Summary
В данном протоколе описана методика многоцветной иммунофлюоресценции для оценки модели аллергического ринита у крыс.
Abstract
Аллергический ринит (АР) – это хроническое неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, в основном опосредованное специфическим иммуноглобулином Е (IgE), поражающее примерно 10-20% населения мира. В то время как иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание уже давно является стандартным методом обнаружения специфической для заболевания экспрессии белков, традиционные методы ИФ ограничены в своей способности обнаруживать уровни экспрессии трех или более белков в одном образце. В связи с этим в последние годы были разработаны многоцветные методы ПЧ, которые позволяют одновременно маркировать несколько мишеней в клетках или тканях.
В этом протоколе представлен всесторонний обзор процесса создания модели АР на крысах, получения образцов слизистой оболочки носа и технических процедур многоцветной иммунофлюоресценции. Все крысы в группе AR демонстрировали типичные симптомы, такие как чихание, насморк и зуд в носу, при этом поведенческие наблюдения набрали ≥5 балла. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выявило увеличение количества воспалительных клеток и нарушение целостности слизистой оболочки носа в группе АР. Многоцветная иммунофлуоресценция (mIF) демонстрировала повышенную экспрессию RORγt и TICAM-1, в то время как экспрессия Foxp3 снижалась в ткани слизистой оболочки носа крыс с АР.
Introduction
Аллергический ринит (АР) – это хроническое неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, преимущественно опосредованное специфическим иммуноглобулином Е (IgE)1,2. Для него характерны такие симптомы, как чихание, насморк, заложенность носа и зуд в носу. По мере индустриализации и урбанизации распространенность АР постепенно увеличивается, затрагивая примерно 10–20% населения мира1. Метод иммунофлуоресценции (ИФ) представляет собой метод флуоресцентного окрашивания, в котором используется реакция связывания антитело-антиген. Он может быть использован для обнаружения и количественной оценки распределения и уровней экспрессии конкретных белков в биологических тканях или клетках. В исследованиях АР ИФ может одновременно обнаруживать несколько мишеней, включая цитокины, связанные с АР, воспалительные клетки, рецепторы и многое другое, что облегчает изучение патогенеза АР и эффектов лекарств 3,4,5,6.
Процесс многоцветного иммунофлуоресцентного окрашивания (mIF) очень похож на традиционный IF, с добавлением этапа элюирования антител во время каждого раунда окрашивания. Эта модификация позволяет одновременно обнаруживать несколько биомаркеров на одном и том же участке ткани с помощью последовательного одиночного мечения и нескольких циклов повторного окрашивания. mIF основан на усилении тирамидного сигнала (TSA), что позволяет проводить повторяющиеся циклы флуоресцентного окрашивания TSA и использовать микроволновый нагрев для удаления антител с сохранением флуоресцентных сигналов 7,8. По сравнению с обычным ИФ, mIF имеет ряд преимуществ: (1) он может обнаруживать слабоэкспрессируемые антигены, которые трудно идентифицировать с помощью обычного IF 9,10; (2) обеспечивает высококачественное окрашивание с улучшенным соотношением сигнал/шум; (3) она позволяет количественно оценить тканеспецифические структуры и области, представляющие интерес11; (4) мультиплексирование нескольких путей эффективно использует ткани и сохраняет ограниченные патологические ресурсы12; (5) многопараметрический анализ с помощью mIF позволяет глубже проникнуть в ткани, выявляя скрытую биологическую информацию13.
В целом, mIF позволяет наблюдать различные экспрессии и распределения антигенов в одном и том же образце, облегчая изучение белков-мишеней. В будущем исследователи, стремящиеся понять экспрессию и распределение нескольких белков-мишеней, найдут этот метод ценным выбором. В данном исследовании демонстрируется применение мИФ для окрашивания образцов слизистой оболочки носа крыс с АР и оценивается создание модели АР на крысах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол эксперимента и процедуры получили одобрение Административного комитета и комитета по исследованиям на животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (регистрационный номер: 2022DL-010). Восьминедельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) массой 180-200 г были получены в промышленных масштабах (см. таблицу материалов) и содержались в естественном цикле света/темноты с контролируемой температурой (23 ± 2 °C) и относительной влажностью (55% ± 10%). Двенадцать крыс были случайным образом разделены на две группы: контрольную группу и группу AR. Все крысы были акклиматизированы к этим условиям и обеспечены свободным доступом к пище и воде в течение одной недели перед испытанием.
