Summary
该方案描述了一种用于评估过敏性鼻炎大鼠模型的多色免疫荧光技术。
Abstract
过敏性鼻炎 （AR） 是一种慢性、非感染性鼻粘膜炎症性疾病，主要由特异性免疫球蛋白 E （IgE） 介导，影响全球约 10%-20% 的人口。虽然免疫荧光 （IF） 染色长期以来一直是检测疾病特异性蛋白质表达的标准技术，但传统的 IF 技术在检测同一样品中三种或更多蛋白质的表达水平的能力方面受到限制。因此，近年来开发了多色IF技术，可以同时标记细胞或组织中的多个靶标。
该协议全面概述了建立AR大鼠模型，获取鼻粘膜样本以及多色免疫荧光技术程序的过程。AR组所有大鼠均出现打喷嚏、流鼻涕、鼻痒等典型症状，行为观察得分为≥5分。苏木精和伊红 （H&E） 染色显示 AR 组的炎症细胞计数增加并破坏鼻粘膜完整性。多色免疫荧光（mIF）显示AR大鼠鼻黏膜组织中RORγt和TICAM-1的表达增加，而Foxp3的表达降低。
Introduction
过敏性鼻炎 （AR） 是一种慢性、非感染性鼻粘膜炎症性疾病，主要由特异性免疫球蛋白 E （IgE） 介导1,2。它的特点是打喷嚏、流鼻涕、鼻塞和鼻痒等症状。随着工业化和城市化，AR的流行率逐渐增加，影响了全球约10%-20%的人口1。免疫荧光 （IF） 技术是一种利用抗体-抗原结合反应的荧光染色方法。它可用于检测和定量特定蛋白质在生物组织或细胞中的分布和表达水平。在AR研究中，IF可以同时检测多个靶点，包括AR相关细胞因子、炎症细胞、受体等，有助于探索AR的发病机制和药物的作用3,4,5,6。
多色免疫荧光 （mIF） 染色过程与传统 IF 非常相似，在每轮染色过程中都增加了一个抗体洗脱步骤。这种修饰能够通过连续的单标记和多轮重新染色同时检测同一组织切片上的多个生物标志物。mIF 基于酪胺信号放大 （TSA），允许重复循环进行 TSA 荧光染色，并使用微波加热去除抗体，同时保留荧光信号 7,8。与传统IF相比，mIF具有以下几个优点：（1）它可以检测传统IF难以识别的弱表达抗原9,10;（2）它提供高质量的染色，并具有更好的信噪比;（3）它允许对组织特异性结构和感兴趣区域进行定量11;（4）多通路多通路有效利用组织，节约有限的病理资源12;（5） 通过 mIF 进行多参数分析，可以更深入地了解组织，揭示隐藏的生物信息13.
总体而言，mIF可以观察同一样品中不同的抗原表达和分布，从而促进靶蛋白的研究。未来，寻求了解多种靶蛋白表达和分布的研究人员将发现这种技术是一个有价值的选择。本研究证明了 mIF 在用 AR 对大鼠鼻粘膜样本进行染色中的应用，并评估了 AR 大鼠模型的建立。
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Protocol
实验方案和程序已获得成都中医药大学行政和动物研究委员会的批准（备案号：2022DL-010）。从商业上获得8周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重为180-200g（见 材料表），并在受控温度（23±2°C）和相对湿度（55%±10%）的自然光/暗循环下饲养。将12只大鼠随机分为两组：对照组和AR组。所有大鼠都适应了这些条件，并在试验前一周免费获得食物和水。
1. AR大鼠模型的建立
- 制备致敏溶液：将 30 mg 卵清蛋白 （OVA） 和 3 g Al（OH）3 悬浮在 100 mL 盐水中（见材料表）14,15。
- 基本致敏：抓住并握住完全清醒的大鼠，使其腹部朝上。用75%酒精浸泡的棉球对腹部进行消毒。使用1.5mL注射器将步骤1.1中制备的1mL敏化溶液注射到AR组大鼠的左腹腔中。每两天重复一次注射，持续14天（图1A）。
