Summary
Her presenterer vi en optimalisert protokoll for cytokinese-blokk mikronukleusanalysen på kryopreserverte fullblodprøver. Denne optimaliserte metoden for kryopreservering av fullblod for mikronukleusanalyse er en pålitelig teknikk for storskala prøvetaking og multisenterstudier, og kan også brukes til andre blodrelaterte analyser.
Abstract
In vitro cytokinesis-blokk mikronukleus (CBMN) analysen er en mye brukt teknikk i radiobiologisk forskning, biologisk dosimetri, gentoksisitetsstudier og in vitro radiosensitivitetstesting. Denne cytogenetiske metoden er basert på påvisning av mikrokjerner i binukleerte celler som følge av kromosomale fragmenter som henger etter under celledeling. Ferske fullblodprøver er den mest foretrukne prøvetypen for CBMN-analysen. Ulempene ved å arbeide med ferske blodprøver inkluderer imidlertid umiddelbar behandling etter blodprøvetaking og det begrensede antallet gjentatte analyser som kan utføres uten ekstra blodprøvetaking.
Siden behovet for ferske blodprøver kan være logistisk utfordrende, vil CBMN-analyse på kryopreserverte fullblodprøver være til stor fordel, spesielt i store pasientstudier. Dette papiret beskriver en protokoll for å fryse hele blodprøver og å utføre CBMN-analysen på disse frosne blodprøvene. Blodprøver fra friske frivillige har blitt frosset og tint på forskjellige tidspunkter og deretter utsatt for en modifisert mikronukleusanalyseprotokoll. Resultatene viser at denne optimaliserte prosedyren tillater utførelsen av CBMN-analysen på frosne blodprøver. Den beskrevne kryopreserveringsprotokollen kan også være svært nyttig for andre cytogenetiske analyser og en rekke funksjonelle analyser som krever prolifererende lymfocytter.
Introduction
Helt siden oppdagelsen har bruken av ioniserende stråling (IR) vært et spørsmål om debatt blant forskere på grunn av dets negative effekter på levende vesener. Den skadelige effekten manifesteres vanligvis av DNA-skader som dobbeltstrengede brudd (DSB), og manglende reparasjon av disse DSBene fører til kromosomavvik og mutasjoner, som er viktige kjennetegn på kreft 1,2. Slike kromosomavvik kan undersøkes ved cytogene analyser som cytokinese-blokk mikronukleus (CBMN) analyse. Mikrokjerner er laggende kromosomale fragmenter som ikke kan inkorporeres i datterkjerner og derfor blir etterlatt under mitose.
CBMN er en vanlig brukt, pålitelig cytogenetisk teknikk for å vurdere kromosomskader hos individer utsatt for in vivo eller in vitro ioniserende stråling. Enten ferskt fullblod eller isolerte mononukleære celler i perifert blod (PBMC) kan brukes i CBMN-analysen. Friskt fullblod er for det meste det biologiske materialet du velger, siden isolering og behandling av PBMC kan være tidkrevende og ledsages av tap av serumplasma som fungerer som støttemedium for celleoverlevelse og vekst. For å oppnå et godt binucleated celleutbytte, bør friskt fullblod behandles umiddelbart etter innsamling. Behovet for umiddelbar behandling kan imidlertid være logistisk utfordrende under tidspress. Videre, når mange prøver skal samles over en lengre periode eller samles inn på punkter borte fra behandlingssentrene, kan lagring av ferske blodprøver være en begrensende faktor 3,4.
Videre, for å tillate gjentatt MN-analyse hos samme person/pasient, vil frysing av blodprøver være gunstig. En måte å lagre lymfocytter for senere bruk av CBMN-analysen er ved å fryse isolerte PBMCer 5,6. Denne teknikken krever imidlertid flere behandlingstrinn før PBMC-ene kan fryses. Derfor vil kryopreservering av fullblod representere et enkelt og tidseffektivt alternativ til kryopreservering av isolerte PBMCer. Det foreligger lite informasjon om bruk av frosset fullblod til cytogenetiske analyser eller analyser som krever spredning av lymfocytter. Bare ett papir rapporterer bruk av kryopreservert fullblod for metafaseanalyse7.