1. Создание крысиной модели дополненной реальности
- Приготовление сенсибилизирующего раствора: суспендировать 30 мг овальбумина (OVA) и 3 г Al(OH)3 в 100 мл физиологического раствора (см. таблицу материалов)14,15.
- Базовая сенсибилизация: схватите и удерживайте полностью проснувшуюся крысу брюшком вверх. Продезинфицируйте живот с помощью ватных шариков, пропитанных 75% спиртом. Шприцем объемом 1,5 мл вводят 1 мл сенсибилизирующего раствора, приготовленного на этапе 1.1, в левую брюшную полость крыс группы АР. Повторяйте эту инъекцию один раз в два дня в течение 14 дней (рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова крысы расположена ниже, чем ее хвост, чтобы предотвратить повреждение толстого и тонкого кишечника при введении шприца. Место инъекции расположено в 1,5 см от вентральной срединной линии. Крысы контрольной группы должны получать внутрибрюшинные инъекции по 1 мл физиологического раствора один раз в два дня в течение 14 дней. - Назальный вызов: ввести 50 мкл 5% OVA в виде назальных капель с помощью пипетки объемом 100 мкл (рис. 1B) на следующий день после базальной сенсибилизации, повторяя эту процедуру в течение 7 дней (рис. 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 5% раствор OVA, смешав 5 г OVA со 100 мл физиологического раствора. Для контрольной группы вводят капли такого же объема физиологического раствора.
2. Поведенческий скоринг крыс
- В течение 30 минут после выполнения финального назального теста наблюдайте и записывайте крыс с помощью цифровой камеры, чтобы определить такие симптомы, как расчесывание носа, чихание и насморк, на основе критериев оценки, изложенных в таблице 1 (рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение успешного моделирования дополненной реальности основано на достижении общего балла ≥5 баллов14.
3. Взятие образцов слизистой оболочки носа
- Жертвоприношение крыс: принесите крыс в жертву, подвергнув их передозировкеCO2. После этого продезинфицируйте крыс 75%-ным этанолом (см. таблицу материалов). С помощью скальпеля сделайте надрез вдоль двух уголков рта, чтобы обнажить мышечную ткань (рис. 2А). Далее с помощью тканевых ножниц разрезают суставы скуловой кости и нижней челюсти с обеих сторон черепа (рис. 2Б) и удаляют нижнюю челюсть (рис. 2В).
- Воздействие на полость носа: отделите кожу верхней челюсти с помощью гемостата (рисунок 2D), чтобы обнажить полость носа (рисунок 2E). Разрежьте костное соединение между носовой полостью и верхней челюстью тканевыми ножницами (рис. 2F). Затем разорвите связь между полостью носа и костями глазницы с обеих сторон в подглазничном отверстии (рис. 2G) и удалите полость носа (рис. 2H).
- Фиксация: извлеченную полость носа поместить в 4% параформальдегид для фиксации и хранить при комнатной температуре в течение 24-72 ч (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что количество используемого фиксатора параформальдегида достаточно, чтобы полностью покрыть участки для правильной фиксации.
4. Предварительная обработка образцов слизистой оболочки носа
- Декальцинация: начните с фиксации удаленных тканей из шага 3.1. Вымойте их три раза PBS по 20 минут каждый. После этого промойте их три раза дистиллированной водой, каждый раз в течение 20 минут. Затем декальцинируют ткани в растворе для декальцинации объемом в 20-30 раз большем, чем у тканей при комнатной температуре.
- Раствор для декальцинации (см. таблицу материалов) должен поддерживать рН 7,2-7,4. Наконец, поместите декальцинированную ткань в коробку для обезвоживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для удаления накипи необходимо менять еженедельно. Процесс декальцинации можно завершить, когда ткань размягчится (примерно через 2 месяца).