注意： 确保大鼠的头部低于尾巴的位置，以防止插入注射器时对大肠和小肠造成损伤。注射部位位于距腹侧中线 1.5 厘米处。对照组大鼠应每两天腹腔注射一次1mL生理盐水，持续14天。 - 鼻腔激发：在基础致敏后的第二天，使用100μL移液管（图1B）通过滴鼻液给予50μL5%OVA，重复此过程7天（图1C）。
注意：通过将 5 g OVA 与 100 mL 盐水混合来制备 5% OVA 溶液。对于对照组，给予相同体积的生理盐水滴剂。
2.大鼠的行为评分
- 在完成最后的鼻腔挑战后30分钟内，根据 表1 中概述的评分标准，使用数码相机观察并记录大鼠，以识别诸如鼻子抓挠，打喷嚏和流鼻涕等症状（图1D）。
注意：AR 建模成功的确认基于总分达到 ≥5 分14。
3. 鼻粘膜样本的采集
- 牺牲大鼠：通过将大鼠暴露于过量的 CO2 来牺牲大鼠。之后，用75%乙醇对大鼠进行消毒（见 材料表）。用手术刀沿着嘴的两个角做一个切口，露出肌肉组织（图2A）。接下来，使用组织剪刀（图2B）切开颅骨两侧的颧骨和下颌骨的关节，并切除下颌骨（图2C）。
- 鼻腔暴露：使用止血器（图2D）分离上颌骨的皮肤以暴露鼻腔（图2E）。用组织剪刀剪断鼻腔和上颌骨之间的骨连接（图2F）。然后，在眶下孔处切断鼻腔和眶骨两侧的连接（图2G）并切除鼻腔（图2H）。
- 固定：将提取的鼻腔置于4%多聚甲醛中进行固定，并在室温下储存24-72小时（见 材料表）。
注意： 确保使用的多聚甲醛固定剂的量足以完全覆盖切片以进行正确固定。
4. 鼻粘膜样本的预处理
- 脱钙：首先固定步骤3.1中去除的组织。用PBS清洗三次，每次20分钟。然后用蒸馏水清洗三次，每次20分钟。随后，在室温下体积为组织20-30倍的脱钙溶液中对组织进行脱钙。
- 脱钙溶液（见 材料表）应保持7.2-7.4的pH值。最后，将脱钙组织放入脱水盒中。
注意：脱钙溶液需要每周更换一次。当组织软化（约2个月）时，脱钙过程可以结束。
- 脱钙溶液（见 材料表）应保持7.2-7.4的pH值。最后，将脱钙组织放入脱水盒中。
- 脱水和打蜡：将脱水箱转移到脱水机中（见 材料表）。从75%酒精开始4小时，然后是85%酒精2小时，90%酒精2小时，95%酒精1小时。
- 随后，将组织浸入无水乙醇中30分钟，再重复该过程30分钟，使用二甲苯5-10分钟，再重复此步骤5-10分钟，将组织浸入蜡中1小时，重复此步骤再一个小时，最后，将组织浸入蜡中再浸入1小时。
- 包埋：将熔化的蜡块放入包埋盒中（见 材料表），并将其储存在-20°C冰箱中。蜡凝固后，将其取出并修剪蜡块。
- 切片：将修剪好的蜡块插入石蜡切片机（见 材料表）并将其切成厚度为 3 μm 的切片。将切片置于载玻片撒布器上的40°C水浴中。将纸巾压平，然后用载玻片将其提起，并在60°C烤箱中烘烤。
- 水蒸发后，蜡正确凝固，取出载玻片并将其储存在25°C的温度下。
5. 鼻粘膜组织的H&E染色
- 脱蜡和水合：将切片置于二甲苯中20分钟，再重复该过程20分钟，无水乙醇5分钟，再重复此步骤5分钟，75%酒精5分钟，最后洗涤5分钟。
- 苏木精染色：使用100μL移液管分配100μL苏木精染色液（见 材料表）3-5分钟，冲洗5-10秒，加入100μL0.5%盐酸乙醇10-30秒，冲洗5-10秒，加入100μL0.2%氨水10-30秒，冲洗30秒。
注意：苏木精染色后，需要用0.5%盐酸乙醇进行分化，以去除与细胞核结合并被细胞质吸收的过量苏木精染料。当进行伊红染色时，细胞核和细胞质将被清晰染色。用0.5%盐酸乙醇分化后，切片会出现红色或粉红色，因此分化后立即冲洗以去除组织切片中的酸以阻止分化。然后，使用0.2%氨水增强核染色。 - 曙红染色：使用100μL移液管分配100μL曙红染色溶液（参见 材料表）5分钟，然后冲洗30秒。
- 脱水和密封：将切片浸入无水乙醇中5分钟，再重复该过程5分钟，再次重复5分钟，二甲基5分钟，二甲苯5分钟。最后，用中性树脂密封（见 材料表）。
