Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di immunofluorescenza multicolore per la valutazione del modello di rinite allergica nel ratto.
Abstract
La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica e non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E specifiche (IgE), che colpisce circa il 10%-20% della popolazione mondiale. Mentre la colorazione a immunofluorescenza (IF) è stata a lungo una tecnica standard per rilevare l'espressione proteica specifica della malattia, le tecniche convenzionali di IF sono limitate nella loro capacità di rilevare i livelli di espressione di tre o più proteine nello stesso campione. Di conseguenza, negli ultimi anni sono state sviluppate tecniche di IF multicolore, che consentono la marcatura simultanea di più bersagli in cellule o tessuti.
Questo protocollo fornisce una panoramica completa del processo per stabilire un modello di ratto di AR, ottenere campioni di mucosa nasale e le procedure tecniche per l'immunofluorescenza multicolore. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso, con osservazioni comportamentali che hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha rivelato un aumento della conta delle cellule infiammatorie e un'integrità della mucosa nasale interrotta nel gruppo AR. L'immunofluorescenza multicolore (mIF) ha dimostrato un aumento dell'espressione di RORγt e TICAM-1, mentre l'espressione di Foxp3 è diminuita nel tessuto della mucosa nasale dei ratti AR.
Introduction
La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E (IgE) specifiche1,2. È caratterizzata da sintomi come starnuti, naso che cola, congestione nasale e prurito nasale. Con l'industrializzazione e l'urbanizzazione, la prevalenza dell'AR sta gradualmente aumentando, colpendo circa il 10%-20% della popolazione mondiale1. La tecnica dell'immunofluorescenza (IF) è un metodo di colorazione fluorescente che utilizza una reazione di legame anticorpo-antigene. Può essere impiegato per rilevare e quantificare la distribuzione e i livelli di espressione di proteine specifiche nei tessuti biologici o nelle cellule. Nella ricerca AR, l'IF può rilevare simultaneamente più bersagli, tra cui citochine correlate all'AR, cellule infiammatorie, recettori e altro ancora, facilitando l'esplorazione della patogenesi dell'AR e degli effetti dei farmaci 3,4,5,6.
Il processo di colorazione a immunofluorescenza multicolore (mIF) assomiglia molto all'IF, con l'aggiunta di una fase di eluizione dell'anticorpo durante ogni ciclo di colorazione. Questa modifica consente il rilevamento simultaneo di più biomarcatori sulla stessa sezione di tessuto attraverso una singola marcatura sequenziale e più cicli di ricolorazione. mIF si basa sull'amplificazione del segnale della tiramide (TSA), che consente cicli ripetuti di colorazione fluorescente TSA e l'uso del riscaldamento a microonde per rimuovere gli anticorpi mantenendo i segnali fluorescenti 7,8. Rispetto all'IF convenzionale, l'mIF offre diversi vantaggi: (1) è in grado di rilevare antigeni debolmente espressi che sono difficili da identificare con l'IFconvenzionale 9,10; (2) fornisce una colorazione di alta qualità con un migliore rapporto segnale/rumore; (3) consente di quantificare le strutture e le regioni di interesse tessuto-specifiche11; (4) il multiplexing di percorsi multipli utilizza in modo efficiente i tessuti e conserva risorse patologiche limitate12; (5) l'analisi multiparametrica attraverso mIF offre informazioni più approfondite sui tessuti, scoprendo informazioni biologiche nascoste13.
Nel complesso, mIF consente l'osservazione di diverse espressioni e distribuzioni dell'antigene all'interno dello stesso campione, facilitando lo studio delle proteine bersaglio. In futuro, i ricercatori che cercano di comprendere l'espressione e la distribuzione di più proteine bersaglio troveranno questa tecnica una scelta preziosa. Questo studio dimostra l'applicazione di mIF per la colorazione di campioni di mucosa nasale di ratti con AR e valuta la creazione di un modello di AR nel ratto.
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Protocol
Il protocollo e le procedure sperimentali hanno ricevuto l'approvazione del Comitato amministrativo e di ricerca sugli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di registrazione: 2022DL-010). I ratti maschi di Sprague Dawley (SD) di otto settimane, del peso di 180-200 g, sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in un ciclo naturale luce/buio con temperatura controllata (23 ± 2 °C) e umidità relativa (55% ± 10%). Dodici ratti sono stati divisi in modo casuale in due gruppi: il gruppo di controllo e il gruppo AR. Tutti i ratti sono stati acclimatati a queste condizioni e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua per una settimana prima della sperimentazione.