- Раствор для декальцинации (см. таблицу материалов) должен поддерживать рН 7,2-7,4. Наконец, поместите декальцинированную ткань в коробку для обезвоживания.
- Обезвоживание и вощение: переложите дегидратационный бокс в дегидратор (см. Таблицу материалов). Начните с 75% спирта в течение 4 ч, затем 85% алкоголя в течение 2 ч, 90% спирта в течение 2 ч и 95% алкоголя в течение 1 ч.
- Затем погрузите ткань в безводный этанол на 30 мин, повторите процесс еще на 30 мин, используйте ксилол на 5-10 мин, повторите этот шаг еще на 5-10 мин, погрузите ткань в воск на 1 ч, повторите этот шаг еще на час и, наконец, погрузите ткань в воск еще на 1 ч.
- Закладка: поместите расплавленный восковой блок в коробку для закладки (см. Таблицу материалов) и храните его в морозильной камере при температуре -20 °C. Как только воск застынет, снимите его и обрежьте восковой блок.
- Нарезка: обрезанный восковой блок вставляют в парафиновый микротом (см. Таблицу материалов) и нарезают его ломтиками толщиной 3 мкм. Поместите ломтики на водяную баню с температурой 40 °C на разбрасывателе. Разровняйте ткань, затем приподнимите ее предметным стеклом и запекайте в духовке при температуре 60 °C.
- После того, как вода испарится, а воск должным образом застынет, снимите предметные стекла и храните их при температуре 25 °C.
5. Окрашивание тканей слизистой оболочки носа методом H&E
- Депарафинизация и гидратация: поместите ломтики в ксилол на 20 минут, повторите процесс еще на 20 минут, абсолютный этанол на 5 минут, повторите этот шаг еще на 5 минут, 75% спирт на 5 минут и, наконец, промойте в течение 5 минут.
- Окрашивание гематоксилином: дозировать 100 мкл раствора для окрашивания гематоксилина (см. таблицу материалов) в течение 3-5 мин с помощью пипетки на 100 мкл, промыть в течение 5-10 с, добавить 100 мкл 0,5% солянокислого этанола в течение 10-30 с, промыть в течение 5-10 с, добавить 100 мкл 0,2% аммиачной воды в течение 10-30 с и промыть в течение 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания гематоксилином необходима дифференцировка 0,5% этанолом соляной кислоты для удаления избытка гематоксилинового красителя, связанного с ядром и поглощенного цитоплазмой. При окрашивании эозином ядра и цитоплазма будут четко окрашены. Ломтики будут выглядеть красными или розовыми после дифференцировки 0,5% соляной кислоты этанола, поэтому промойте сразу после дифференцировки, чтобы удалить кислоту из срезов ткани, чтобы остановить дифференцировку. Затем используйте 0,2% аммиачной воды для усиления ядерного окрашивания. - Окрашивание эозином: с помощью пипетки объемом 100 мкл дозируйте 100 мкл раствора для окрашивания эозина (см. таблицу материалов) в течение 5 минут и смывайте в течение 30 с.
- Обезвоживание и герметизация: погрузите ломтики в абсолютный этанол на 5 минут, повторите процесс еще на 5 минут, повторите еще раз на 5 минут, диметил на 5 минут и ксилол на 5 минут. Наконец, уплотните нейтральной смолой (см. Таблицу материалов).
- Размещение окрашенного участка на микроскопе: расположите окрашенный участок на микроскопе, отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока изображение не станет четко видным, установите увеличение на 40x и сделайте снимок.
6. Многоцветное иммуноокрашивание тканей слизистой оболочки носа
- Депарафинизация и увлажнение: выполните то же самое, что описано в шаге 5.1.
- Обработка цитратно-фосфатным буфером: поместите цитрат-фосфатный буфер (pH 6,0) (см. Таблицу материалов) в контейнер, пригодный для использования в микроволновой печи. Нагрейте его до кипения, выньте его, а затем добавьте горки в емкость. Готовьте в микроволновой печи на среднем огне 8 минут до закипания, выключите огонь на 8 минут, а затем переключитесь на средне-слабый огонь на 7 минут.