- 将染色切片放在显微镜上：将染色切片放在显微镜上，调整显微镜的焦距直到图像清晰可见，将放大倍率设置为40倍，然后捕捉图像。
6.鼻粘膜组织的多色免疫染色
- 脱蜡和水合作用：遵循步骤 5.1 中提到的相同。
- 柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液处理：将柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH 6.0）（见 材料表）放入微波炉安全容器中。将其加热至沸腾，将其取出，然后将载玻片添加到容器中。用中火微波炉加热8分钟至沸腾，关火8分钟，然后改用中低火加热7分钟。
- 自然冷却后，将切片转移到PBS（pH 7.4）中，摇匀，然后使用脱色摇床洗涤三次，每次5分钟。
注意： 确保缓冲液在此过程中不会蒸发，并防止切片变干。
- 自然冷却后，将切片转移到PBS（pH 7.4）中，摇匀，然后使用脱色摇床洗涤三次，每次5分钟。
- 阻断内源性过氧化物酶：干燥切片，用免疫组化笔在组织周围画一个圆圈（以防止抗体流走），并涂抹3%过氧化氢溶液（过氧化氢：纯水=1：9）。
- 在室温下在黑暗中孵育15分钟。自然冷却后，将切片放入PBS（pH 7.4）中，并在脱色摇床上摇动三个循环，每个循环5分钟。
- 封闭：在圆圈内涂抹 5% 山羊血清并孵育 30 分钟。
- 一抗添加：轻轻除去封闭液，切片中加入FOXP3（稀释度：1：200，见 材料表），置于潮湿室中。在4°C孵育过夜。
注意：在潮湿的腔室中加入少量水以防止抗体蒸发。 - 添加二抗：将切片置于PBS（pH 7.4）中，并在脱色振荡器上摇动三个周期，每个周期5分钟。轻轻擦干切片，并在圆圈内应用二抗（山羊抗兔IgG H&L，见 材料表）。在室温下在黑暗中孵育50分钟。
- 酪胺稀释液的制备：将 100 μL 3% H 2 O2 与100 mL 1x TBST 混合（参见材料表）。
- 加入 TSA 工作溶液：将 1 mL 酪胺稀释液与 2 μL CY3-酪胺混合以制备 TSA 工作溶液。向每个切片上100μLTSA工作溶液，并在室温下在黑暗中孵育10分钟。然后，用PBS清洗切片三次，每次5分钟。
注意：立即制备并使用TSA工作溶液，并将其在4°C避光下储存;有效期最长为24小时。 - 重复步骤6.2-6.8：切换到1：200稀释的RORγt（FITC荧光染料），然后切换到1：200稀释的TICAM1（TYP620染料）（参见 材料表）。
- DAPI复染细胞核：轻轻摇动切片干燥，涂上DAPI染色液，在室温下避光孵育10分钟。
- 淬灭自发荧光：将切片置于PBS（pH 7.4）中，并在脱色振荡器上摇动三个周期，每个周期5分钟。将自发荧光淬灭剂（参见 材料表）应用于切片，等待5分钟，然后洗涤10分钟。
- 封闭：将切片置于PBS（pH 7.4）中，并在脱色摇床上摇动三个周期，每个周期5分钟。轻轻摇晃切片以使其干燥，并用抗荧光淬灭剂密封（参见 材料表）。
- 显微镜：将染色切片放在显微镜上，调整显微镜的焦点以获得清晰的可见度，将放大倍率设置为20倍和40倍，然后捕获图像。
注意：DAPI 的紫外激发波长为 330-380 nm，发射波长为 420 nm（蓝光）。FITC的激发波长为465-495 nm，发射波长为515-555 nm（绿光）。CY3 的激发波长为 510-560 nm，发射波长为 590 nm（红光）。TYP-690 的激发波长为 630 nm，发射波长为 690 nm（粉红光）。
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Representative Results
