Summary
Denne protokol beskriver en flerfarvet immunofluorescensteknik til evaluering af rottemodellen for allergisk rhinitis.
Abstract
Allergisk rhinitis (AR) er en kronisk, ikke-infektiøs inflammatorisk sygdom i næseslimhinden, primært medieret af specifikt immunglobulin E (IgE), der påvirker ca. 10% -20% af verdens befolkning. Mens immunfluorescens (IF) farvning længe har været en standardteknik til påvisning af sygdomsspecifik proteinekspression, er konventionelle IF-teknikker begrænsede i deres evne til at detektere ekspressionsniveauerne for tre eller flere proteiner i den samme prøve. Derfor er flerfarvede IF-teknikker blevet udviklet i de senere år, som muliggør samtidig mærkning af flere mål i celler eller væv.
Denne protokol giver et omfattende overblik over processen til etablering af en rottemodel af AR, opnåelse af næseslimhindeprøver og de tekniske procedurer for flerfarvet immunofluorescens. Alle rotter i AR-gruppen udviste typiske symptomer som nysen, løbende næse og kløende næse, hvor adfærdsmæssige observationer scorede ≥5 point. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning afslørede øgede inflammatoriske celletal og forstyrret nasal slimhindeintegritet i AR-gruppen. Flerfarvet immunfluorescens (mIF) viste øget ekspression af RORγt og TICAM-1, mens Foxp3-ekspression faldt i næseslimhindevævet hos AR-rotter.
Introduction
Allergisk rhinitis (AR) er en kronisk, ikke-infektiøs inflammatorisk sygdom i næseslimhinden, primært medieret af specifikt immunglobulin E (IgE)1,2. Det er kendetegnet ved symptomer som nysen, løbende næse, næsestop og nasal kløe. Med industrialisering og urbanisering øges forekomsten af AR gradvist og påvirker ca. 10% -20% af verdens befolkning1. Immunofluorescensteknikken (IF) er en fluorescerende farvningsmetode, der anvender en antistof-antigenbindingsreaktion. Det kan anvendes til at detektere og kvantificere fordelingen og ekspressionsniveauerne af specifikke proteiner i biologiske væv eller celler. I AR-forskning kan IF samtidig detektere flere mål, herunder AR-relaterede cytokiner, inflammatoriske celler, receptorer og mere, hvilket letter udforskningen af AR-patogenese og virkningerne af lægemidler 3,4,5,6.
Den flerfarvede immunfluorescens (mIF) farvningsproces ligner meget traditionel IF med tilsætning af et antistofelueringstrin under hver farvningsrunde. Denne ændring muliggør samtidig påvisning af flere biomarkører på samme vævssektion gennem sekventiel enkeltmærkning og flere runder af genfarvning. mIF er baseret på tyramidsignalforstærkning (TSA), hvilket muliggør gentagne cyklusser med TSA-fluorescerende farvning og brug af mikrobølgeopvarmning til at fjerne antistoffer og samtidig bevare fluorescerende signaler 7,8. Sammenlignet med konventionel IF tilbyder mIF flere fordele: (1) det kan detektere svagt udtrykte antigener, der er udfordrende at identificere med konventionel IF 9,10; (2) det giver farvning af høj kvalitet med et forbedret signal-støj-forhold; 3) det gør det muligt at kvantificere vævsspecifikke strukturer og interesseområder11 (4) multiplexing af flere veje udnytter effektivt væv og bevarer begrænsede patologiske ressourcer12; (5) Multiparameteranalyse gennem mIF giver dybere indsigt i væv og afdækker skjult biologisk information13.
Samlet set tillader mIF observation af forskellige antigenekspressioner og distributioner inden for samme prøve, hvilket letter undersøgelsen af målproteiner. I fremtiden vil forskere, der søger at forstå ekspressionen og fordelingen af flere målproteiner, finde denne teknik et værdifuldt valg. Denne undersøgelse demonstrerer anvendelsen af mIF til farvning af næseslimhindeprøver fra rotter med AR og evaluerer etableringen af en rottemodel af AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den eksperimentelle protokol og procedurer har modtaget godkendelse fra administrations- og dyreforskningsudvalget ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (rekordnummer: 2022DL-010). Otte uger gamle hanrotter af Sprague Dawley (SD), der vejede 180-200 g, blev fremstillet kommercielt (se materialetabel) og anbragt under en naturlig lys/mørk cyklus med kontrolleret temperatur (23 ± 2 °C) og relativ luftfugtighed (55 % ± 10 %). Tolv rotter blev tilfældigt opdelt i to grupper: kontrolgruppen og AR-gruppen. Alle rotter blev akklimatiseret til disse forhold og fik fri adgang til mad og vand i en uge før forsøget.