- После естественного охлаждения переложите ломтики в PBS (pH 7,4), встряхните и промойте их три раза с помощью обесцвечивающего шейкера, каждый раз в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы буфер не испарялся во время этого процесса, и не допускайте высыхания ломтиков.
- После естественного охлаждения переложите ломтики в PBS (pH 7,4), встряхните и промойте их три раза с помощью обесцвечивающего шейкера, каждый раз в течение 5 минут.
- Блокирование эндогенной пероксидазы: срезы высушить, иммуногистохимической ручкой нарисовать круг вокруг ткани (чтобы антитело не утекло) и нанести 3% раствор перекиси водорода (перекись водорода: чистая вода = 1:9).
- Выдерживают при комнатной температуре в темноте 15 мин. После естественного охлаждения поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый.
- Блокируя: нанести 5% козью сыворотку внутри круга и инкубировать в течение 30 мин.
- Добавление первичных антител: осторожно удалите блокирующий раствор, добавьте FOXP3 (разведение: 1:200, см. таблицу материалов) в срез и поместите его во влажную камеру. Выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте небольшое количество воды во влажную камеру, чтобы предотвратить испарение антител. - Добавление вторичных антител: поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый. Аккуратно подсушите ломтики и нанесите вторичное антитело (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, см. таблицу материалов) внутри круга. Выдерживают при комнатной температуре 50 мин в темноте.
- Приготовление раствора для разведения тирамида: смешайте 100 мкл 3%H2O2 со 100 мл 1x TBST (см. таблицу материалов).
- Добавление рабочего раствора TSA: Смешайте 1 мл разбавителя тирамида с 2 мкл CY3-тирамида для приготовления рабочего раствора TSA. На каждый срез нанести 100 мкл рабочего раствора TSA и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин. Затем промойте ломтики PBS три раза, каждый раз по 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приготовьте и используйте рабочий раствор TSA и храните его при температуре 4 °C в темноте; Он действителен до 24 часов. - Повторите шаги 6.2-6.8: переключитесь на разведение RORγt (флуоресцентный краситель FITC) в соотношении 1:200, а затем на разведение TICAM1 (краситель TYP620) в соотношении 1:200 (см. таблицу материалов).
- Окрашенные DAPI ядра: аккуратно встряхните ломтики, чтобы они высохли, нанесите раствор для окрашивания DAPI и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
- Гасящая автофлуоресценция: поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый. Нанесите на ломтики автофлуоресцентный гаситель (см. Таблицу материалов), подождите 5 минут, а затем промойте в течение 10 минут.
- Блокировка: поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый. Аккуратно встряхните ломтики, чтобы они высохли, и запечатайте их антифлуоресцентным гасителем (см. Таблицу материалов).
- Микроскопия: поместите окрашенный участок на микроскоп, отрегулируйте фокус микроскопа для четкой видимости, установите увеличение на 20x и 40x и сделайте снимок.
ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI имеет длину волны УФ-возбуждения 330-380 нм и длину волны излучения 420 нм (синий свет). FITC имеет длину волны возбуждения 465-495 нм и длину волны излучения 515-555 нм (зеленый свет). CY3 имеет длину волны возбуждения 510-560 нм и длину волны излучения 590 нм (красный свет). TYP-690 имеет длину волны возбуждения 630 нм и длину волны излучения 690 нм (розовый свет).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шесть крыс SD были успешно индуцированы в модель AR с помощью внутрибрюшинной инъекции OVA и назального вызова. АР индуцировали у всех крыс в группе АР, что составляет 100% группы. У всех крыс в группе AR наблюдались типичные симптомы, такие как чихание, насморк и зуд в носу. Все поведенческие наблюдения набрали ≥5 баллов (табл. 2).
Результаты окрашивания H&E на21-й день моделирования показали, что у контрольных крыс эпителиальные клетки слизистой оболочки носа и реснички были хорошо организованы, без признаков воспалительной клеточной инфильтрации. И наоборот, в группе АР слизистая оболочка носовой перегородки была повреждена и отслоена, с заметной инфильтрацией нейтрофилами (рис. 3).
