Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية التألق المناعي متعدد الألوان لتقييم نموذج الفئران لالتهاب الأنف التحسسي.
Abstract
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي مزمن غير معدي يصيب الغشاء المخاطي للأنف ، ويتوسط فيه في المقام الأول الغلوبولين المناعي المحدد E (IgE) ، ويؤثر على حوالي 10٪ -20٪ من سكان العالم. في حين أن التلوين المناعي (IF) كان منذ فترة طويلة تقنية قياسية للكشف عن تعبير البروتين الخاص بالمرض ، فإن تقنيات IF التقليدية محدودة في قدرتها على اكتشاف مستويات التعبير لثلاثة بروتينات أو أكثر في نفس العينة. وبالتالي ، تم تطوير تقنيات IF متعددة الألوان في السنوات الأخيرة ، والتي تسمح بوضع العلامات المتزامنة لأهداف متعددة في الخلايا أو الأنسجة.
يوفر هذا البروتوكول نظرة عامة شاملة على عملية إنشاء نموذج الفئران من AR ، والحصول على عينات الغشاء المخاطي للأنف ، والإجراءات الفنية للتألق المناعي متعدد الألوان. أظهرت جميع الفئران في مجموعة AR أعراضا نموذجية مثل العطس وسيلان الأنف وحكة الأنف ، مع تسجيل الملاحظات السلوكية ≥5 نقطة. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) عن زيادة عدد الخلايا الالتهابية وتعطيل سلامة الغشاء المخاطي للأنف في مجموعة AR. أظهر التألق المناعي متعدد الألوان (mIF) زيادة في التعبير عن RORγt و TICAM-1 ، بينما انخفض تعبير Foxp3 في أنسجة الغشاء المخاطي للأنف لفئران AR.
Introduction
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي مزمن غير معدي يصيب الغشاء المخاطي للأنف بوساطة الغلوبولين المناعي المحدد E (IgE) 1,2. يتميز بأعراض مثل العطس وسيلان الأنف واحتقان الأنف وحكة الأنف. مع التصنيع والتحضر ، يتزايد انتشار AR تدريجيا ، مما يؤثر على حوالي 10٪ -20٪ من سكان العالم1. تقنية التألق المناعي (IF) هي طريقة تلطيخ الفلورسنت التي تستخدم تفاعل ربط الأجسام المضادة والمستضد. يمكن استخدامه للكشف عن وقياس مستويات التوزيع والتعبير لبروتينات معينة في الأنسجة أو الخلايا البيولوجية. في أبحاث الواقع المعزز ، يمكن ل IF اكتشاف أهداف متعددة في وقت واحد ، بما في ذلك السيتوكينات المرتبطة بالواقع المعزز ، والخلايا الالتهابية ، والمستقبلات ، وأكثر من ذلك ، مما يسهل استكشاف التسبب في AR وتأثيرات الأدوية3،4،5،6.
تشبه عملية التلوين المناعي متعدد الألوان (mIF) إلى حد كبير IF، مع إضافة خطوة شطف الأجسام المضادة خلال كل جولة من التلطيخ. يتيح هذا التعديل الكشف المتزامن عن المؤشرات الحيوية المتعددة على نفس قسم الأنسجة من خلال وضع العلامات الفردية المتسلسلة وجولات متعددة من إعادة التلطيخ. يعتمد mIF على تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، مما يسمح بدورات متكررة من تلطيخ الفلورسنت TSA واستخدام تسخين الميكروويف لإزالة الأجسام المضادة مع الاحتفاظ بإشارات الفلورسنت 7,8. بالمقارنة مع IF التقليدي ، يقدم mIF العديد من المزايا: (1) يمكنه اكتشاف المستضدات ذات التعبير الضعيف التي يصعب تحديدها مع IF 9,10 التقليدي ؛ (2) يوفر تلطيخا عالي الجودة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء محسنة ؛ (3) يسمح بالقياس الكمي للهياكل والمناطق ذات الأهمية الخاصة بالأنسجة11 ؛ (4) تعدد المسارات المتعددة يستخدم الأنسجة بكفاءة ويحافظ على الموارد المرضية المحدودة12 ؛ (5) يقدم التحليل متعدد المعلمات من خلال mIF رؤى أعمق في الأنسجة ، ويكشف عن المعلومات البيولوجية المخفية13.