1. Creazione di un modello di ratto di AR
- Preparazione della soluzione sensibilizzante: sospendere 30 mg di ovoalbumina (OVA) e 3 g di Al(OH)3 in 100 mL di soluzione fisiologica (vedi Tabella dei Materiali)14,15.
- Sensibilizzazione di base: afferrare e tenere il ratto completamente sveglio con l'addome rivolto verso l'alto. Disinfettare l'addome utilizzando batuffoli di cotone imbevuti di alcol al 75%. Utilizzare una siringa da 1,5 mL per iniettare 1 mL della soluzione sensibilizzante preparata nella fase 1.1 nella cavità addominale sinistra dei ratti del gruppo AR. Ripeta l'iniezione una volta ogni due giorni per 14 giorni (Figura 1A).
NOTA: Assicurarsi che la testa del ratto sia posizionata più in basso rispetto alla coda per evitare danni all'intestino crasso e tenue durante l'inserimento della siringa. Il sito di iniezione si trova a 1,5 cm dalla linea mediana ventrale. I ratti del gruppo di controllo devono ricevere iniezioni intraperitoneali di 1 mL di soluzione fisiologica normale una volta ogni due giorni per 14 giorni. - Provocazione nasale: somministrare 50 μL di OVA al 5% tramite gocce nasali utilizzando una pipetta da 100 μL (Figura 1B) il giorno successivo alla sensibilizzazione basale, ripetendo questa procedura per 7 giorni (Figura 1C).
NOTA: Preparare la soluzione di OVA al 5% mescolando 5 g di OVA con 100 mL di soluzione fisiologica. Per il gruppo di controllo, somministrare gocce dello stesso volume di soluzione fisiologica.
2. Punteggio comportamentale dei ratti
- Entro 30 minuti dal completamento della sfida nasale finale, osservare e registrare i ratti utilizzando una fotocamera digitale per identificare sintomi come grattarsi il naso, starnutire e naso che cola, in base ai criteri di punteggio delineati nella Tabella 1 (Figura 1D).
NOTA: La conferma del successo della modellazione AR si basa sul raggiungimento di un punteggio totale di ≥5 punti14.
3. Acquisizione di campioni di mucosa nasale
- Sacrificare i ratti: sacrificare i ratti esponendoli a un'overdose di CO2 . Successivamente, disinfettare i ratti con etanolo al 75% (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lungo i due angoli della bocca per esporre il tessuto muscolare (Figura 2A). Successivamente, tagliare le articolazioni dell'osso zigomatico e della mandibola su entrambi i lati del cranio utilizzando delle forbici per tessuti (Figura 2B) e rimuovere la mandibola (Figura 2C).
- Esposizione della cavità nasale: separare la pelle della mascella utilizzando un emostatico (Figura 2D) per esporre la cavità nasale (Figura 2E). Tagliare la connessione ossea tra la cavità nasale e la mascella con delle forbici per tessuti (Figura 2F). Quindi, recidere la connessione tra la cavità nasale e le ossa orbitali su entrambi i lati del forame infraorbitale (Figura 2G) e rimuovere la cavità nasale (Figura 2H).
- Fissazione: porre la cavità nasale estratta in paraformaldeide al 4% per il fissaggio e conservarla a temperatura ambiente per 24-72 h (vedi Tabella dei Materiali).
NOTA: Assicurarsi che la quantità di fissativo paraformaldeide utilizzata sia sufficiente a coprire completamente le sezioni per un corretto fissaggio.
4. Pre-trattamento di campioni di mucosa nasale
- Decalcificazione: iniziare fissando i tessuti rimossi dal punto 3.1. Lavali tre volte con PBS per 20 minuti ciascuno. Seguili lavandoli tre volte con acqua distillata, ogni volta per 20 minuti. Successivamente, decalcificare i tessuti in una soluzione di decalcificazione con un volume di 20-30 volte quello dei tessuti a temperatura ambiente.
- La soluzione di decalcificazione (vedi Tabella dei Materiali) deve mantenere un pH di 7,2-7,4. Infine, metti il tessuto decalcificato in una scatola di disidratazione.