При сравнении тканей слизистой оболочки носа крыс с АР с контрольной группой было отмечено, что экспрессия RORγt (клеточно-специфического транскрипционного фактора Th17) и TICAM-1 (Toll-подобная молекула рецептор-линкера-1) была увеличена, а Foxp3 (Treg-клеточный транскрипционный фактор) снижена (рис. 4).
Рисунок 1: Рабочий процесс эксперимента . (А) Принципиальная схема внутрибрюшинной инъекции. (Б) Принципиальная схема назального затекания. (C) Блок-схема моделирования аллергического ринита крыс. (D) Принципиальная схема наблюдения за поведением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процесс удаления носа . (А) Разрезание мышечной ткани в уголках рта. (Б) Разрезание соединения между скулой и нижней челюстью. (C) Отделение нижней челюсти. (D) Удаление кожи верхней челюсти. (E) Обнажение носовой полости. (F) Разрезание соединения между носовой полостью и верхней челюстью. (G) Разрезание соединения между полостью носа и орбитальной костью. (H) Удаленная носовая полость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные гистопатологические изображения H&E окрашивания на 14-е сутки после моделирования AR (n = 6). (А) Эпителиальные клетки и реснички в слизистой оболочке носа контрольных крыс были хорошо расположены, воспалительной клеточной инфильтрации не наблюдалось. (Б) Слизистая оболочка носовой перегородки группы АР была повреждена и отслоена с инфильтрацией нейтрофилами. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ окрашивания MIF RORγt, Foxp3 и TICAM-1 (n = 6). По сравнению с контрольной группой экспрессия RORγt и TICAM-1 в тканях слизистой оболочки носа крыс в группе AR была повышена, в то время как экспрессия Foxp3 снижена. Масштабные линейки = 100 мкм (левая панель); 50 мкм (правые панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Принцип работы техники mIF. Метод mIF основан на методе TSA, который предполагает ковалентное связывание флуоресцентного сигнала с антигеном. В этом процессе меченая пероксидазой хрена на вторичном антителе катализирует переход флуоресцеинового субстрата из неактивного состояния в активированное. Это активированное состояние может ковалентно связываться с тирозином на антигене, что приводит к стабильному ковалентному присоединению флуоресцеина к образцу. Впоследствии нековалентно связанные антитела удаляются путем термической репарации. Затем процедуру повторяют с дополнительными первичными антителами, вторичными антителами и флуоресцеином, чтобы можно было обнаружить совершенно другой антиген. Это изображение было перерисовано и сопоставлено по цвету со ссылкой на принципиальную схематическую схемуmIF 17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Отзывов | Частота чихания | Насморк | Растирание носа |
| 1 | <3 | водянистые выделения в полости носа, | легкое и периодическое потирание носа; |
| 2 | 4~10 | водянистые выделения, вытекающие из передней части носа, | многократные растирания носа, |
| 3 | ≥11 | лицо покрыто обильными водянистыми выделениями, | растирания от носа к лицу |
Таблица 1: Количественная шкала поведенческого теста крыс.