1. Etablering af en rottemodel af AR
- Fremstilling af sensibiliserende opløsning: 30 mg ægalbumin (OVA) og 3 g Al(OH)3 suspenderes i 100 ml saltvand (se materialetabel)14,15.
- Grundlæggende sensibilisering: Tag fat og hold den helt vågne rotte med maven opad. Desinficer maven ved hjælp af 75% alkoholgennemblødte bomuldskugler. Brug en 1,5 ml sprøjte til at injicere 1 ml af den sensibiliserende opløsning fremstillet i trin 1.1 i venstre bughule hos rotterne i AR-gruppen. Gentag injektionen én gang hver anden dag i 14 dage (figur 1A).
BEMÆRK: Sørg for, at rottens hoved er placeret lavere end halen for at forhindre beskadigelse af tyk- og tyndtarmen, når sprøjten indsættes. Injektionsstedet er placeret 1,5 cm fra den ventrale midterlinje. Rotter i kontrolgruppen skal have intraperitoneale injektioner af 1 ml normalt saltvand en gang hver anden dag i 14 dage. - Nasal udfordring: Administrer 50 μL 5% OVA via næsedråber ved hjælp af en 100 μL pipette (figur 1B) dagen efter basal sensibilisering, gentag denne procedure i 7 dage (figur 1C).
BEMÆRK: Forbered 5% OVA-opløsningen ved at blande 5 g OVA med 100 ml saltvand. For kontrolgruppen administreres dråber af samme volumen saltvand.
2. Adfærdsmæssig scoring af rotter
- Inden for 30 minutter efter at have gennemført den sidste næseudfordring, observer og registrer rotterne ved hjælp af et digitalt kamera for at identificere symptomer som næseskrabning, nysen og løbende næse baseret på scoringskriterierne skitseret i tabel 1 (figur 1D).
BEMÆRK: Bekræftelsen af vellykket AR-modellering er baseret på at opnå en samlet score på ≥5 point14.
3. Erhvervelse af næseslimhindeprøver
- Ofre rotter: ofre rotterne ved at udsætte dem for en overdosis CO2. Derefter desinficeres rotterne med 75% ethanol (se materialetabel). Brug en skalpel til at lave et snit langs de to hjørner af munden for at udsætte muskelvævet (figur 2A). Skær derefter leddene i den zygomatiske knogle og underkæben på begge sider af kraniet ved hjælp af vævsaks (figur 2B), og fjern underkæben (figur 2C).
- Eksponering for næsehulen: Adskil huden på maxillaen ved hjælp af en hemostat (figur 2D) for at udsætte næsehulen (figur 2E). Skær knogleforbindelsen mellem næsehulen og maxillaen med vævsaks (figur 2F). Afbryd derefter forbindelsen mellem næsehulen og orbitalbenene på begge sider ved de infraorbitale foramen (figur 2G) og fjern næsehulen (figur 2H).
- Fastgørelse: Anbring det ekstraherede næsehulrum i 4% paraformaldehyd til fiksering og opbevar det ved stuetemperatur i 24-72 timer (se materialetabel).
BEMÆRK: Sørg for, at mængden af anvendt paraformaldehydfikseringsmiddel er tilstrækkelig til fuldstændigt at dække sektionerne for korrekt fiksering.
4. Forbehandling af næseslimhindeprøver
- Afkalkning: Begynd med at fastgøre det fjernede væv fra trin 3.1. Vask dem tre gange med PBS i 20 minutter hver. Følg dette ved at vaske dem tre gange med destilleret vand, hver gang i 20 minutter. Derefter afkalkes vævene i en afkalkningsopløsning med et volumen på 20-30 gange vævets ved stuetemperatur.
- Afkalkningsopløsningen (se materialetabellen) skal opretholde en pH-værdi på 7,2-7,4. Til sidst placeres det afkalkede væv i en dehydreringsboks.
BEMÆRK: Afkalkningsopløsningen skal udskiftes ugentligt. Afkalkningsprocessen kan afsluttes, når vævet blødgør (ca. 2 måneder).
