Summary
Dit protocol beschrijft een meerkleurige immunofluorescentietechniek voor het evalueren van het rattenmodel van allergische rhinitis.
Abstract
Allergische rhinitis (AR) is een chronische, niet-infectieuze ontstekingsziekte van het neusslijmvlies, voornamelijk gemedieerd door specifiek immunoglobuline E (IgE), die ongeveer 10%-20% van de wereldbevolking treft. Hoewel immunofluorescentie (IF)-kleuring lange tijd een standaardtechniek is geweest voor het detecteren van ziektespecifieke eiwitexpressie, zijn conventionele IF-technieken beperkt in hun vermogen om de expressieniveaus van drie of meer eiwitten in hetzelfde monster te detecteren. Daarom zijn er de afgelopen jaren meerkleurige IF-technieken ontwikkeld, die het mogelijk maken om meerdere doelen in cellen of weefsels tegelijkertijd te labelen.
Dit protocol biedt een uitgebreid overzicht van het proces voor het opstellen van een rattenmodel van AR, het verkrijgen van neusslijmvliesmonsters en de technische procedures voor meerkleurige immunofluorescentie. Alle ratten in de AR-groep vertoonden typische symptomen zoals niezen, een loopneus en een jeukende neus, waarbij gedragsobservaties ≥5 punten scoorden. Hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring onthulden een verhoogd aantal ontstekingscellen en verstoorde de integriteit van het neusslijmvlies in de AR-groep. Meerkleurige immunofluorescentie (mIF) vertoonde een verhoogde expressie van RORγt en TICAM-1, terwijl de expressie van Foxp3 afnam in het neusslijmvliesweefsel van AR-ratten.
Introduction
Allergische rhinitis (AR) is een chronische, niet-infectieuze ontstekingsziekte van het neusslijmvlies die voornamelijk wordt gemedieerd door specifiek immunoglobuline E (IgE)1,2. Het wordt gekenmerkt door symptomen zoals niezen, een loopneus, verstopte neus en jeuk aan de neus. Met industrialisatie en verstedelijking neemt de prevalentie van AR geleidelijk toe, wat ongeveer 10%-20% van de wereldbevolkingtreft1. De immunofluorescentie (IF)-techniek is een fluorescerende kleuringsmethode die gebruik maakt van een antilichaam-antigeenbindingsreactie. Het kan worden gebruikt om de distributie- en expressieniveaus van specifieke eiwitten in biologische weefsels of cellen te detecteren en te kwantificeren. In AR-onderzoek kan IF tegelijkertijd meerdere doelen detecteren, waaronder AR-gerelateerde cytokines, ontstekingscellen, receptoren en meer, waardoor de verkenning van AR-pathogenese en de effecten van geneesmiddelen 3,4,5,6 wordt vergemakkelijkt.
Het meerkleurige immunofluorescentiekleuringsproces (mIF) lijkt sterk op het traditionele IF, met de toevoeging van een antilichaamelutiestap tijdens elke kleuringsronde. Deze modificatie maakt de gelijktijdige detectie van meerdere biomarkers op dezelfde weefselsectie mogelijk door middel van sequentiële enkelvoudige labeling en meerdere rondes van herkleuring. mIF is gebaseerd op tyramidesignaalversterking (TSA), waardoor herhaalde cycli van TSA-fluorescerende kleuring en het gebruik van microgolfverwarming mogelijk zijn om antilichamen te verwijderen met behoud van fluorescerende signalen 7,8. In vergelijking met conventionele IF biedt mIF verschillende voordelen: (1) het kan zwak tot expressie gebrachte antigenen detecteren die moeilijk te identificeren zijn met conventionele IF 9,10; (2) het zorgt voor hoogwaardige kleuring met een verbeterde signaal-ruisverhouding; (3) het maakt de kwantificering mogelijk van weefselspecifieke structuren en interessegebieden11; (4) multiplexing van meerdere routes maakt efficiënt gebruik van weefsels en behoudt beperkte pathologische middelen12; (5) multiparameteranalyse door middel van mIF biedt diepere inzichten in weefsels en legt verborgen biologische informatie bloot13.