بشكل عام ، يسمح mIF بمراقبة تعبيرات وتوزيعات المستضد المختلفة داخل نفس العينة ، مما يسهل دراسة البروتينات المستهدفة. في المستقبل ، سيجد الباحثون الذين يسعون إلى فهم التعبير عن البروتينات المستهدفة المتعددة وتوزيعها هذه التقنية خيارا قيما. توضح هذه الدراسة تطبيق mIF لتلطيخ عينات الغشاء المخاطي للأنف من الفئران باستخدام AR وتقييم إنشاء نموذج الفئران من AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
حصل البروتوكول والإجراءات التجريبية على موافقة من لجنة البحوث الإدارية والحيوانية بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم السجل: 2022DL-010). تم الحصول على ذكور فئران Sprague Dawley (SD) البالغة من العمر ثمانية أسابيع ، والتي يتراوح وزنها بين 180 و 200 جم ، تجاريا (انظر جدول المواد) وتم وضعها تحت دورة الضوء / الظلام الطبيعية مع درجة حرارة مضبوطة (23 ± 2 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (55٪ ± 10٪). تم تقسيم اثني عشر فأرا بشكل عشوائي إلى مجموعتين: المجموعة الضابطة ومجموعة AR. تأقلمت جميع الفئران مع هذه الظروف وزودت بحرية الوصول إلى الطعام والماء لمدة أسبوع واحد قبل التجربة.
1. إنشاء نموذج الفئران من AR
- تحضير محلول التحسس: 30 مجم من البومين البيضاوي (OVA) و 3 جم من Al(OH)3 في 100 مل من المحلول الملحي (انظر جدول المواد)14,15.
- التحسس الأساسي: أمسك وأمسك الجرذ المستيقظ تماما مع توجيه بطنه لأعلى. تطهير البطن باستخدام 75 ٪ كرات القطن غارقة في الكحول. استخدم حقنة سعة 1.5 مل لحقن 1 مل من محلول التحسس المحضر في الخطوة 1.1 في تجويف البطن الأيسر للفئران في مجموعة AR. كرر هذا الحقن مرة كل يومين لمدة 14 يوما (الشكل 1 أ).
ملاحظة: تأكد من وضع رأس الجرذ أسفل ذيله لمنع تلف الأمعاء الغليظة والدقيقة عند إدخال المحقنة. يقع موقع الحقن على بعد 1.5 سم من خط الوسط البطني. يجب أن تتلقى الفئران في المجموعة الضابطة حقنا داخل الصفاق من 1 مل من محلول ملحي طبيعي مرة كل يومين لمدة 14 يوما. - تحدي الأنف: تطبيق 50 ميكرولتر من 5٪ OVA عن طريق قطرات الأنف باستخدام ماصة 100 ميكرولتر (الشكل 1B) في اليوم التالي للتحسس القاعدي ، مع تكرار هذا الإجراء لمدة 7 أيام (الشكل 1C).
ملاحظة: تحضير محلول OVA بنسبة 5٪ عن طريق خلط 5 جم من OVA مع 100 مل من المحلول الملحي. بالنسبة للمجموعة الضابطة، يتم تطبيق قطرات من نفس الحجم من المحلول الملحي.
2. التسجيل السلوكي للفئران
- في غضون 30 دقيقة بعد الانتهاء من تحدي الأنف النهائي ، راقب الفئران وسجلها باستخدام كاميرا رقمية لتحديد الأعراض مثل خدش الأنف والعطس وسيلان الأنف ، بناء على معايير التسجيل الموضحة في الجدول 1 (الشكل 1 د).