- Afkalkningsopløsningen (se materialetabellen) skal opretholde en pH-værdi på 7,2-7,4. Til sidst placeres det afkalkede væv i en dehydreringsboks.
- Dehydrering og voksning: Overfør dehydreringsboksen til en dehydrator (se materialetabel). Begynd med 75% alkohol i 4 timer, efterfulgt af 85% alkohol i 2 timer, 90% alkohol i 2 timer og 95% alkohol i 1 time.
- Derefter nedsænkes vævet i vandfri ethanol i 30 minutter, gentag processen i yderligere 30 minutter, brug xylen i 5-10 minutter, gentag dette trin i yderligere 5-10 minutter, nedsænk vævet i voks i 1 time, gentag dette trin i endnu en time, og nedsænk til sidst vævet i voks i yderligere 1 time.
- Indlejring: Anbring den smeltede voksblok i indlejringsboksen (se materialetabellen), og opbevar den i en fryser til -20 °C. Når voksen størkner, skal du fjerne den og trimme voksblokken.
- Udskæring: Indsæt den trimmede voksblok i et paraffinmikrotomt (se materialetabel) og skær den i skiver med en tykkelse på 3 μm. Læg skiverne i et 40 °C vandbad på en glidespreder. Flad vævet, løft det derefter med et glasglas og bag det i en 60 ° C ovn.
- Når vandet er fordampet, og voksen er sat korrekt, fjernes glassene, og de opbevares ved en temperatur på 25 °C.
5. H&E-farvning af næseslimhindevæv
- Afvoksning og hydrering: læg skiverne i xylen i 20 min, gentag processen i yderligere 20 minutter, absolut ethanol i 5 minutter, gentag dette trin i yderligere 5 minutter, 75% alkohol i 5 minutter og vask til sidst i 5 min.
- Hæmatopoxylinfarvning: Dispenser 100 μL hæmatoxylinfarvningsopløsning (se materialetabel) i 3-5 minutter ved hjælp af en 100 μL pipette, skyl i 5-10 s, tilsæt 100 μL 0,5% saltsyreethanol i 10-30 s, skyl i 5-10 s, tilsæt 100 μL 0,2% ammoniakvand i 10-30 s og skyl i 30 s.
BEMÆRK: Efter hæmatopoxyfinfarvning er differentiering med 0,5% saltsyreethanol nødvendig for at fjerne overdreven hæmatopylinfarvestof bundet til kernen og absorberet af cytoplasmaet. Når eosinfarvning udføres, vil kernerne og cytoplasmaet være tydeligt farvede. Skiverne vises røde eller lyserøde efter differentiering med 0,5% saltsyreethanol, så skyl straks efter differentiering for at fjerne syren fra vævsskiverne for at stoppe differentieringen. Brug derefter 0,2% ammoniakvand til at forbedre nuklear farvning. - Eosinfarvning: Brug en 100 μL pipette til at dispensere 100 μL eosinfarvningsopløsning (se materialetabel) i 5 minutter og skyl i 30 s.
- Dehydrering og forsegling: Nedsænk skiverne i absolut ethanol i 5 minutter, gentag processen i yderligere 5 minutter, gentag endnu en gang i 5 minutter, dimethyl i 5 minutter og xylen i 5 minutter. Til sidst forsegles med neutral harpiks (se materialetabel).
- Placering af den farvede sektion på mikroskopet: Placer den farvede sektion på mikroskopet, juster mikroskopets fokus, indtil billedet er tydeligt synligt, indstil forstørrelsen til 40x og tag billedet.
6. Flerfarvet immunfarvning af næseslimhindevæv
- Afvoksning og hydrering: Følg det samme som nævnt i trin 5.1.
- Citratphosphatbufferbehandling: Anbring citratphosphatbufferen (pH 6,0) (se materialetabellen) i en mikrobølgesikker beholder. Opvarm det til kogning, fjern det, og tilsæt derefter diasene til beholderen. Mikrobølgeovn på medium varme i 8 min indtil kogning, sluk for varmen i 8 min, og skift derefter til medium-lav varme i 7 min.
- Efter naturlig afkøling overføres skiverne til PBS (pH 7,4), rystes og vaskes tre gange med en affarvningsryster, hver gang i 5 minutter.
BEMÆRK: Sørg for, at bufferen ikke fordamper under denne proces, og undgå, at skiverne tørrer ud.