NOTA: La soluzione decalcificante deve essere cambiata settimanalmente. Il processo di decalcificazione può concludersi quando il tessuto si ammorbidisce (circa 2 mesi).
- La soluzione di decalcificazione (vedi Tabella dei Materiali) deve mantenere un pH di 7,2-7,4. Infine, metti il tessuto decalcificato in una scatola di disidratazione.
- Disidratazione e ceretta: trasferire la scatola di disidratazione in un disidratatore (vedi Tabella dei materiali). Inizia con il 75% di alcol per 4 ore, seguito dall'85% di alcol per 2 ore, dal 90% di alcol per 2 ore e dal 95% di alcol per 1 ora.
- Successivamente, immergere il tessuto in etanolo anidro per 30 minuti, ripetere il processo per altri 30 minuti, utilizzare lo xilene per 5-10 minuti, ripetere questo passaggio per altri 5-10 minuti, immergere il tessuto nella cera per 1 ora, ripetere questo passaggio per un'altra ora e, infine, immergere il tessuto nella cera per un'altra 1 ora.
- Incasso: posizionare il blocco di cera fusa nella scatola da incasso (vedi Tabella dei materiali) e conservarlo in un congelatore a -20 °C. Una volta che la cera si è solidificata, rimuoverla e tagliare il blocco di cera.
- Affettatura: inserire il blocco di cera rifilato in un microtomo di paraffina (vedi Tabella dei materiali) e tagliarlo a fette dello spessore di 3 μm. Mettere le fette a bagnomaria a 40 °C su uno spargivetrino. Appiattire il fazzoletto, quindi sollevarlo con un vetrino e cuocerlo in forno a 60 °C.
- Dopo che l'acqua è evaporata e la cera è stata fissata correttamente, rimuovere i vetrini e conservarli a una temperatura di 25 °C.
5. Colorazione H&E del tessuto mucoso nasale
- Deceratura e idratazione: mettere le fette in xilene per 20 min, ripetere il processo per altri 20 min, etanolo assoluto per 5 min, ripetere questo passaggio per altri 5 min, alcol al 75% per 5 min, e infine, lavare per 5 min.
- Colorazione con ematossilina: erogare 100 μL di soluzione colorante con ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per 3-5 minuti utilizzando una pipetta da 100 μL, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di etanolo acido cloridrico allo 0,5% per 10-30 s, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di acqua ammoniacale allo 0,2% per 10-30 s e risciacquare per 30 s.
NOTA: Dopo la colorazione con ematossilina, è necessaria la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5% per rimuovere il colorante ematossilico in eccesso legato al nucleo e assorbito dal citoplasma. Quando viene eseguita la colorazione con eosina, i nuclei e il citoplasma saranno chiaramente colorati. Le fette appariranno rosse o rosa dopo la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5%, quindi risciacquare immediatamente dopo la differenziazione per rimuovere l'acido dalle fette di tessuto per arrestare la differenziazione. Quindi, utilizzare lo 0,2% di acqua ammoniacale per migliorare la colorazione nucleare. - Colorazione con eosina: utilizzare una pipetta da 100 μL per erogare 100 μL di soluzione colorante con eosina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti e risciacquare per 30 s.
- Disidratazione e sigillatura: immergere le fette in etanolo assoluto per 5 minuti, ripetere il processo per altri 5 minuti, ripetere ancora una volta per 5 minuti, dimetile per 5 minuti e xilene per 5 minuti. Infine, sigillare con resina neutra (vedi Tabella dei Materiali).
- Posizionamento della sezione colorata sul microscopio: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando l'immagine non è chiaramente visibile, impostare l'ingrandimento su 40x e acquisire l'immagine.
6. Immunocolorazione multicolore del tessuto mucoso nasale
- Deceratura e idratazione: seguire le stesse indicazioni del punto 5.1.
- Trattamento tampone citrato-fosfato: mettere il tampone citrato-fosfato (pH 6,0) (vedi Tabella dei materiali) in un contenitore adatto al microonde. Scaldare fino a ebollizione, rimuoverlo e quindi aggiungere i vetrini al contenitore. Microonde a fuoco medio per 8 minuti fino a ebollizione, spegnere il fuoco per 8 minuti, quindi passare a fuoco medio-basso per 7 minuti.