Siden kryopreservering av fullblod ville gi mange fordeler innen biomonitorering, biodosimetri og radiosensitivitetsvurdering, optimaliserte vår gruppe en kryopreserveringsprotokoll for fullblod som tillater anvendelse av CBMN-analysen8. Vi viste at lymfocytter tilstede i kryopreserverte fullblodskulturer beholder sin genomiske integritet og proliferasjonskapasitet i minst 1 år. I dette metodepapiret beskriver vi i detalj kryopreserveringsprosedyren og CBMN-analyseprotokollen, som ble optimalisert av Beyls et al.8, og rapporterer funn oppnådd for frosne blodprøver av 30 friske individer. For CBMN-analysen ble blodkulturene bestrålt in vitro med doser på 0,5, 1 og 2 Gy for å vurdere MN-responsen i lymfocytter av kryopreserverte fullblodprøver.
Protocol
For denne studien ble blodprøver samlet inn ved venepunktur fra 30 friske givere i alderen mellom 17 og 65 år. MN-data fra 20 givere ble gjenbrukt fra papiret til Beyls et al.8 Innsamling av blodprøver er i samsvar med retningslinjene fra etikkomiteen ved Ghent universitetssykehus (registreringsnummer: 2019/1565), Belgia. Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra alle deltakerne. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. Innsamling av blodprøver
- Før du starter, sørg for at skriftlig informert samtykke fra deltakerne er tilgjengelig og etiske retningslinjer følges på riktig måte.
- Samle blod i Li-heparinrør og oppbevar ved romtemperatur til klar for behandling for kryopreservering.
2. Kryopreservering av fullblod
MERK: Alle trinnene frem til cellehøsting utføres aseptisk i steril laminær luftstrøm.
- For å kryobevare 1 ml blod, lag 1 ml frysemedium ved å blande 800 μL Fetal Calf Serum (FCS) og 200 μL dimetylsulfoksid (DMSO).
MERK: Frysemediet fremstilles i et volum som tilsvarer blodprøvene som må fryses. - For kryopreservering av fullblod, overfør blodprøven fra det hepariniserte røret til 15 eller 50 ml sentrifugerør
MERK: Kapasiteten til røret avhenger av volumet av blodet. - Vortex blodet ved lav hastighet med kontinuerlig, men dråpevis tilsetning av et likt volum frysemedium.
- Overfør 2 ml blodfryseblanding til kryovialer (2 ml) hvor hver alikot har 1 ml blodprøve blandet med 1 ml fryseblanding.
- Trinnvis gradvis frysing
- Overfør kryovialer til en kryoboks som inneholder isopropanol og sett i fryser (-80 °C) over natten.
- Overfør kryovialene til flytende nitrogen for langvarig bruk.
3. Tining av kryopreservert blod
MERK: For å begrense den totale tineprosessen, bør maksimalt 8 kryovialer (2 ml hver) håndteres om gangen.
- Forberedelse
- Forvarm 200 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) til 37 °C før blodet tines.
- Forbered en arbeidsløsning av det nødvendige kulturmediet under sterile forhold. Sørg for at medium per kultur inkluderer 1,6 ml komplett medium: Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) media supplert med penicillin / streptomycin (0,5%), 0,2 ml FCS, 20 μL natriumpyruvat og 2 μL β-merkaptoetanol.
MERK: Siden et betydelig antall blodceller kan gå tapt under tining, blir det tinte blodet dyrket i små brønner som 24-brønnsplater med et totalt volum på 2 ml. En multibrønnplate per dose brukes. - For hver dyrkningsbrønn angis donorkoden og A/B på lokket sammen med dato og dose, som foreslått nedenfor (figur 1).