ملاحظة: يعتمد تأكيد نمذجة الواقع المعزز الناجحة على تحقيق مجموع نقاط ≥5 نقطة14.
3. الحصول على عينات الغشاء المخاطي للأنف
- التضحية بالفئران: التضحية بالفئران بتعريضها لجرعة زائدة من CO2. بعد ذلك ، قم بتطهير الفئران بنسبة 75٪ من الإيثانول (انظر جدول المواد). استخدم مشرطا لعمل شق على طول زاويتي الفم لكشف الأنسجة العضلية (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، قم بقطع مفاصل العظم الوجني والفك السفلي على جانبي الجمجمة باستخدام مقص الأنسجة (الشكل 2 ب) ، وإزالة الفك السفلي (الشكل 2 ج).
- التعرض لتجويف الأنف: افصل جلد الفك العلوي باستخدام مرقئ (الشكل 2 د) لكشف تجويف الأنف (الشكل 2 ه). قطع الاتصال العظمي بين تجويف الأنف والفك العلوي بمقص الأنسجة (الشكل 2F). بعد ذلك ، اقطع الاتصال بين تجويف الأنف والعظام المدارية على كلا الجانبين عند الثقبة تحت الحجاج (الشكل 2G) وقم بإزالة تجويف الأنف (الشكل 2H).
- التثبيت: ضع تجويف الأنف المستخرج في 4٪ بارافورمالدهيد للتثبيت وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-72 ساعة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تأكد من أن كمية مثبت بارافورمالدهايد المستخدمة كافية لتغطية الأقسام بالكامل للتثبيت المناسب.
4. المعالجة المسبقة لعينات الغشاء المخاطي للأنف
- إزالة الكلس: ابدأ بإصلاح الأنسجة التي تمت إزالتها من الخطوة 3.1. اغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة لكل منهما. اتبع ذلك عن طريق غسلها ثلاث مرات بالماء المقطر ، في كل مرة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الكلس من الأنسجة في محلول إزالة الكلس بحجم 20-30 مرة من الأنسجة في درجة حرارة الغرفة.
- يجب أن يحافظ محلول إزالة الكلس (انظر جدول المواد) على درجة حموضة 7.2-7.4. أخيرا ، ضع الأنسجة منزوعة الكلس في صندوق التجفيف.
ملاحظة: يجب تغيير محلول إزالة الكلس أسبوعيا. يمكن الانتهاء من عملية إزالة الكلس عندما يلين النسيج (حوالي 2 أشهر).
- يجب أن يحافظ محلول إزالة الكلس (انظر جدول المواد) على درجة حموضة 7.2-7.4. أخيرا ، ضع الأنسجة منزوعة الكلس في صندوق التجفيف.
- الجفاف وإزالة الشعر بالشمع: انقل صندوق التجفيف إلى مجفف (انظر جدول المواد). ابدأ ب 75٪ كحول لمدة 4 ساعات ، تليها 85٪ كحول لمدة 2 ساعة ، و 90٪ كحول لمدة 2 ساعة ، و 95٪ كحول لمدة 1 ساعة.
- بعد ذلك ، اغمر الأنسجة في الإيثانول اللامائي لمدة 30 دقيقة ، وكرر العملية لمدة 30 دقيقة أخرى ، واستخدم الزيلين لمدة 5-10 دقائق ، وكرر هذه الخطوة لمدة 5-10 دقائق أخرى ، واغمر الأنسجة في الشمع لمدة 1 ساعة ، وكرر هذه الخطوة لمدة ساعة أخرى ، وأخيرا ، اغمر الأنسجة في الشمع لمدة 1 ساعة إضافية.