- Dopo il raffreddamento naturale, trasferire le fette in PBS (pH 7,4), agitarle e lavarle tre volte con uno shaker decolorante, ogni volta per 5 min.
NOTA: Assicurarsi che il tampone non evapori durante questo processo ed evitare che le fette si secchino.
- Dopo il raffreddamento naturale, trasferire le fette in PBS (pH 7,4), agitarle e lavarle tre volte con uno shaker decolorante, ogni volta per 5 min.
- Bloccare la perossidasi endogena: asciugare le fette, tracciare un cerchio attorno al tessuto con una penna immunoistochimica (per evitare che l'anticorpo defluisca) e applicare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% (acqua ossigenata: acqua pura = 1:9).
- Incubare a temperatura ambiente al buio per 15 min. Dopo il raffreddamento naturale, porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno.
- Bloccante: applicare il siero di capra al 5% all'interno del cerchio e incubare per 30 min.
- Aggiunta di anticorpi primari: rimuovere delicatamente la soluzione bloccante, aggiungere FOXP3 (diluizione: 1:200, vedere la tabella dei materiali) alla fetta e porla in una camera umida. Incubare a 4 °C per una notte.
NOTA: Aggiungere una piccola quantità d'acqua nella camera umida per evitare l'evaporazione degli anticorpi. - Aggiunta di anticorpi secondari: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 minuti ciascuno. Asciugare delicatamente le fette e applicare l'anticorpo secondario (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, vedi Tabella dei materiali) all'interno del cerchio. Incubare a temperatura ambiente per 50 minuti al buio.
- Preparazione della soluzione di diluizione di tiramide: combinare 100 μL di H 2 O2al 3% con 100 mL di 1x TBST (vedi tabella dei materiali).
- Aggiunta di soluzione di lavoro TSA: Miscelare 1 mL di diluente di tiramide con 2 μL di CY3-tiramide per preparare la soluzione di lavoro TSA. Applicare 100 μL di soluzione di lavoro TSA su ciascuna fetta e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Quindi, lavare le fette con PBS tre volte, 5 minuti ogni volta.
NOTA: Preparare e utilizzare immediatamente la soluzione di lavoro TSA e conservarla al buio a 4 °C; È valido per un massimo di 24 ore. - Ripetere i passaggi 6.2-6.8: passare a una diluizione 1:200 di RORγt (colorante fluorescente FICC) e poi a una diluizione 1:200 di TICAM1 (colorante TYP620) (vedi Tabella dei materiali).
- Nuclei controcolorati DAPI: agitare delicatamente le fette per asciugarle, applicare la soluzione colorante DAPI e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
- Autofluorescenza di tempra: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Applicare il quencher di autofluorescenza (vedere Tabella dei materiali) sulle fette, attendere 5 minuti, quindi lavare per 10 minuti.
- Bloccaggio: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Agitare delicatamente le fette per asciugarle e sigillarle con il quencher antifluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
- Microscopia: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio per una chiara visibilità, impostare l'ingrandimento su 20x e 40x e acquisire l'immagine.
NOTA: DAPI ha una lunghezza d'onda di eccitazione UV di 330-380 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (luce blu). FITC ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 465-495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 515-555 nm (luce verde). CY3 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 510-560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm (luce rossa). TYP-690 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 630 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 690 nm (luce rosa).
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Representative Results
Sei ratti SD sono stati indotti con successo nel modello AR attraverso l'iniezione intraperitoneale OVA e la sfida nasale. L'AR è stata indotta in tutti i ratti del gruppo AR, che rappresentavano il 100% del gruppo. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso. Tutte le osservazioni comportamentali hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti (Tabella 2).
I risultati della colorazione H&E al 21° giorno di modellazione hanno rivelato che nei ratti di controllo, le cellule epiteliali e le ciglia della mucosa nasale erano ben disposte, senza segni di infiltrazione di cellule infiammatorie. Al contrario, nel gruppo AR, la mucosa del setto nasale è stata danneggiata e staccata, con notevole infiltrazione di neutrofili (Figura 3).