Over het algemeen maakt mIF de observatie van verschillende antigeenexpressies en -verdelingen binnen hetzelfde monster mogelijk, wat de studie van doeleiwitten vergemakkelijkt. In de toekomst zullen onderzoekers die de expressie en distributie van meerdere doeleiwitten willen begrijpen, deze techniek een waardevolle keuze vinden. Deze studie demonstreert de toepassing van mIF voor het kleuren van neusslijmvliesmonsters van ratten met AR en evalueert de opstelling van een rattenmodel van AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol en de procedures zijn goedgekeurd door de Administrative and Animal Research Committee van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Recordnummer: 2022DL-010). Acht weken oude mannelijke Sprague Dawley (SD) ratten, met een gewicht van 180-200 g, werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel) en gehuisvest onder een natuurlijke licht/donker-cyclus met gecontroleerde temperatuur (23 ± 2 °C) en relatieve vochtigheid (55% ± 10%). Twaalf ratten werden willekeurig verdeeld in twee groepen: de controlegroep en de AR-groep. Alle ratten werden aan deze omstandigheden gewend en kregen een week voor de proef gratis toegang tot voedsel en water.
1. Opstellen van een rattenmodel van AR
- Bereiding van de sensibiliserende oplossing: suspendeer 30 mg ovalbumine (OVA) en 3 g Al(OH)3 in 100 ml zoutoplossing (zie materiaaltabel)14,15.
- Basissensibilisatie: pak de volledig wakkere rat vast en houd hem vast met zijn buik naar boven gericht. Desinfecteer de buik met wattenbolletjes die voor 75% alcohol zijn doordrenkt. Gebruik een spuit van 1,5 ml om 1 ml van de sensibiliserende oplossing bereid in stap 1.1 in de linker buikholte van de ratten in de AR-groep te injecteren. Herhaal deze injectie eens in de twee dagen gedurende 14 dagen (Figuur 1A).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de kop van de rat lager is geplaatst dan zijn staart om schade aan de dikke en dunne darm te voorkomen bij het inbrengen van de spuit. De injectieplaats bevindt zich op 1,5 cm van de ventrale middellijn. Ratten in de controlegroep moeten gedurende 14 dagen eenmaal per twee dagen intraperitoneale injecties van 1 ml normale zoutoplossing krijgen. - Neusprovocatie: Dien 50 μL 5% OVA toe via neusdruppels met behulp van een pipet van 100 μl (Figuur 1B) op de dag na de basale sensibilisatie, en herhaal deze procedure gedurende 7 dagen (Figuur 1C).
OPMERKING: Bereid de 5% OVA-oplossing door 5 g OVA te mengen met 100 ml zoutoplossing. Dien voor de controlegroep druppels van hetzelfde volume zoutoplossing toe.
2. Gedragsscore van ratten
- Observeer en registreer de ratten binnen 30 minuten na het voltooien van de laatste neusprovocatie met behulp van een digitale camera om symptomen zoals neuskrabben, niezen en een loopneus te identificeren, op basis van de scorecriteria beschreven in tabel 1 (figuur 1D).
OPMERKING: De bevestiging van succesvolle AR-modellering is gebaseerd op het behalen van een totaalscore van ≥5 punten14.
3. Verwerving van neusslijmvliesmonsters
- Ratten offeren: offer de ratten op door ze bloot te stellen aan een overdosis CO2 . Desinfecteer daarna de ratten met 75% ethanol (zie Materiaaltabel). Gebruik een scalpel om een incisie langs de twee mondhoeken te maken om het spierweefsel bloot te leggen (Figuur 2A). Knip vervolgens de gewrichten van het jukbeen en de onderkaak aan beide zijden van de schedel door met een weefselschaar (Figuur 2B) en verwijder de onderkaak (Figuur 2C).