- Efter naturlig afkøling overføres skiverne til PBS (pH 7,4), rystes og vaskes tre gange med en affarvningsryster, hver gang i 5 minutter.
- Blokering af endogen peroxidase: tør skiverne, tegn en cirkel rundt om vævet med en immunohistokemisk pen (for at forhindre antistoffet i at strømme væk) og påfør 3% hydrogenperoxidopløsning (hydrogenperoxid: rent vand = 1: 9).
- Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 15 min. Efter naturlig afkøling anbringes skiverne i PBS (pH 7,4) og rystes på en affarvningsryster i tre cyklusser på hver 5 minutter.
- Blokering: påfør 5% gedeserum inden for cirklen og inkuber i 30 min.
- Primær antistoftilsætning: Fjern forsigtigt blokeringsopløsningen, tilsæt FOXP3 (fortynding: 1:200, se materialetabel) til skiven, og anbring den i et fugtigt kammer. Der inkuberes ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Tilsæt en lille mængde vand til det fugtige kammer for at forhindre fordampning af antistoffer. - Sekundær antistoftilsætning: Anbring skiverne i PBS (pH 7,4) og ryst dem på en affarvningsryster i tre cyklusser på 5 minutter hver. Tør forsigtigt skiverne og påfør det sekundære antistof (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, se Materialetabel) inden for cirklen. Inkuber ved stuetemperatur i 50 minutter i mørke.
- Fremstilling af tyramidfortyndingsopløsning: Kombiner 100 μL 3%H2O2med 100 ml 1x TBST (se materialetabel).
- Tilsætning af TSA-arbejdsløsning: Bland 1 ml tyramidfortyndingsmiddel med 2 μL CY3-tyramid for at forberede TSA-arbejdsløsningen. Påfør 100 μL TSA-arbejdsløsning på hver skive og inkuber ved stuetemperatur i mørke i 10 minutter. Vask derefter skiverne med PBS tre gange, 5 min hver gang.
BEMÆRK: Forbered og brug TSA-arbejdsløsningen med det samme, og opbevar den ved 4 °C i mørke; Den er gyldig i op til 24 timer. - Gentag trin 6.2-6.8: Skift til en 1:200 fortynding af RORγt (FITC fluorescerende farvestof) og derefter til en 1:200 fortynding af TICAM1 (TYP620 farvestof) (se materialetabel).
- DAPI-modfarvede kerner: ryst skiverne forsigtigt for at tørre dem, påfør DAPI-farvningsopløsning og inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter i mørke.
- Slukning af autofluorescens: Anbring skiverne i PBS (pH 7,4) og ryst dem på en affarvningsryster i tre cyklusser på 5 minutter hver. Påfør autofluorescensslukkeren (se materialetabel) på skiverne, vent i 5 min, og vask derefter i 10 min.
- Blokering: Anbring skiverne i PBS (pH 7,4) og ryst dem på en affarvningsryster i tre cyklusser på hver 5 minutter. Ryst forsigtigt skiverne for at tørre dem og forsegl dem med antifluorescensslukkeren (se materialetabel).
- Mikroskopi: Placer den farvede sektion på mikroskopet, juster mikroskopets fokus for klar synlighed, indstil forstørrelsen til 20x og 40x, og tag billedet.
BEMÆRK: DAPI har en UV-excitationsbølgelængde på 330-380 nm og en emissionsbølgelængde på 420 nm (blåt lys). FITC har en excitationsbølgelængde på 465-495 nm og en emissionsbølgelængde på 515-555 nm (grønt lys). CY3 har en excitationsbølgelængde på 510-560 nm og en emissionsbølgelængde på 590 nm (rødt lys). TYP-690 har en excitationsbølgelængde på 630 nm og en emissionsbølgelængde på 690 nm (lyserødt lys).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks SD-rotter blev med succes induceret i AR-modellen gennem OVA intraperitoneal injektion og nasal udfordring. AR blev induceret hos alle rotter i AR-gruppen og tegnede sig for 100% af gruppen. Alle rotter i AR-gruppen udviste typiske symptomer som nysen, løbende næse og kløende næse. Alle adfærdsmæssige observationer scorede ≥5 point (tabel 2).