Figur 1: Foreslått utforming av en 24-brønns plate for å dyrke fullblod for mikronukleusanalysen. Merk brønnene og angi donorkodene på passende steder på lokket. For hver pasientprøve bør dupliserte brønner ligge ved siden av hverandre. Merk at det er en suggestiv layout for en 10 x 10 kollimator og kan endres i henhold til størrelsen på kollimatoren eller prøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Trinn for tining og dyrking av fullblod
- Varm vannbadet til 37 °C.
- Ta ut de nødvendige kryovialer fra flytende nitrogen (tallet avhenger av kravene, for eksempel antall doser).
MERK: En kryovial inneholder 1 ml blod og 1 ml frysemedium. Derfor kan to kulturer settes opp med blod fra en kryovial. - Tine kryovialene delvis i varmtvannsbadet (til små iskrystaller fortsatt er sett).
- Ta ut hetteglassene fra vannbadet og rengjør utsiden av hetteglassene med sterilt silkepapir.
- Åpne hetteglassene svært langsomt i en steril avtrekk med laminær luftstrøm for å hindre at luftbobler som dannes inne i slangene, søles ut.
- Løft innholdet i hvert hetteglass godt og overfør dem individuelt til et 15 ml konisk sentrifugerør (1 tube per hetteglass).
- Tilsett dråpevis 1 ml varm (37 °C) PBS til de respektive tubene mens du forsiktig virvler røret. Heng opp igjen med en P1000-pipette.
- For fortynning og jevn vask, tilsett dråpevis 7 ml forvarmet PBS (37 °C) og resuspender med en P1000-pipette.
- Sentrifuger blodet i 8 minutter ved 180 × g (med innstilling ved akselerasjon 1, brems 1) ved romtemperatur.
- I løpet av dette ventetrinnet, fyll de tomme brønnene (bortsett fra den der celler vil bli dyrket) med 500 μL PBS.
- Plasser brønnplatene tilbake i inkubatoren for å forvarme.
- Når sentrifugeringen er fullført, fjern supernatanten forsiktig, og etterlater ca. 1 ml for å unngå å forstyrre cellepelleten.
- Heng opp pelleten på nytt i den gjenværende supernatanten med en P1000-pipette.
- Tilsett dråpevis 8 ml varm PBS (37 °C) i de respektive rørene mens du forsiktig virvler rørene. Etterpå henges du opp igjen med en P1000-pipette.
- Sentrifuger det resuspenderte blodet i 8 minutter ved 180 × g (med innstilling ved akselerasjon 9, brems 9).
- I løpet av dette ventetrinnet overfører du 200 μL kulturmedium til hver av de merkede brønnene.
- Hold platene tilbake i inkubatoren slik at de holder seg ved 37 °C.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten i en kontinuerlig bevegelse (for å unngå å forstyrre den løse cellepelleten), men etterlat ca. 80 μL av supernatanten.
- Til pelleten, tilsett 280 μL FCS (romtemperatur) og resuspender (til et totalt volum på 360 μL).
- Overfør 180 μL av cellesuspensjonen til hver brønn og resuspender (= 0,5 ml "blod"/kultur). Totalvolumet i hver brønn er nå 380 μL, noe som resulterer i et 2 mm medium lag.
- Inkuber platene i en CO2 -inkubator ved 37 ° C i minst 10 minutter før bestråling.
4. G0 MN-analyse
- Ta ut platene fra inkubatoren og bestråle cellekulturen med nødvendige doser som 0,5, 1 og 2 Gy røntgenstråler (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) ved romtemperatur. Bruk falske bestrålte prøver som kontroller for å identifisere spontane MN-utbytter.
- Umiddelbart etter bestråling, tilsett 1,62 ml dyrkningsmedium (37 °C) til hver brønn.
- For å stimulere celledeling i T-lymfocytter, tilsett 40 μL fytohemagglutinin (PHA) til hver brønn og resuspender grundig.
- Plasser disse platene tilbake i inkubatoren (5% CO2, 37 ° C).