- Blootstelling van de neusholte: scheid de huid van de bovenkaak met behulp van een hemostaat (Figuur 2D) om de neusholte bloot te leggen (Figuur 2E). Knip de benige verbinding tussen de neusholte en de bovenkaak door met een weefselschaar (Figuur 2F). Verbreek vervolgens de verbinding tussen de neusholte en de orbitale botten aan beide zijden bij het infraorbitale foramen (Figuur 2G) en verwijder de neusholte (Figuur 2H).
- Fixatie: plaats de geëxtraheerde neusholte in 4% paraformaldehyde voor fixatie en bewaar deze 24-72 uur bij kamertemperatuur (zie Materiaaltabel).
NOTITIE: Zorg ervoor dat de hoeveelheid paraformaldehyde die wordt gebruikt fixeermiddel voldoende is om de secties volledig te bedekken voor een goede fixatie.
4. Voorbewerking van neusslijmvliesmonsters
- Ontkalken: begin met het fixeren van de verwijderde weefsels uit stap 3.1. Was ze drie keer met PBS gedurende elk 20 minuten. Daarna was je ze drie keer met gedestilleerd water, telkens gedurende 20 minuten. Ontkalk vervolgens de weefsels in een ontkalkingsoplossing met een volume van 20-30 keer dat van de weefsels bij kamertemperatuur.
- De ontkalkingsoplossing (zie Materiaaltabel) moet een pH van 7,2-7,4 behouden. Plaats ten slotte het ontkalkte weefsel in een uitdrogingsdoos.
OPMERKING: De ontkalkingsoplossing moet wekelijks worden ververst. Het ontkalkingsproces kan worden beëindigd wanneer het weefsel zachter wordt (ongeveer 2 maanden).
- De ontkalkingsoplossing (zie Materiaaltabel) moet een pH van 7,2-7,4 behouden. Plaats ten slotte het ontkalkte weefsel in een uitdrogingsdoos.
- Uitdroging en harsen: breng de uitdrogingsbox over naar een dehydrator (zie Materiaaltabel). Begin met 75% alcohol gedurende 4 uur, gevolgd door 85% alcohol gedurende 2 uur, 90% alcohol gedurende 2 uur en 95% alcohol gedurende 1 uur.
- Dompel het weefsel vervolgens 30 minuten onder in watervrije ethanol, herhaal het proces nog eens 30 minuten, gebruik xyleen gedurende 5-10 minuten, herhaal deze stap nog eens 5-10 minuten, dompel het weefsel 1 uur onder in was, herhaal deze stap nog een uur en dompel het weefsel ten slotte nog eens 1 uur onder in was.
- Inbedden: plaats het gesmolten wasblok in de inbeddingsdoos (zie Materiaaltabel) en bewaar het in een vriezer van -20 °C. Zodra de was stolt, verwijdert u deze en snijdt u het wasblok bij.
- Snijden: steek het bijgesneden wasblok in een paraffinemicrotoom (zie Materiaaltabel) en snijd het in plakjes met een dikte van 3 μm. Leg de plakjes in een waterbad van 40 °C op een glijbaan. Druk het weefsel plat, til het op met een glasglaasje en bak het in een oven van 60 °C.
- Nadat het water is verdampt en de was goed is uitgehard, verwijdert u de objectglaasjes en bewaart u ze bij een temperatuur van 25 °C.
5. H&E-kleuring van neusslijmvliesweefsel
- Dewaxing en hydratatie: leg de plakjes 20 minuten in xyleen, herhaal het proces nog eens 20 minuten, absolute ethanol gedurende 5 minuten, herhaal deze stap nog eens 5 minuten, 75% alcohol gedurende 5 minuten en tot slot was ze gedurende 5 minuten.
- Hematoxylinekleuring: doseer 100 μL hematoxylinekleuringsoplossing (zie materiaaltabel) gedurende 3-5 minuten met een pipet van 100 μL, spoel gedurende 5-10 s, voeg 100 μL 0,5% zoutzuurethanol toe gedurende 10-30 s, spoel gedurende 5-10 s, voeg 100 μL 0,2% ammoniakwater toe gedurende 10-30 s en spoel gedurende 30 s.