Confrontando il tessuto della mucosa nasale dei ratti AR con il gruppo di controllo, è stato osservato che l'espressione di RORγt (un fattore di trascrizione specifico per le cellule Th17) e TICAM-1 (molecola linker del recettore Toll-like-1) era aumentata, mentre Foxp3 (un fattore di trascrizione specifico per le cellule Treg) era diminuita (Figura 4).
Figura 1: Il flusso di lavoro sperimentale . (A) Diagramma schematico dell'iniezione intraperitoneale. (B) Diagramma schematico del gocciolamento nasale. (C) Diagramma di flusso della modellizzazione dei ratti con rinite allergica. (D) Diagramma schematico dell'osservazione comportamentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Processo di rimozione nasale . (A) Taglio del tessuto muscolare agli angoli della bocca. (B) Tagliare la connessione tra lo zigomo e la mandibola. (C) Separazione della mandibola. (D) Asportazione della pelle del mascellare. (E) Esposizione della cavità nasale. (F) Taglio della connessione tra la cavità nasale e la mascella. (G) Taglio della connessione tra la cavità nasale e l'osso orbitale. (H) La cavità nasale rimossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative istopatologiche di colorazione H&E il giorno 14 dopo la modellazione AR (n = 6). (A) Le cellule epiteliali e le ciglia nella mucosa nasale dei ratti di controllo erano ben disposte e non è stata osservata alcuna infiltrazione di cellule infiammatorie. (B) La mucosa del setto nasale del gruppo AR è stata danneggiata e distaccata con infiltrazione di neutrofili. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi di colorazione MIF di RORγt, Foxp3 e TICAM-1 (n = 6). Rispetto al gruppo di controllo, l'espressione di RORγt e TICAM-1 nei tessuti della mucosa nasale dei ratti nel gruppo AR è risultata elevata, mentre l'espressione di Foxp3 è risultata diminuita. Barre della scala = 100 μm (pannelli di sinistra); 50 μm (pannelli di destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Principio della tecnica mIF. La tecnica mIF si basa sulla tecnica TSA, che prevede il legame covalente del segnale fluorescente all'antigene. In questo processo, la perossidasi di rafano marcata sull'anticorpo secondario catalizza la transizione del substrato della fluoresceina da uno stato inattivo a uno attivato. Questo stato attivato può legarsi covalentemente alla tirosina sull'antigene, determinando un legame covalente stabile della fluoresceina al campione. Successivamente, gli anticorpi legati in modo non covalente vengono rimossi attraverso la riparazione termica. La procedura viene quindi ripetuta con ulteriori anticorpi primari, anticorpi secondari e fluoresceina per consentire il rilevamento di un antigene completamente diverso. Questa immagine è stata ridisegnata e abbinata ai colori con riferimento al diagramma schematico mIF17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Punteggi | Frequenza degli starnuti | Rhinorrhea | Sfregamento nasale |
| 1 | <3 | secrezione acquosa all'interno della cavità nasale | lievi e occasionali sfregamenti nasali |
| 2 | 4~10 | secrezione acquosa che fuoriesce dal naris anteriore | ripetuti sfregamenti nasali |
| 3 | ≥11 | il viso coperto da abbondanti secrezioni acquose | sfregamenti dal naso al viso |
Tabella 1: Tabella della scala quantitativa del test comportamentale del ratto.
| Individui | Giorno 1 | Giorno 21 |
| Controllo 1 | 0 | 0 |
| Controllo 2 | 0 | 0 |
| Controllo 3 | 0 | 0 |
| Controllo 4 | 0 | 0 |
| Controllo 5 | 0 | 0 |
| Controllo 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabella 2: Risultati del punteggio comportamentale.