- التضمين: ضع كتلة الشمع المذاب في صندوق التضمين (انظر جدول المواد) وقم بتخزينها في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية. بمجرد أن يصلب الشمع ، قم بإزالته وتقليم كتلة الشمع.
- التقطيع: أدخل كتلة الشمع المشذبة في ميكروتوم البارافين (انظر جدول المواد) وقطعها إلى شرائح بسمك 3 ميكرومتر. ضع الشرائح في حمام مائي على حرارة 40 درجة مئوية على مفرشة منزلقة. افرد المنديل ، ثم ارفعه بشريحة زجاجية واخبزه في فرن 60 درجة مئوية.
- بعد تبخر الماء ، وضبط الشمع بشكل صحيح ، قم بإزالة الشرائح وتخزينها عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
5. تلطيخ H& E من الأنسجة المخاطية للأنف
- إزالة الشمع والترطيب: ضع الشرائح في الزيلين لمدة 20 دقيقة ، كرر العملية لمدة 20 دقيقة أخرى ، الإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق ، كرر هذه الخطوة لمدة 5 دقائق أخرى ، 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، وأخيرا ، اغسل لمدة 5 دقائق.
- تلطيخ الهيماتوكسيلين: استغني عن 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 3-5 دقائق باستخدام ماصة 100 ميكرولتر ، واشطفها لمدة 5-10 ثوان ، وأضف 100 ميكرولتر من إيثانول حمض الهيدروكلوريك 0.5٪ لمدة 10-30 ثانية ، واشطفها لمدة 5-10 ثوان ، وأضف 100 ميكرولتر من ماء الأمونيا 0.2٪ لمدة 10-30 ثانية ، واشطفها لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين ، يكون التمايز مع إيثانول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.5٪ ضروريا لإزالة صبغة الهيماتوكسيلين الزائدة المرتبطة بالنواة والتي يمتصها السيتوبلازم. عند إجراء تلطيخ اليوزين ، سيتم تلطيخ النوى والسيتوبلازم بوضوح. ستظهر الشرائح باللون الأحمر أو الوردي بعد التمايز مع 0.5٪ من إيثانول حمض الهيدروكلوريك ، لذا اشطفها مباشرة بعد التمايز لإزالة الحمض من شرائح الأنسجة لوقف التمايز. ثم استخدم 0.2٪ من ماء الأمونيا لتعزيز التلوين النووي. - تلطيخ Eosin: استخدم ماصة 100 ميكرولتر لتوزيع 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ eosin (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق وشطفه لمدة 30 ثانية.
- الجفاف والختم: اغمر الشرائح في الإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق ، وكرر العملية لمدة 5 دقائق أخرى ، وكرر مرة أخرى لمدة 5 دقائق ، وثنائي ميثيل لمدة 5 دقائق ، والزيلين لمدة 5 دقائق. أخيرا ، ختم مع الراتنج محايد (انظر جدول المواد).
- وضع القسم الملون على المجهر: ضع القسم الملون على المجهر ، واضبط تركيز المجهر حتى تصبح الصورة مرئية بوضوح ، واضبط التكبير على 40x ، والتقط الصورة.
6. تلطيخ مناعي متعدد الألوان للأنسجة المخاطية للأنف
- إزالة الشمع والترطيب: اتبع نفس ما هو مذكور في الخطوة 5.1.
- معالجة العازلة لسترات الفوسفات: ضع المخزن المؤقت لفوسفات السيترات (الرقم الهيدروجيني 6.0) (انظر جدول المواد) في حاوية آمنة للاستخدام في الميكروويف. قم بتسخينه حتى الغليان ، ثم قم بإزالته ، ثم أضف الشرائح إلى الحاوية. ضعيه في الميكروويف على نار متوسطة لمدة 8 دقائق حتى الغليان ، وأطفئي النار لمدة 8 دقائق ، ثم انتقلي إلى نار متوسطة منخفضة لمدة 7 دقائق.