OPMERKING: Na hematoxylinekleuring is differentiatie met 0,5% zoutzuurethanol nodig om overtollige hematoxylinekleurstof te verwijderen die aan de kern is gebonden en door het cytoplasma is geabsorbeerd. Wanneer eosinekleuring wordt uitgevoerd, worden de kernen en het cytoplasma duidelijk gekleurd. De plakjes zullen rood of roze lijken na differentiatie met 0,5% zoutzuurethanol, dus spoel onmiddellijk na differentiatie om het zuur uit de weefselplakjes te verwijderen om de differentiatie te stoppen. Gebruik vervolgens 0.2% ammoniakwater om nucleaire kleuring te verbeteren. - Eosinekleuring: gebruik een pipet van 100 μl om 100 μl eosinekleuringsoplossing (zie materiaaltabel) gedurende 5 minuten te doseren en gedurende 30 s te spoelen.
- Drogen en sealen: dompel de plakjes 5 minuten onder in absolute ethanol, herhaal het proces nog eens 5 minuten, herhaal nogmaals gedurende 5 minuten, dimethyl gedurende 5 minuten en xyleen gedurende 5 minuten. Sluit ten slotte af met neutrale hars (zie Tabel met materialen).
- Het gekleurde gedeelte op de microscoop plaatsen: plaats het gekleurde gedeelte op de microscoop, pas de focus van de microscoop aan totdat het beeld duidelijk zichtbaar is, stel de vergroting in op 40x en leg het beeld vast.
6. Veelkleurige immunokleuring van neusslijmvliesweefsel
- Dewaxing en hydratatie: volg hetzelfde als vermeld in stap 5.1.
- Citraat-fosfaatbufferbehandeling: plaats de citraatfosfaatbuffer (pH 6,0) (zie materiaaltabel) in een magnetronbestendige container. Verwarm het tot het kookt, verwijder het en voeg de dia's toe aan de container. Magnetron op middelhoog vuur gedurende 8 minuten tot het kookt, zet het vuur 8 minuten uit en schakel dan over naar middelhoog vuur gedurende 7 minuten.
- Breng de plakjes na natuurlijke afkoeling over naar PBS (pH 7.4), schud en was ze drie keer met een ontkleurende shaker, elke keer gedurende 5 minuten.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de buffer tijdens dit proces niet verdampt en voorkom dat de plakjes uitdrogen.
- Breng de plakjes na natuurlijke afkoeling over naar PBS (pH 7.4), schud en was ze drie keer met een ontkleurende shaker, elke keer gedurende 5 minuten.
- Blokkeren van endogene peroxidase: droog de plakjes, teken een cirkel rond het weefsel met een immunohistochemische pen (om te voorkomen dat het antilichaam wegvloeit) en breng 3% waterstofperoxide-oplossing aan (waterstofperoxide: zuiver water = 1:9).
- Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 min. Leg de plakjes na natuurlijke afkoeling in PBS (pH 7.4) en schud ze op een ontkleurende shaker gedurende drie cycli van elk 5 minuten.
- Blokkeren: breng 5% geitenserum aan binnen de cirkel en incubeer gedurende 30 min.
- Primaire toevoeging van antilichamen: verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing, voeg FOXP3 (verdunning: 1:200, zie Materiaaltabel) toe aan de plak en plaats deze in een vochtige kamer. Incubeer gedurende een nacht bij 4 °C.
NOTITIE: Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan de vochtige kamer om verdamping van antilichamen te voorkomen. - Secundaire toevoeging van antilichamen: plaats de plakjes in PBS (pH 7,4) en schud ze op een ontkleurende shaker gedurende drie cycli van elk 5 minuten. Droog de plakjes voorzichtig af en breng het secundaire antilichaam (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, zie Materiaaltabel) aan in de cirkel. Incubeer 50 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Bereiding van Tyramide-verdunningsoplossing: combineer 100 μL 3% H 2 O2met 100 ml 1x TBST (zie materiaaltabel).