H&E-farvningsresultater på den 21. dag med modellering afslørede, at næseslimhindens epitelceller og cilier hos kontrolrotterne var velordnede uden tegn på inflammatorisk celleinfiltration. Omvendt blev næseseptumets slimhinde i AR-gruppen beskadiget og løsrevet med bemærkelsesværdig neutrofil infiltration (figur 3).
Ved sammenligning af næseslimhindevævet hos AR-rotter med kontrolgruppen blev det observeret, at ekspressionen af RORγt (en Th17-cellespecifik transkriptionsfaktor) og TICAM-1 (Toll-like receptorlinkermolekyle-1) blev øget, mens Foxp3 (en Treg-cellespecifik transkriptionsfaktor) blev reduceret (figur 4).
Figur 1: Den eksperimentelle arbejdsgang . (A) Skematisk diagram over intraperitoneal injektion. (B) Skematisk diagram over næsedryp. (C) Flowchart af modellering af allergiske rhinitis rotter. (D) Skematisk diagram over adfærdsmæssig observation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nasal fjernelse proces . (A) Skæring af muskelvæv i mundvigene. (B) Skæring af forbindelsen mellem kindbenet og underkæben. (C) Adskillelse af underkæben. (D) Fjernelse af maxillaens hud. (E) Eksponering af næsehulen. (F) Skæring af forbindelsen mellem næsehulen og maxillaen. (G) Skæring af forbindelsen mellem næsehulen og orbitalbenet. (H) Det fjernede næsehulrum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative histopatologiske H&E-farvningsbilleder på dag 14 efter AR-modellering (n = 6). (A) Epitelcellerne og cilierne i næseslimhinden hos kontrolrotterne var velordnede, og der blev ikke observeret nogen inflammatorisk celleinfiltration. (B) Slimhinden i næseskillevæggen i AR-gruppen blev beskadiget og løsrevet med neutrofilinfiltration. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: MIF-farvningsanalyse af RORγt, Foxp3 og TICAM-1 (n = 6). Sammenlignet med kontrolgruppen var ekspressionen af RORγt og TICAM-1 i næseslimhindevævet hos rotter i AR-gruppen forhøjet, mens ekspressionen af Foxp3 blev reduceret. Skalastænger = 100 μm (venstre paneler); 50 μm (højre paneler). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Princippet om mIF-teknik. mIF-teknikken er baseret på TSA-teknikken, som involverer kovalent binding af fluorescerende signal til antigenet. I denne proces katalyserer peberrodsperoxidasemærket på det sekundære antistof overgangen af fluoresceinsubstratet fra en inaktiv til en aktiveret tilstand. Denne aktiverede tilstand kan kovalent binde til tyrosin på antigenet, hvilket resulterer i en stabil kovalent binding af fluorescein til prøven. Derefter fjernes ikke-kovalent bundne antistoffer gennem termisk reparation. Proceduren gentages derefter med yderligere primære antistoffer, sekundære antistoffer og fluorescein for at muliggøre påvisning af et helt andet antigen. Dette billede blev tegnet og farvematchet med henvisning til det skematiske diagrammIF 17. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Score | Nysen frekvens | Næseflåd | Nasal gnidning |
| 1 | <3 | vandig udledning i næsehulen | lette og lejlighedsvise næsegnidninger |
| 2 | 4~10 | vandig udledning, der spildes ud af den forreste naris | gentagne næsegnidninger |
| 3 | ≥11 | ansigtet dækket af rigelig vandig udledning | gnidninger fra næse til ansigt |
Tabel 1: Kvantitativ skalatabel over rotteadfærdstest.