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Discussion
La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria non infettiva della mucosa nasale derivante da una combinazione di fattori ambientali e genetici. È diventato un problema di salute globale, che ha un impatto sull'efficienza lavorativa, diminuisce la qualità della vita, compromette il sonno, la funzione cognitiva e causa irritabilità e affaticamento. L'AR colpisce il 10%-20% della popolazione mondiale¹ e comporta costi economici considerevoli, causando perdite annuali fino a 30-50 miliardi di euro nei paesi dell'UE18. Inoltre, diversi studi hanno stabilito una forte associazione tra AR e asma18,19,20, con gli individui che hanno AR che hanno sette volte più probabilità di sviluppare l'asma rispetto a quelli senza AR 21. La ricerca attuale suggerisce che uno squilibrio tra le cellule T helper di tipo 1 (Th1) e le cellule T helper di tipo 2 (Th2) con una propensione verso le cellule Th2 è un contributo significativo all'AR. Le cellule Th2, stimolate dall'interleuchina-4, producono citochine simili a Th2 come IL-5 e IL-13, innescando l'infiammazione nei linfociti B, mastociti, eosinofili e cellule dendritiche22. Inoltre, recenti ricerche sull'AR indicano una forte connessione tra uno squilibrio tra le popolazioni di cellule T helper Th17 e regolatorie (Treg)23. Le cellule Th17 e Treg, entrambe derivate dalle cellule T CD4+, svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario. RORγt è essenziale per la differenziazione delle cellule Th1724, mentre le cellule Treg, con funzioni immunosoppressive, sono fondamentali per mantenere la tolleranza immunitaria. I cambiamenti nell'espressione di Foxp3 influenzano la funzione delle cellule Treg25,26. Pertanto, le alterazioni dei livelli di RORγt e Foxp3 riflettono squilibri Th17/Treg, inducendo potenzialmente una risposta infiammatoria guidata principalmente dalle cellule Th1727. I recettori toll-like (TLR) sono proteine vitali nel sistema immunitario innato dell'organismo, che mediano le vie di segnalazione intracellulare per attivare l'espressione genica specifica28. La ricerca di He Shan et al.29 ha scoperto che le variazioni nel gene TLR4, in particolare le mutazioni eterozigoti CT e TT pure nel locus rs10759930, erano associate allo sviluppo di AR. Dato il ruolo di TICAM-1 come molecola ponte tra TLR3 e TLR4, è stato ipotizzato che l'AR potrebbe essere collegata a TICAM-1. In effetti, i risultati hanno mostrato un'elevata espressione di TICAM-1 nel gruppo AR, in linea con lo studio30 di Xu et al.
La tecnica mIF (immunofluorescenza multiplex) impiegata in questo studio è un metodo di rilevamento relativamente nuovo sviluppato negli ultimi 20 anni. Offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche convenzionali di immunofluorescenza (IF), tra cui una maggiore specificità, sensibilità e produttività, insieme alla capacità di analisi visiva. Questa tecnica si basa sul metodo TSA (Tyramide Signal Amplification), che lega in modo covalente i segnali fluorescenti agli antigeni e rimane inalterato dal riscaldamento a microonde. Ciò consente l'etichettatura multicolore dei tessuti attraverso cicli ripetuti di colorazione fluorescente TSA, seguiti da riscaldamento a microonde per rimuovere gli anticorpi mantenendo il segnale fluorescente 17,31,32 (Figura 5). Vengono quindi applicati algoritmi avanzati per l'identificazione automatica e la segmentazione di regioni tissutali bersaglio che visualizzano strutture specifiche in immagini multimarcate. Ciò consente l'analisi statistica quantitativa delle regioni di interesse, consentendo la valutazione quantitativa dei fenotipi immunitari cellulari e la localizzazione funzionale delle cellule immunitarie. Fornisce inoltre informazioni sul contesto tissutale e sulla distribuzione spaziale33,34.
Tuttavia, tecnicamente, l'mIF si basa ancora sulle tecniche IF tradizionali e deve affrontare sfide come la cross-reattività degli anticorpi e la diafonia ottica. L'uso di più anticorpi può portare a cross-reattività e risultati falsi positivi, mentre la sovrapposizione degli spettri di fluorescenza può comportare la miscelazione di segnali di fluorescenza provenienti da più bersagli, rendendo difficile la differenziazione ad occhio nudo e aumentando la dipendenza da algoritmi specializzati di analisi delle immagini35. Inoltre, poiché i coloranti fluorescenti vengono utilizzati per marcare gli anticorpi, l'mIF può essere influenzato dall'estinzione e dallo sbiancamento della fluorescenza, portando a una diminuzione dell'intensità del segnale. In particolare, mentre le tecniche di IF convenzionali valutano l'intero tessuto, le tecniche di mIF si concentrano su specifiche regioni di interesse all'interno della sezione tissutale per l'analisi. Ciò può introdurre deviazioni dalla realtà a causa dell'eterogeneità tissutale, con conseguente quantificazione istologica imprecisa o l'omissione di eventi rari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