- Toevoeging van TSA-werkoplossing: Meng 1 ml Tyramide-verdunningsmiddel met 2 μL CY3-Tyramide om TSA-werkoplossing te bereiden. Breng 100 μL TSA-werkoplossing aan op elke plak en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de plakjes vervolgens drie keer met PBS, elke keer 5 minuten.
NOTITIE: Bereid en gebruik de TSA-werkoplossing onmiddellijk en bewaar deze bij 4 °C in het donker; Het is maximaal 24 uur geldig. - Herhaal stap 6.2-6.8: schakel over naar een 1:200 verdunning van RORγt (FITC fluorescerende kleurstof) en vervolgens naar een 1:200 verdunning van TICAM1 (TYP620 kleurstof) (zie Tabel met materialen).
- DAPI tegengekleurde kernen: schud de plakjes voorzichtig om ze te drogen, breng DAPI-kleuringsoplossing aan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
- Autofluorescentie blussen: plaats de plakjes in PBS (pH 7,4) en schud ze op een ontkleurende shaker gedurende drie cycli van elk 5 minuten. Breng de autofluorescentie-blusser (zie Materiaaltabel) aan op de plakjes, wacht 5 minuten en was ze vervolgens 10 minuten.
- Blokkeren: plaats de plakjes in PBS (pH 7,4) en schud ze op een ontkleurende shaker gedurende drie cycli van elk 5 minuten. Schud de plakjes voorzichtig om ze te drogen en sluit ze af met de antifluorescentieblusser (zie Materiaaltabel).
- Microscopie: plaats het gekleurde gedeelte op de microscoop, pas de focus van de microscoop aan voor een duidelijke zichtbaarheid, stel de vergroting in op 20x en 40x en leg het beeld vast.
OPMERKING: DAPI heeft een UV-excitatiegolflengte van 330-380 nm en een emissiegolflengte van 420 nm (blauw licht). FITC heeft een excitatiegolflengte van 465-495 nm en een emissiegolflengte van 515-555 nm (groen licht). CY3 heeft een excitatiegolflengte van 510-560 nm en een emissiegolflengte van 590 nm (rood licht). TYP-690 heeft een excitatiegolflengte van 630 nm en een emissiegolflengte van 690 nm (roze licht).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zes SD-ratten werden met succes geïnduceerd in het AR-model door middel van OVA intraperitoneale injectie en nasale provocatie. AR werd geïnduceerd bij alle ratten in de AR-groep, goed voor 100% van de groep. Alle ratten in de AR-groep vertoonden typische symptomen zoals niezen, een loopneus en een jeukende neus. Alle gedragsobservaties scoorden ≥5 punten (tabel 2).
H&E-kleuringsresultaten op de 21edag van modellering toonden aan dat bij de controleratten de epitheelcellen en trilharen van het neusslijmvlies goed gerangschikt waren, zonder tekenen van infiltratie van ontstekingscellen. Omgekeerd was in de AR-groep het slijmvlies van het neustussenschot beschadigd en losgeraakt, met opmerkelijke infiltratie van neutrofielen (Figuur 3).
Bij het vergelijken van het neusslijmvliesweefsel van AR-ratten met de controlegroep, werd waargenomen dat de expressie van RORγt (een Th17-celspecifieke transcriptiefactor) en TICAM-1 (Toll-like receptor linker molecule-1) was verhoogd, terwijl Foxp3 (een Treg-celspecifieke transcriptiefactor) was afgenomen (Figuur 4).