MERK: Dette vil være starttidspunktet for analysen. - Blokker cytokinesen 23 timer etter stimulering ved å tilsette 8 μL cytochalasin B (6 μg / ml) per brønn og resuspendere riktig.
- Høst cellekulturene 70 timer etter stimulering/dyrkningstid. Resuspender og overfør cellene til et 15 ml rør. Skyll hver brønn med 2 ml PBS og tilsett denne PBS til det respektive 15 ml røret.
- Sentrifuger rørene i 8 minutter ved 180 × g, ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, men la ca. 500 μL ligge over pelleten.
- Virvel pelleten (på full hastighet) og tilsett sakte dråpevis 2 ml kaldt kaliumklorid (KCl, 4 °C) mens du virvler.
- Sentrifuge cellene umiddelbart ved 180 × g i 8 minutter.
- Kast supernatanten, og etterlater ca. 500 μl av supernatanten.
- Vortex pelleten (på full hastighet) og mens du virvler, tilsett sakte dråpevis 2 ml kaldt fikseringsmiddel 1 (metanol / eddiksyre / ringeroppløsning i forholdet 4: 1: 5).
- La prøvebeholderne stå over natten ved 4 °C (minimum 12 timer og maksimum 96 timer).
- Sentrifuge i 8 min ved 180 × g.
- Kast supernatanten.
- Virvel pelleten (på full hastighet) og tilsett sakte dråpevis 2 ml kaldt fikseringsmiddel 2 (metanol / eddiksyre i forholdet 4: 1).
- Sentrifuge i 8 min ved 180 × g.
- Kast supernatanten.
- Virvel pelleten (på full hastighet) og tilsett deretter sakte (dråpevis), mens du virvler 2 ml kaldt fikseringsmiddel 2 til pelleten.
- La prøvebeholderne stå ved 4 °C (minimum 12 timer og maksimum 96 timer).
- Rengjør lysbildene med isopropanol og merk dem ordentlig.
MERK: Bruk trykte klistremerker til å merke som markørblekk lett tørkes av under behandling. - Sentrifuger prøverørene i 8 minutter ved 180 × g.
- Overfør supernatanten til et annet rør for å konsentrere cellene i henhold til pelletens størrelse.
- Vortex pelleten.
- Slipp 40 μL av de faste cellene på et tørt og rent lysbilde.
- La lysbildene tørke ved romtemperatur. Lagre lysbildene i en boks eller flekk umiddelbart for observasjon.
5. Akridin oransje (AO) farging
- Dypp lysbildene i AO-flekk i 1 min, etterfulgt av en rask vask i destillert vann, og legg deretter lysbildene i fosfatbuffer (pH 6,8) i 1 min.
- Ta ut lysbildene fra bufferløsningen og med rent silkepapir, tørk baksiden av lysbildene og legg lysbildene på et rent silkepapir.
- Slipp 20 μL av fosfatbufferen på toppen av lysbildet og dekk det forsiktig med et rent deksel, unngå luftbobler.
- Forsegl disse lysbildene med silikonsement.
MERK: Siden AO er lysfølsom og falmer over tid, anbefales det å score lysbildene innen 5 dager etter farging for en fin kontrast og fluorescens. Oppbevar alltid lysbilder i et kaldt rom (4 °C) når de ikke er undersøkt.
6. Scoring farget lysbilder
- Plasser lysbildet under et fluorescensmikroskop og undersøk 1000 binucleated celler (BN). Manuelt telle MN, som er en av de seks biomarkørene for toksisitet. For å gjøre det, la to uavhengige scorere undersøke 500 BN-celler / lysbilde under samme forstørrelse.
MERK: Følgende er noen høydepunkter av scoringskriteriene, som anbefalt av Fenech for å score de fargede lysbildene9- Velg en BN-celle ved å se etter pent avrundede celler med intakt cytoplasma, med to velstående kjerner av omtrent samme størrelse, vanlig form og fargemønster. Sørg for at cytoplasma av BN-cellen skiller seg fra cytoplasma i den tilstøtende cellen.
