na2HPO2 Merck life science 10,65,80,500
NaCl Merck life science S7653-1kg
Object slides VWR MENZAA00000112E04
Penicillin/Streptomycin Thermo Fischer scientific 15140-122 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL
Phytohemagglutinin (PHA-M) Thermo Fischer scientific 10576-015
Ringer solution contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water
RPMI-1640 Thermo Fischer scientific 52400041
Silicon rubber adhesive sealent collall CF-100
Sodium pyruvate Thermo Fischer scientific 11360039
Sterile warm PBS (37 °C) contains NaCl,  Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water
β-mercaptoethanol Thermo Fischer scientific 31350-010

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References

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क्रायोप्रेज़र्व्ड होल ब्लड पर माइक्रोन्यूक्लियस परख
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Dayal, R., Beyls, E., Vral, A., Baeyens, A. The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood. J. Vis. Exp. (204), e65855, doi:10.3791/65855 (2024).

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