通过OVA腹腔注射和鼻腔激发成功诱导6只SD大鼠进入AR模型。AR组所有大鼠均诱导AR，占该组的100%。AR组所有大鼠均出现打喷嚏、流鼻涕、鼻痒等典型症状。所有行为观察得分≥5分（表2）。
建模第21天H &E染色结果显示，对照大鼠鼻黏膜上皮细胞和纤毛排列良好，无炎症细胞浸润迹象。相反，在AR组中，鼻中隔的粘膜受损并脱落，并伴有明显的中性粒细胞浸润（图3）。
当将AR大鼠的鼻粘膜组织与对照组进行比较时，观察到RORγt（Th17细胞特异性转录因子）和TICAM-1（Toll样受体连接分子-1）的表达增加，而Foxp3（Treg细胞特异性转录因子）的表达降低（图4）。
图1：实验工作流程 。 （A）腹腔注射示意图。（B）滴鼻示意图。（C）过敏性鼻炎大鼠建模流程图。（D）行为观察示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：鼻腔移除过程 。 （A） 切除嘴角的肌肉组织。（B） 切断颧骨和下颌骨之间的连接。（C） 下颌骨分离。（D） 去除上颌骨的皮肤。（E） 暴露鼻腔。（F） 切断鼻腔和上颌骨之间的连接。（G） 切断鼻腔和眼眶骨之间的连接。（H） 切除的鼻腔。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：AR 建模后第 14 天具有代表性的组织病理学 H&E 染色图像 （n = 6）。 （A）对照大鼠鼻黏膜上皮细胞和纤毛排列良好，未观察到炎性细胞浸润。（B）AR组鼻中隔黏膜受损并脱离，伴有中性粒细胞浸润。比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：RORγt、Foxp3 和 TICAM-1 的 MIF 染色分析 （n = 6）。 与对照组相比，AR组大鼠鼻黏膜组织中RORγt和TICAM-1的表达升高，Foxp3的表达降低。比例尺 = 100 μm（左图）;50 μm（右图）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：mIF技术原理。 mIF技术基于TSA技术，该技术涉及将荧光信号共价结合到抗原上。在这个过程中，在二抗上标记的辣根过氧化物酶催化荧光素底物从无活性状态转变为活化状态。这种活化状态可以与抗原上的酪氨酸共价结合，从而导致荧光素与样品的稳定共价连接。随后，通过热修复去除非共价结合的抗体。然后用额外的一抗、二抗和荧光素重复该过程，以检测完全不同的抗原。该图像是参考mIF原理图17重新绘制和颜色匹配的。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 分数 | 打喷嚏频率 | 流鼻涕 | 揉鼻搓 |
| 1 | <3 | 鼻腔内有水样分泌物 | 轻微和偶尔的鼻摩擦 |
| 2 | 4~10 | 水样分泌物从前鼻孔溢出 | 反复揉鼻 |
| 3 | ≥11 | 脸上布满了大量的水样分泌物 | 从鼻子到脸部摩擦 |
表1：大鼠行为试验定量量表。
| 个人 | 第1天 | 第21天 |
| 控制 1 | 0 | 0 |
| 控制措施 2 | 0 | 0 |
| 控制措施 3 | 0 | 0 |
| 控制措施 4 | 0 | 0 |
| 控制措施 5 | 0 | 0 |
| 控制措施 6 | 0 | 0 |
| AR 1 （英语） | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 （英语） | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
表2：行为评分结果。
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Discussion