- Score en MN, og merk at den er morfologisk identisk med, men mindre enn hovedkjernene; selv den største MN kan ikke være mer enn 1/3 av diameteren til hovedkjernene. Score en MN bare hvis den ikke berører hovedkjernene, eller i det minste kan den mikronukleære grensen skille seg fra grensen til hovedkjernene.
Representative Results
For å validere reproduserbarheten av protokollen, utførte vi MN-analysen på kryopreserverte blodprøver fra 30 friske frivillige i alderen mellom 17 og 65 år. Gjennomsnittsalderen i gruppen er 35 år. Kryopreserveringstiden varierte fra 1 uke til 154 uker. Etter å ha eksponert hele blodcellekulturen for forskjellige stråledoser (0,5, 1 og 2 Gy), ble mikrokjerneutbyttet i 1000 BN-celler undersøkt under et mikroskop. Pent avrundede binukleerte celler (som det fremgår av figur 2) indikerer en vellykket uthenting av friske levedyktige celler fra kryopreserverte fullblodprøver. Merk at strålingsresponsen til lymfocytter forblir stabil etter langvarig lagring ved ultralave temperaturer (flytende nitrogen). Denne observasjonen er i tråd med responsen som forventes fra ferske blodprøver.
Figur 2: Mikrokjerner observert i binukleerte celler hentet fra en frossen helblodprøve som ble kryopreservert for 1 år siden. (A) Forstørrelse 200x, (B) Forstørrelse 400x; Piler som peker mot MN-ene. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved økte stråledoser (0,5, 1 og 2 Gy) ble det observert en lineær-kvadratisk økning i mikronukleusutbyttet (tabell 1 og figur 3). MN-utbyttet i falske bestrålte kontrollprøver (0 Gy) representerer bakgrunnen MN-utbytter som hovedsakelig er et resultat av forsinkede kromosomer.
| Dose (Gy) | 0 | 0.5 | 1 | 2 |
| Gjennomsnitt | 18 | 107 | 247 | 601 |
| SD | 10.8 | 23.9 | 53.3 | 101.1 |
| CV (%) | 59.9 | 22.3 | 21.6 | 16.8 |
| Rekkevidde | 5-41 | 62-140 | 139-324 | 395-755 |
Tabell 1: Variasjonskoeffisient og koeffisient sammen med gjennomsnittlig MN-utbytte, som observert i kryopreserverte fullblodsprøver fra 30 friske givere, noe som indikerer interindividuell variasjon. Forkortelser: CV = variasjonskoeffisient; SD = standardavvik.
Figur 3: Mikrokjerner gir som observert i kontroll og bestrålte kryopreserverte fullblodprøver av 30 givere. Kryopreserveringsperioder varierte fra 1 uke til 154 uker. Punktdiagram viser individuelle verdier. Linjer i klynger representerer gruppens gjennomsnittlige ± SD. Forkortelser: MN = mikrokjerner; BN = binucleated. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å undersøke den interindividuelle variasjonen i MN-avkastning av personer ble variasjonskoeffisienten (CV) beregnet (se tabell 1). For stråleindusert MN ble det oppnådd en CV < 25 % for alle doser (0,5, 1 og 2 Gy), noe som indikerer god reproduserbarhet av den modifiserte protokollen.
Discussion
Den modifiserte protokollen for anvendelse av CBMN-analysen er en relativt enkel og praktisk måte å lagre blodprøver i bulk. Prosedyren skisserer alle de små, men viktige detaljene som må tas vare på under kryopreservering og CBMN-analysen. Andre laboratorieprotokoller bruker normalt 10% DMSO i fryseblandingen, mens fryseblandingen vår inneholder 20% DMSO sammen med 80% FCS7. Da denne fryseblandingen tilsettes i like store mengder til hele blodprøven, er den endelige konsentrasjonen også 10% DMSO. For å forbedre celleoverlevelsen og stimulere celledeling tilsetter vi 1% natriumpyruvat og 0,1% beta-merkaptoetanol til det komplette dyrkningsmediet (cRPMI). Dette er i samsvar med cellekulturprotokollen etablert av vår forskningsgruppe 6,8.