Figuur 1: De experimentele workflow . (A) Schematisch diagram van intraperitoneale injectie. (B) Schematisch diagram van het neusinfuus. (C) Stroomschema van modellering van allergische rhinitis-ratten. (D) Schematisch diagram van gedragsobservatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Neusverwijderingsproces . (A) Snijden van het spierweefsel in de mondhoeken. (B) Het doorsnijden van de verbinding tussen het jukbeen en de onderkaak. (C) Scheiding van de onderkaak. (D) Verwijdering van de huid van de bovenkaak. (E) Het blootleggen van de neusholte. (F) Het doorsnijden van de verbinding tussen de neusholte en de bovenkaak. (G) Het doorsnijden van de verbinding tussen de neusholte en het orbitale bot. (H) De verwijderde neusholte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve histopathologische H&E-kleuringsbeelden op dag 14 na AR-modellering (n = 6). (A) De epitheelcellen en trilharen in het neusslijmvlies van de controleratten waren goed gerangschikt en er werd geen infiltratie van ontstekingscellen waargenomen. (B) Het slijmvlies van het neustussenschot van de AR-groep was beschadigd en losgekomen met neutrofieleninfiltratie. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MIF-kleuringsanalyse van RORγt, Foxp3 en TICAM-1 (n = 6). Vergeleken met de controlegroep was de expressie van RORγt en TICAM-1 in de neusslijmvliesweefsels van ratten in de AR-groep verhoogd, terwijl de expressie van Foxp3 was afgenomen. Schaalbalken = 100 μm (linkerpanelen); 50 μm (rechterpanelen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Principe van de mIF-techniek. De mIF-techniek is gebaseerd op de TSA-techniek, waarbij het fluorescerende signaal covalent aan het antigeen wordt gebonden. In dit proces katalyseert mierikswortelperoxidase-gelabeld op het secundaire antilichaam de overgang van het fluoresceïnesubstraat van een inactieve naar een geactiveerde toestand. Deze geactiveerde toestand kan covalent binden aan de tyrosine op het antigeen, wat resulteert in een stabiele covalente hechting van fluoresceïne aan het monster. Vervolgens worden niet-covalent gebonden antilichamen verwijderd door middel van thermisch herstel. De procedure wordt vervolgens herhaald met extra primaire antilichamen, secundaire antilichamen en fluoresceïne om de detectie van een heel ander antigeen mogelijk te maken. Deze afbeelding is opnieuw getekend en qua kleur afgestemd op het mIF-schematische diagram17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Scores | Niezen frequentie | Rinorroe | Neus wrijven |
| 1 | <3 | waterige afscheiding in de neusholte | lichte en incidentele neuswrijven |
| 2 | 4~10 | waterige afscheiding die uit de voorste naris stroomt | herhaalde neuswrijven |
| 3 | ≥11 | het gezicht bedekt met overvloedige waterige afscheiding | wrijven van neus naar gezicht |
Tabel 1: Kwantitatieve schaaltabel van gedragstest bij ratten.
| Particulieren | Dag 1 | Dag 21 |
| Bediening 1 | 0 | 0 |
| Bediening 2 | 0 | 0 |
| Bediening 3 | 0 | 0 |
| Bediening 4 | 0 | 0 |
| Bediening 5 | 0 | 0 |
| Bediening 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabel 2: Resultaten van gedragsscores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allergische rhinitis (AR) is een niet-infectieuze ontstekingsziekte van het neusslijmvlies als gevolg van een combinatie van omgevings- en genetische factoren. Het is een wereldwijd gezondheidsprobleem geworden, dat de werkefficiëntie beïnvloedt, de kwaliteit van leven vermindert, de slaap en de cognitieve functie aantast en prikkelbaarheid en vermoeidheid veroorzaakt. AR treft 10%-20% van de wereldbevolking¹ en brengt aanzienlijke economische kosten met zich mee, met jaarlijkse verliezen tot 30-50 miljard euro in de EU-landen18. Bovendien hebben verschillende onderzoeken een sterk verband aangetoond tussen AR en astma18,19,20, waarbij personen met AR zeven keer meer kans hebben om astma te ontwikkelen dan mensen zonder AR 21. Huidig onderzoek suggereert dat een onbalans tussen type 1 helper T-cellen (Th1) en type 2 helper T-cellen (Th2) met