- بعد التبريد الطبيعي ، انقل الشرائح إلى PBS (درجة الحموضة 7.4) ، ورجها ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام شاكر لإزالة اللون ، في كل مرة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تأكد من أن المخزن المؤقت لا يتبخر أثناء هذه العملية ، ومنع الشرائح من الجفاف.
- بعد التبريد الطبيعي ، انقل الشرائح إلى PBS (درجة الحموضة 7.4) ، ورجها ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام شاكر لإزالة اللون ، في كل مرة لمدة 5 دقائق.
- منع البيروكسيديز الداخلي: جفف الشرائح ، وارسم دائرة حول الأنسجة بقلم كيميائي مناعي (لمنع الجسم المضاد من التدفق بعيدا) ، وقم بتطبيق محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ (بيروكسيد الهيدروجين: الماء النقي = 1: 9).
- احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد الطبيعي ، ضع الشرائح في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ورجها على شاكر مزيل اللون لمدة ثلاث دورات مدة كل منها 5 دقائق.
- الحجب: ضعي 5٪ سيروم الماعز داخل الدائرة واحتضنها لمدة 30 دقيقة.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية: قم بإزالة محلول الحجب برفق ، وأضف FOXP3 (التخفيف: 1: 200 ، انظر جدول المواد) إلى الشريحة ، وضعها في غرفة رطبة. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: أضف كمية صغيرة من الماء إلى الغرفة الرطبة لمنع تبخر الأجسام المضادة. - إضافة الأجسام المضادة الثانوية: ضع الشرائح في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ورجها على شاكر مزيل اللون لمدة ثلاث دورات مدة كل منها 5 دقائق. جفف الشرائح برفق وضع الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للأرانب IgG H &L ، انظر جدول المواد) داخل الدائرة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 50 دقيقة في الظلام.
- تحضير محلول تخفيف التيراميد: الجمع بين 100 ميكرولتر من 3٪ H 2 O2مع 100 مل من 1x TBST (انظر جدول المواد).
- إضافة محلول عمل TSA: امزج 1 مل من مخفف التيراميد مع 2 ميكرولتر من CY3-Tyramide لتحضير محلول عمل TSA. ضع 100 ميكرولتر من محلول عمل TSA على كل شريحة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: قم بإعداد واستخدام حل عمل TSA على الفور ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام ؛ وهي صالحة لمدة تصل إلى 24 ساعة. - كرر الخطوات 6.2-6.8: قم بالتبديل إلى تخفيف 1: 200 من RORγt (صبغة الفلورسنت FITC) ثم إلى تخفيف 1: 200 من TICAM1 (صبغة TYP620) (انظر جدول المواد).
- نوى DAPI الملطخة: هز الشرائح برفق لتجفيفها ، ضع محلول تلطيخ DAPI ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
- تبريد التألق الذاتي: ضع الشرائح في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ورجها على شاكر لإزالة اللون لمدة ثلاث دورات مدة كل منها 5 دقائق. ضع مبرد التألق الذاتي (انظر جدول المواد) على الشرائح ، وانتظر لمدة 5 دقائق ، ثم اغسله لمدة 10 دقائق.
- حجب: ضع الشرائح في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ورجها على شاكر مزيل اللون لمدة ثلاث دورات مدة كل منها 5 دقائق. رج الشرائح برفق لتجفيفها وأغلقها باستخدام جهاز التبريد المضاد للتألق (انظر جدول المواد).
- الفحص المجهري: ضع القسم الملون على المجهر ، واضبط تركيز المجهر للحصول على رؤية واضحة ، واضبط التكبير على 20x و 40x ، والتقط الصورة.