过敏性鼻炎（AR）是一种非感染性鼻粘膜炎症性疾病，由环境和遗传因素共同引起。它已成为一个全球健康问题，影响工作效率，降低生活质量，损害睡眠、认知功能，并引起烦躁和疲劳。AR 影响着全球 10%-20% 的人口¹，并带来巨大的经济成本，每年在欧盟国家造成高达 30-500 亿欧元的损失18.此外，几项研究已经确定了 AR 与哮喘之间的密切关联18,19,20，患有 AR 的人患哮喘的可能性是没有 AR 的人的七倍 21.目前的研究表明，1 型辅助性 T 细胞 （Th1） 和 2 型辅助性 T 细胞 （Th2） 之间的不平衡偏向于 Th2 细胞是 AR 的重要贡献者。 Th2 细胞在白细胞介素-4 的刺激下产生 Th2 样细胞因子，如 IL-5 和 IL-13，引发 B 淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞的炎症22.此外，最近的 AR 研究表明，辅助性 Th17/调节性 T 细胞 （Treg） 群体的不平衡之间存在密切联系23。Th17 和 Treg 细胞均来源于 CD4+ T 细胞，在免疫系统中起着关键作用。RORγt 对 Th17 细胞分化至关重要24，而具有免疫抑制功能的 Treg 细胞是维持免疫耐受的关键。Foxp3 表达的变化影响 Treg 细胞功能25,26。因此，RORγt 和 Foxp3 水平的改变反映了 Th17/Treg 失衡，可能诱导主要由 Th17 细胞驱动的炎症反应27。Toll样受体（TLR）是人体先天免疫系统中的重要蛋白质，介导细胞内信号通路以激活特定基因表达28。He Shan 等人 29 的研究发现，TLR4 基因的变异，特别是 rs10759930 位点的 CT 杂合和 TT 纯突变，与 AR 发育有关。鉴于 TICAM-1 作为 TLR3 和 TLR4 之间的桥接分子的作用，假设 AR 可能与 TICAM-1 有关。事实上，结果显示 AR 组的 TICAM-1 表达升高，与 Xu 等人的研究一致30。
本研究采用的 mIF（多重免疫荧光）技术是过去 20 年发展起来的一种相对较新的检测方法。与传统的免疫荧光 （IF） 技术相比，它具有多项优势，包括更高的特异性、灵敏度和通量，以及视觉分析能力。该技术基于TSA（酪胺信号放大）方法，该方法将荧光信号共价键合到抗原上，并且不受微波加热的影响。这允许通过重复的 TSA 荧光染色循环对组织进行多色标记，然后微波加热以去除抗体，同时保留荧光信号 17,31,32（图 5）。然后应用高级算法自动识别和分割在多标记图像中显示特定结构的目标组织区域。这使得对感兴趣的区域进行定量统计分析，从而可以对细胞免疫表型和免疫细胞的功能定位进行定量评估。它还提供了有关组织环境和空间分布的信息33,34。
然而，从技术上讲，mIF仍然依赖于传统的IF技术，并面临抗体交叉反应性和光学串扰等挑战。使用多种抗体会导致交叉反应和假阳性结果，而重叠的荧光光谱可能导致来自多个靶标的荧光信号混合，使肉眼区分具有挑战性，并增加对专业图像分析算法的依赖35。此外，由于荧光染料用于标记抗体，mIF可能会受到荧光猝灭和漂白的影响，从而导致信号强度降低。值得注意的是，传统的IF技术评估整个组织，而mIF技术则侧重于组织切片内的特定感兴趣区域进行分析。由于组织异质性，这可能会引入与现实的偏差，可能导致组织学定量不准确或遗漏罕见事件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了四川省科学技术厅（2021YJ0175）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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