| Enkeltpersoner | Dag 1 | Dag 21 |
| Kontrol 1 | 0 | 0 |
| Kontrol 2 | 0 | 0 |
| Kontrol 3 | 0 | 0 |
| Kontrol 4 | 0 | 0 |
| Kontrol 5 | 0 | 0 |
| Kontrol 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabel 2: Resultater af adfærdsmæssig scoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allergisk rhinitis (AR) er en ikke-infektiøs inflammatorisk sygdom i næseslimhinden som følge af en kombination af miljømæssige og genetiske faktorer. Det er blevet et globalt sundhedsproblem, der påvirker arbejdseffektiviteten, mindsker livskvaliteten, forringer søvn, kognitiv funktion og forårsager irritabilitet og træthed. AR påvirker 10-20 % af verdens befolkning¹ og medfører betydelige økonomiske omkostninger og forårsager årlige tab på op til 30-50 milliarder euro i EU-landene18. Desuden har flere undersøgelser etableret en stærk sammenhæng mellem AR og astma18,19,20, hvor personer, der har AR, er syv gange mere tilbøjelige til at udvikle astma end dem uden AR 21. Nuværende forskning tyder på, at en ubalance mellem type 1-hjælper-T-celler (Th1) og type 2-hjælper-T-celler (Th2) med en bias mod Th2-celler er en væsentlig bidragyder til AR. Th2-celler, stimuleret af interleukin-4, producerer Th2-lignende cytokiner såsom IL-5 og IL-13, der udløser betændelse i B-lymfocytter, mastceller, eosinofiler og dendritiske celler22. Desuden indikerer nyere AR-forskning en stærk forbindelse mellem en ubalance i hjælper-Th17/regulatoriske T-cellepopulationer (Treg)23. Th17- og Treg-celler, begge afledt af CD4 + T-celler, spiller kritiske roller i immunsystemet. RORγt er afgørende for Th17-celledifferentiering24, mens Treg-celler med immunsuppressive funktioner er nøglen til at opretholde immuntolerance. Ændringer i Foxp3-ekspression påvirker Treg-cellefunktionen25,26. Således afspejler ændringer i RORγt- og Foxp3-niveauer Th17/Treg-ubalancer, hvilket potentielt inducerer et inflammatorisk respons, der primært drives af Th17-celler27. Toll-lignende receptorer (TLR'er) er vitale proteiner i kroppens medfødte immunsystem, der medierer intracellulære signalveje for at aktivere specifik genekspression28. Forskning af He Shan et al.29 viste, at variationer i TLR4-genet, specifikt CT heterozygote og TT rene mutationer på rs10759930 locus, var forbundet med AR-udvikling. I betragtning af TICAM-1's rolle som bromolekylet mellem TLR3 og TLR4 blev det antaget, at AR kunne være forbundet med TICAM-1. Faktisk viste resultaterne forhøjet TICAM-1-ekspression i AR-gruppen, i overensstemmelse med Xu et al.'s undersøgelse30.
mIF-teknikken (Multiplex immunofluorescens), der anvendes i denne undersøgelse, er en relativt ny detektionsmetode, der er udviklet i løbet af de sidste 20 år. Det giver flere fordele i forhold til konventionelle immunfluorescens (IF) teknikker, herunder øget specificitet, følsomhed og gennemstrømning sammen med evnen til visuel analyse. Denne teknik er baseret på TSA-metoden (Tyramid Signal Amplification), som kovalent binder fluorescerende signaler til antigener og forbliver upåvirket af mikrobølgeopvarmning. Dette muliggør flerfarvet mærkning af væv gennem gentagne cyklusser af TSA-fluorescerende farvning efterfulgt af mikrobølgeopvarmning for at fjerne antistoffer, samtidig med at fluorescerende signal bevares 17,31,32 (figur 5). Avancerede algoritmer anvendes derefter til automatisk identifikation og segmentering af målvævsregioner, der viser specifikke strukturer i multilabelede billeder. Dette muliggør kvantitativ statistisk analyse af områder af interesse, hvilket muliggør kvantitativ vurdering af cellulære immunfænotyper og funktionel lokalisering af immunceller. Det giver også information om vævskontekst og rumlig fordeling33,34.
Teknisk set er mIF dog stadig afhængig af traditionelle IF-teknikker og står over for udfordringer som antistofkrydsreaktivitet og optisk krydstale. Brugen af flere antistoffer kan føre til krydsreaktivitet og falsk-positive resultater, mens overlappende fluorescensspektre kan resultere i blanding af fluorescenssignaler fra flere mål, hvilket gør differentiering med det blotte øje udfordrende og øger afhængigheden af specialiserede billedanalysealgoritmer35. Da fluorescerende farvestoffer desuden bruges til at mærke antistoffer, kan mIF påvirkes af fluorescensdæmpning og blegning, hvilket fører til nedsat signalintensitet. Især mens konventionelle IF-teknikker evaluerer hele vævet, fokuserer mIF-teknikker på specifikke områder af interesse inden for vævssektionen til analyse. Dette kan medføre afvigelser fra virkeligheden på grund af vævsheterogenitet, hvilket potentielt kan resultere i unøjagtig histologisk kvantificering eller udeladelse af sjældne hændelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