ملاحظة: DAPI له طول موجة إثارة للأشعة فوق البنفسجية من 330-380 نانومتر وطول موجة انبعاث 420 نانومتر (الضوء الأزرق). يبلغ طول موجة الإثارة FITC 465-495 نانومتر وطول موجة الانبعاث 515-555 نانومتر (الضوء الأخضر). CY3 له طول موجة إثارة 510-560 نانومتر وطول موجة انبعاث 590 نانومتر (ضوء أحمر). يبلغ الطول الموجي للإثارة TYP-690 630 نانومتر وطول موجة الانبعاث 690 نانومتر (الضوء الوردي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم حث ستة فئران SD بنجاح في نموذج AR من خلال حقن OVA داخل الصفاق وتحدي الأنف. تم تحفيز AR في جميع الفئران في مجموعة AR ، وهو ما يمثل 100 ٪ من المجموعة. أظهرت جميع الفئران في مجموعة AR أعراضا نموذجية مثل العطس وسيلان الأنف وحكة في الأنف. سجلت جميع الملاحظات السلوكية ≥5 نقطة (الجدول 2).
كشفت نتائج تلطيخ H&Eفي اليوم 21 من النمذجة أنه في الفئران الضابطة ، كانت الخلايا الظهارية والأهداب المخاطية للأنف مرتبة جيدا ، مع عدم وجود علامات على تسلل الخلايا الالتهابية. على العكس من ذلك ، في مجموعة AR ، تضرر الغشاء المخاطي للحاجز الأنفي وانفصل ، مع تسلل العدلات الملحوظ (الشكل 3).
عند مقارنة أنسجة الغشاء المخاطي للأنف لفئران AR مع المجموعة الضابطة ، لوحظ أن التعبير عن RORγt (عامل نسخ خاص بالخلية Th17) و TICAM-1 (جزيء رابط المستقبلات الشبيه ب Toll-1) قد زاد ، بينما انخفض Foxp3 (عامل نسخ خاص بخلية Treg) (الشكل 4).
الشكل 1: سير العمل التجريبي. أ: رسم تخطيطي للحقن داخل الصفاق. ب: رسم تخطيطي للتنقيط الأنفي. (ج) مخطط انسيابي لنمذجة فئران التهاب الأنف التحسسي. د: رسم تخطيطي للملاحظة السلوكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عملية إزالة الأنف. أ: قطع الأنسجة العضلية في زوايا الفم. ب: قطع الوصلة بين عظم الوجنة والفك السفلي. ج: فصل الفك السفلي. د: إزالة جلد الفك العلوي. ه: تعريض تجويف الأنف. (و) قطع الاتصال بين تجويف الأنف والفك العلوي. (ز) قطع الوصلة بين تجويف الأنف والعظم المداري. (ح) تجويف الأنف الذي تمت إزالته. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تلطيخ H&E النسيجية التمثيلية في اليوم 14 بعد نمذجة AR (ن = 6). (أ) كانت الخلايا الظهارية والأهداب في الغشاء المخاطي للأنف في الفئران الضابطة مرتبة ترتيبا جيدا، ولم يلاحظ أي ارتشاح للخلايا الالتهابية. (ب) تلف الغشاء المخاطي للحاجز الأنفي لمجموعة AR وانفصل مع ارتشاح العدلات. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل تلطيخ MIF ل RORγt و Foxp3 و TICAM-1 (ن = 6). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، كان التعبير عن RORγt و TICAM-1 في أنسجة الغشاء المخاطي للأنف للفئران في مجموعة AR مرتفعا ، بينما انخفض التعبير عن Foxp3. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (الألواح اليسرى) ؛ 50 ميكرومتر (الألواح اليمنى). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مبدأ تقنية mIF. تعتمد تقنية mIF على تقنية TSA ، والتي تتضمن ربط إشارة الفلورسنت تساهميا بالمستضد. في هذه العملية ، يحفز بيروكسيديز الفجل المسمى على الجسم المضاد الثانوي انتقال ركيزة الفلوريسئين من حالة غير نشطة إلى حالة نشطة. يمكن أن ترتبط هذه الحالة المنشطة تساهميا بالتيروزين الموجود على مولد الضد ، مما يؤدي إلى ارتباط تساهمي مستقر للفلوريسئين بالعينة. بعد ذلك ، تتم إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة تساهميا من خلال الإصلاح الحراري. ثم يتم تكرار الإجراء مع الأجسام المضادة الأولية الإضافية والأجسام المضادة الثانوية والفلوريسئين لتمكين اكتشاف مستضد مختلف تماما. تمت إعادة رسم هذه الصورة ومطابقتها بالألوان مع الإشارة إلى الرسم التخطيطي mIF17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عشرات | تردد العطس | سيلان الأنف | فرك الأنف |
| 1 | <3 | تصريف مائي داخل تجويف الأنف | فرك الأنف الطفيف والعرضي |
| 2 | 4 ~ 10 | تصريف مائي ينسكب من النرجس الأمامي | فرك الأنف المتكرر |
| 3 | ≥11 | الوجه مغطى بتصريف مائي وفير | فرك من الأنف إلى الوجه |
الجدول 1: جدول المقياس الكمي للاختبار السلوكي للفئران.