Selv om problemet med celleklumping under tining ikke kunne løses fullstendig i denne protokollen, var cellesegregering bedre enn de andre konvensjonelle protokollene. I stedet for konsekvent, brå tilsetning av dyrkningsmedier for å gjenvinne celler etter tining, oppnådde vi bedre resultater når forvarmet PBS (37 °C) ble tilsatt dråpevis under vasketrinnene. Denne forbedringen bidrar til å redusere cellulær stress og minimerer klumping med påvist høy utvinning av celler. Videre kunne ingen klar forskjell i cellenes levedyktighet observeres når PBS ble brukt over RPMI. Det har blitt validert av gruppen at lengden på kryopreserveringsperioden (opptil 1 år) ikke vil påvirke MN-utbyttet, både i bestrålte og ikke-bestrålte prøver 6,8. Studier tyder på at god cellelevedyktighet og spredning av PBMC kan oppnås med gradvis frysing ved lave temperaturer (flytende nitrogen), etterfulgt av gradvis tilsetning av forvarmet medium mens tining10,11. Forskere har vist at underpopulasjonene av T-lymfocytter i tint fullblod er sammenlignbare med de som er observert i tinte PBMC12. Videre er det bevist at cellesubtyper gjenvunnet fra kryopreserverte fullblodprøver ligner de som er observert i ferske hele blodprøver13,14.
Ser vi på de veiledende resultatene i rapporten, ser vi at den lineære kvadratiske økningen med dose (figur 3) stemmer overens med andre litteraturrapporter om lineær energioverføring (LET)-induserte mikrokjerner15,16. Variasjonen i MN-utbytte observert i de kryopreserverte fullblodsprøvene (tabell 1) er i området med den som er rapportert for ferske fullblodskulturer 8,17,18. Protokollen beskrevet i detalj her ble validert på ferskt og kryopreservert fullblod av 20 friske frivillige8. Nukleær divisjonsindeks (NDI), som er en viktig parameter for celleproliferasjon observert i den rapporten8, var i samsvar med den som ble foreslått for friskt fullblod19,20. Samlet sett gir denne optimaliserte protokollen for kryopreservering av fullblod og modifisert mikronukleusanalyse et bedre celleutbytte, og derfor anbefales tilpasning av denne protokollen for radiosensitivitetsvurderinger. Siden reproduserbarheten av protokollen allerede er validert8, foreslås det å ha anvendelighet i store og multisenterstudier.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke L. Pieters, T. Thiron og G. De Smet for deres tekniske støtte. Vi er takknemlige for alle frivillige som donerte blod til studien. Arbeidet ble støttet økonomisk av Research Foundation-Flanders (FWO) under Grant (T000118N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
| 24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
| 96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
| Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
| Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
| CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
| cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
| Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
| Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
| Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
| Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
| Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
| GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
| KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
| KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
| Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
| Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
| Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
| NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
| Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
| Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
| Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
| RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
| Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
| Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
| β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |
References
- Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors. Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).
- Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. Radiation-induced cell death and its mechanisms. Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).
- Roederer, M., et al. The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis. Cell. 161 (2), 387-403 (2015).
- Bankoglu, E. E., et al. Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay. Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).
- Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method. Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).
- Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells. Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125 (2020).
- Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies. Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).
- Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood. International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).
- Fenech, M.
- Ramachandran, H., et al. Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies. Cells. 1 (3), 313-324 (2012).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).
- Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).
- Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).
- Braudeau, C., et al. An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).
- Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response. Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).
- Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure. Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).
- Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability. Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).
- Pajic, J., et al. Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays. Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).
- Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).
- Miszczyk, J., Rawojć, K. Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation. International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).