| Индивидуальные | День 1 | День 21 |
| Элемент управления 1 | 0 | 0 |
| Элемент управления 2 | 0 | 0 |
| Элемент управления 3 | 0 | 0 |
| Элемент управления 4 | 0 | 0 |
| Элемент управления 5 | 0 | 0 |
| Элемент управления 6 | 0 | 0 |
| АР 1 | 0 | 7 |
| АР 2 | 0 | 6 |
| АР 3 | 0 | 5 |
| АР 4 | 0 | 5 |
| АР 5 | 0 | 5 |
| АР 6 | 0 | 6 |
Таблица 2: Результаты поведенческого скоринга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Аллергический ринит (АР) – это неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, возникающее в результате сочетания экологических и генетических факторов. Это стало глобальной проблемой здравоохранения, влияя на эффективность работы, снижая качество жизни, ухудшая сон, когнитивные функции, а также вызывая раздражительность и усталость. АР затрагивает 10–20% населения мира¹ и влечет за собой существенные экономические издержки, приводя к ежегодным убыткам в размере до 30–50 млрд евро в странах ЕС18. Более того, несколько исследований установили сильную связь между АР и астмой18,19,20, при этом у людей с АР вероятность развития астмы в семь раз выше, чем у людей без АР21. Современные исследования показывают, что дисбаланс между Т-хелперами 1-го типа (Th1) и Т-хелперами 2-го типа (Th2) с уклоном в сторону Th2-клеток является существенным фактором развития АР. Th2-клетки, стимулируемые интерлейкином-4, продуцируют Th2-подобные цитокины, такие как IL-5 и IL-13, вызывая воспаление в В-лимфоцитах, тучных клетках, эозинофилах и дендритных клетках22. Кроме того, недавние исследования АР указывают на сильную связь между дисбалансом в популяциях хелперов Th17/регуляторных Т-клеток (Treg)23. Клетки Th17 и Treg, полученные из CD4+ Т-клеток, играют важнейшую роль в иммунной системе. RORγt необходим для дифференцировки клеток Th1724, в то время как клетки Treg, обладающие иммуносупрессивными функциями, являются ключом к поддержанию иммунной толерантности. Изменения экспрессии Foxp3 влияют на функцию клеток Treg25,26. Таким образом, изменения уровней RORγt и Foxp3 отражают дисбаланс Th17/Treg, потенциально индуцируя воспалительную реакцию, в первую очередь вызванную клетками Th1727. Толл-подобные рецепторы (TLR) являются жизненно важными белками во врожденной иммунной системе организма, опосредующими внутриклеточные сигнальные пути для активации специфической экспрессии генов28. Исследование He Shan et al.29 показало, что вариации в гене TLR4, в частности, гетерозиготные мутации CT и чистые мутации TT в локусе rs10759930, были связаны с развитием АР. Учитывая роль TICAM-1 в качестве связующей молекулы между TLR3 и TLR4, была выдвинута гипотеза, что AR может быть связана с TICAM-1. Действительно, результаты показали повышенную экспрессию TICAM-1 в группе АР, что согласуется с исследованием Xu et al.30.
Метод мультиплексной иммунофлюоресценции, используемый в этом исследовании, является относительно новым методом обнаружения, разработанным за последние 20 лет. Он имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами иммунофлюоресценции (ИФ), включая повышенную специфичность, чувствительность и пропускную способность, а также возможность визуального анализа. Этот метод основан на методе TSA (Tyramide Signal Amplification), который ковалентно связывает флуоресцентные сигналы с антигенами и остается неподверженным влиянию микроволнового нагрева. Это позволяет осуществлять многоцветное мечение тканей путем повторных циклов флуоресцентного окрашивания TSA с последующим микроволновым нагревом для удаления антител с сохранением флуоресцентного сигнала 17,31,32 (рис. 5). Затем применяются усовершенствованные алгоритмы для автоматической идентификации и сегментации целевых участков тканей, отображающих определенные структуры на многомеченых изображениях. Это позволяет проводить количественный статистический анализ интересующих областей, что позволяет количественно оценить клеточные иммунные фенотипы и функциональную локализацию иммунных клеток. Он также предоставляет информацию о тканевом контексте и пространственном распределении33,34.
Тем не менее, технически mIF по-прежнему опирается на традиционные методы ПЧ и сталкивается с такими проблемами, как перекрестная реактивность антител и оптические перекрестные помехи. Использование нескольких антител может привести к перекрестной реактивности и ложноположительным результатам, в то время как перекрывающиеся спектры флуоресценции могут привести к смешиванию флуоресцентных сигналов от нескольких мишеней, что затрудняет дифференциацию невооруженным глазом и увеличивает зависимость от специализированных алгоритмов анализа изображений35. Кроме того, поскольку флуоресцентные красители используются для мечения антител, на mIF может влиять гашение флуоресценции и обесцвечивание, что приводит к снижению интенсивности сигнала. Примечательно, что в то время как обычные методы ИФ оценивают всю ткань, методы мИФ фокусируются на конкретных областях интереса в срезе ткани для анализа. Это может привести к отклонениям от реальности из-за гетерогенности тканей, что может привести к неточному гистологическому количественному определению или пропуску редких событий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