| الأفراد | اليوم 1 | اليوم 21 |
| التحكم 1 | 0 | 0 |
| التحكم 2 | 0 | 0 |
| التحكم 3 | 0 | 0 |
| التحكم 4 | 0 | 0 |
| التحكم 5 | 0 | 0 |
| التحكم 6 | 0 | 0 |
| ع 1 | 0 | 7 |
| ع 2 | 0 | 6 |
| ع 3 | 0 | 5 |
| ع 4 | 0 | 5 |
| ع 5 | 0 | 5 |
| ع 6 | 0 | 6 |
الجدول 2: نتائج التسجيل السلوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي غير معدي في الغشاء المخاطي للأنف ناتج عن مجموعة من العوامل البيئية والوراثية. لقد أصبح مصدر قلق صحي عالمي ، مما يؤثر على كفاءة العمل ، ويقلل من نوعية الحياة ، ويضعف النوم ، والوظيفة الإدراكية ، ويسبب التهيج والتعب. يؤثر الواقع المعزز على 10٪ -20٪ من سكان العالم¹ ويحمل تكاليف اقتصادية كبيرة ، مما يتسبب في خسائر سنوية تصل إلى 30-50 مليار يورو في دول الاتحاد الأوروبي18. علاوة على ذلك ، أثبتت العديد من الدراسات وجود ارتباط قوي بين AR والربو18،19،20 ، حيث يكون الأفراد الذين يعانون من AR أكثر عرضة للإصابة بالربو بسبع مرات من أولئك الذين لا يعانون من AR 21. تشير الأبحاث الحالية إلى أن عدم التوازن بين الخلايا التائية المساعدة من النوع 1 (Th1) والخلايا التائية المساعدة من النوع 2 (Th2) مع التحيز نحو خلايا Th2 هو مساهم كبير في AR. تنتج خلايا Th2 ، التي يحفزها الإنترلوكين -4 ، السيتوكينات الشبيهة ب Th2 مثل IL-5 و IL-13 ، مما يؤدي إلى التهاب في الخلايا الليمفاوية البائية والخلايا البدينة والحمضات والخلايا المتغصنة22. علاوة على ذلك ، تشير أبحاث AR الحديثة إلى وجود صلة قوية بين عدم التوازن في مجموعات Th17 / الخلايا التائية التنظيمية (Treg)23. تلعب خلايا Th17 و Treg ، وكلاهما مشتق من خلايا CD4 + T ، أدوارا مهمة في جهاز المناعة. RORγt ضروري لتمايز خلايا Th1724 ، في حين أن خلايا Treg ، ذات الوظائف المثبطة للمناعة ، هي المفتاح للحفاظ على التسامح المناعي. تؤثر التغييرات في تعبير Foxp3 على وظيفة خلية Treg25,26. وبالتالي ، فإن التغيرات في مستويات RORγt و Foxp3 تعكس اختلالات Th17 / Treg ، مما قد يؤدي إلى استجابة التهابية مدفوعة بشكل أساسي بخلايا Th1727. المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLRs) هي بروتينات حيوية في جهاز المناعة الفطري للجسم ، تتوسط مسارات الإشارات داخل الخلايا لتنشيط التعبير الجيني المحدد28. وجدت الأبحاث التي أجراها He Shan et al.29 أن الاختلافات في جين TLR4 ، وتحديدا الطفرات النقية CT غير المتجانسة و TT في موضع rs10759930 ، كانت مرتبطة بتطور AR. نظرا لدور TICAM-1 كجزيء جسر بين TLR3 و TLR4 ، فقد افترض أن AR قد يكون مرتبطا ب TICAM-1. في الواقع ، أظهرت النتائج ارتفاع تعبير TICAM-1 في مجموعة AR ، بما يتفق مع دراسة Xu et al.30.