een voorkeur voor Th2-cellen een belangrijke bijdrage levert aan AR. Th2-cellen, gestimuleerd door interleukine-4, produceren Th2-achtige cytokines zoals IL-5 en IL-13, waardoor ontstekingen ontstaan in B-lymfocyten, mestcellen, eosinofielen en dendritische cellen22. Bovendien wijst recent AR-onderzoek op een sterk verband tussen een onbalans in helper Th17/regulerende T-cel (Treg)-populaties23. Th17- en Treg-cellen, beide afgeleid van CD4+ T-cellen, spelen een cruciale rol in het immuunsysteem. RORγt is essentieel voor Th17-celdifferentiatie24, terwijl Treg-cellen, met immunosuppressieve functies, de sleutel zijn tot het handhaven van immuuntolerantie. Veranderingen in Foxp3-expressie beïnvloeden de Treg-celfunctie25,26. Veranderingen in RORγt- en Foxp3-niveaus weerspiegelen dus Th17/Treg-onevenwichtigheden, die mogelijk een ontstekingsreactie veroorzaken die voornamelijk wordt aangedreven door Th17-cellen27. Toll-like receptoren (TLR's) zijn vitale eiwitten in het aangeboren immuunsysteem van het lichaam, die intracellulaire signaalroutes bemiddelen om specifieke genexpressie te activeren28. Onderzoek door He Shan et al.29 wees uit dat variaties in het TLR4-gen, met name CT-heterozygote en TT-pure mutaties op de rs10759930-locus, geassocieerd waren met AR-ontwikkeling. Gezien de rol van TICAM-1 als het overbruggingsmolecuul tussen TLR3 en TLR4, werd verondersteld dat AR in verband zou kunnen worden gebracht met TICAM-1. De resultaten toonden inderdaad een verhoogde TICAM-1-expressie in de AR-groep, in overeenstemming met de studie van Xu et al.30.
De mIF-techniek (Multiplex immunofluorescentie) die in dit onderzoek wordt gebruikt, is een relatief nieuwe detectiemethode die de afgelopen 20 jaar is ontwikkeld. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele immunofluorescentie (IF)-technieken, waaronder verhoogde specificiteit, gevoeligheid en doorvoer, samen met de mogelijkheid voor visuele analyse. Deze techniek is gebaseerd op de TSA-methode (Tyramide Signal Amplification), die fluorescerende signalen covalent bindt aan antigenen en niet wordt beïnvloed door microgolfverwarming. Dit maakt de meerkleurige etikettering van weefsels mogelijk door middel van herhaalde cycli van TSA-fluorescerende kleuring, gevolgd door microgolfverwarming om antilichamen te verwijderen met behoud van het fluorescerende signaal 17,31,32 (Figuur 5). Geavanceerde algoritmen worden vervolgens toegepast voor de automatische identificatie en segmentatie van doelweefselregio's die specifieke structuren vertonen in multi-gelabelde beelden. Dit maakt kwantitatieve statistische analyse van interessegebieden mogelijk, waardoor de kwantitatieve beoordeling van cellulaire immuunfenotypes en de functionele lokalisatie van immuuncellen mogelijk wordt. Het geeft ook informatie over de weefselcontext en ruimtelijke verdeling33,34.
Technisch gezien vertrouwt mIF echter nog steeds op traditionele IF-technieken en wordt het geconfronteerd met uitdagingen zoals kruisreactiviteit van antilichamen en optische overspraak. Het gebruik van meerdere antilichamen kan leiden tot kruisreactiviteit en vals-positieve resultaten, terwijl overlappende fluorescentiespectra kunnen leiden tot het mengen van fluorescentiesignalen van meerdere doelen, waardoor differentiatie met het blote oog een uitdaging wordt en de afhankelijkheid van gespecialiseerde beeldanalyse-algoritmen toeneemt35. Bovendien, aangezien fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om antilichamen te labelen, kan mIF worden beïnvloed door fluorescentie-uitdoving en bleken, wat leidt tot verminderde signaalintensiteit. Terwijl conventionele IF-technieken het hele weefsel evalueren, richten mIF-technieken zich met name op specifieke interessegebieden binnen de weefselsectie voor analyse. Dit kan leiden tot afwijkingen van de werkelijkheid als gevolg van weefselheterogeniteit, wat mogelijk kan leiden tot onnauwkeurige histologische kwantificering of het weglaten van zeldzame gebeurtenissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