تقنية mIF (التألق المناعي المتعدد) المستخدمة في هذه الدراسة هي طريقة كشف جديدة نسبيا تم تطويرها على مدار ال 20 عاما الماضية. إنه يوفر العديد من المزايا مقارنة بتقنيات التألق المناعي التقليدية (IF) ، بما في ذلك زيادة الخصوصية والحساسية والإنتاجية ، إلى جانب القدرة على التحليل البصري. تعتمد هذه التقنية على طريقة TSA (تضخيم إشارة التيراميد) ، التي تربط تساهميا إشارات الفلورسنت بالمستضدات وتظل غير متأثرة بتسخين الميكروويف. يسمح ذلك بوضع العلامات متعددة الألوان للأنسجة من خلال دورات متكررة من تلطيخ الفلورسنت TSA ، يليه تسخين الميكروويف لإزالة الأجسام المضادة مع الاحتفاظ بإشارة الفلورسنت17،31،32 (الشكل 5). ثم يتم تطبيق خوارزميات متقدمة لتحديد وتجزئة مناطق الأنسجة المستهدفة تلقائيا التي تعرض هياكل محددة في صور متعددة التسميات. يتيح ذلك التحليل الإحصائي الكمي للمناطق ذات الاهتمام ، مما يسمح بالتقييم الكمي للأنماط الظاهرية المناعية الخلوية والتوطين الوظيفي للخلايا المناعية. كما يوفر معلومات عن سياق الأنسجة والتوزيع المكاني33,34.
ومع ذلك ، من الناحية الفنية ، لا يزال mIF يعتمد على تقنيات IF التقليدية ويواجه تحديات مثل التفاعل المتبادل للأجسام المضادة والحديث المتبادل البصري. يمكن أن يؤدي استخدام أجسام مضادة متعددة إلى تفاعل متقاطع ونتائج إيجابية كاذبة ، في حين أن أطياف التألق المتداخلة قد تؤدي إلى مزج إشارات مضان من أهداف متعددة ، مما يجعل التمايز بالعين المجردة أمرا صعبا ويزيد الاعتماد على خوارزميات تحليل الصور المتخصصة35. علاوة على ذلك ، نظرا لاستخدام الأصباغ الفلورية لتسمية الأجسام المضادة ، يمكن أن يتأثر mIF بالتبريد والتبييض الفلوري ، مما يؤدي إلى تقليل شدة الإشارة. والجدير بالذكر أنه في حين أن تقنيات IF التقليدية تقيم الأنسجة بأكملها ، تركز تقنيات mIF على مناطق محددة ذات أهمية داخل قسم الأنسجة للتحليل. قد يؤدي هذا إلى انحرافات عن الواقع بسبب عدم تجانس الأنسجة ، مما قد يؤدي إلى تقدير نسيجي غير دقيق أو إغفال أحداث نادرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل إدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة سيتشوان (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
