Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה אימונופלואורסצנטית צבעונית להערכת מודל החולדה של נזלת אלרגית.
Abstract
נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית כרונית ולא זיהומית של רירית האף, המתווכת בעיקר על ידי אימונוגלובולין E ספציפי (IgE), המשפיעה על כ -10%-20% מאוכלוסיית העולם. בעוד צביעת אימונופלואורסנציה (IF) היא כבר מזמן טכניקה סטנדרטית לזיהוי ביטוי חלבונים ספציפיים למחלה, טכניקות IF קונבנציונליות מוגבלות ביכולתן לזהות את רמות הביטוי של שלושה חלבונים או יותר באותה דגימה. כתוצאה מכך, פותחו בשנים האחרונות טכניקות IF צבעוניות, המאפשרות תיוג סימולטני של מטרות מרובות בתאים או ברקמות.
פרוטוקול זה מספק סקירה מקיפה של תהליך הקמת מודל חולדה של AR, קבלת דגימות רירית האף, וההליכים הטכניים עבור immunofluorescence צבעוני. כל החולדות בקבוצת המציאות הרבודה הציגו תסמינים אופייניים כגון התעטשות, נזלת ואף מגרד, כאשר תצפיות התנהגותיות קיבלו ציון של ≥5 נקודות. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) חשפה ספירה מוגברת של תאים דלקתיים ושיבשה את שלמות רירית האף בקבוצת AR. אימונופלואורסצנטיות צבעונית (mIF) הדגימה ביטוי מוגבר של RORγt ו-TICAM-1, בעוד שביטוי Foxp3 ירד ברקמת רירית האף של חולדות AR.
Introduction
נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית כרונית ולא זיהומית של רירית האף המתווכת בעיקר על ידי אימונוגלובולין E ספציפי (IgE)1,2. הוא מאופיין בתסמינים כגון התעטשות, נזלת, גודש באף וגירוד באף. עם התיעוש והעיור, השכיחות של AR עולה בהדרגה, ומשפיעה על כ 10%-20% מאוכלוסיית העולם1. טכניקת האימונופלואורסנציה (IF) היא שיטת צביעה פלואורסצנטית המשתמשת בתגובת קישור נוגדן-אנטיגן. ניתן להשתמש בו כדי לזהות ולכמת את רמות ההתפלגות והביטוי של חלבונים ספציפיים ברקמות או תאים ביולוגיים. במחקר AR, IF יכול לזהות בו זמנית מטרות מרובות, כולל ציטוקינים הקשורים ל- AR, תאים דלקתיים, קולטנים ועוד, מה שמקל על חקר פתוגנזה של AR וההשפעות של תרופות 3,4,5,6.
תהליך הצביעה האימונופלואורסצנטי (mIF) הצבעוני דומה מאוד ל-IF, עם תוספת של שלב פליטת נוגדנים במהלך כל סבב צביעה. שינוי זה מאפשר זיהוי סימולטני של סמנים ביולוגיים מרובים על אותו קטע רקמה באמצעות תיוג יחיד רציף וסבבים מרובים של צביעה מחדש. mIF מבוסס על הגברת אות טירמיד (TSA), המאפשר מחזורים חוזרים ונשנים של צביעה פלואורסצנטית TSA ושימוש בחימום מיקרוגל כדי להסיר נוגדנים תוך שמירה על אותות פלואורסצנטיים 7,8. בהשוואה ל- IF, mIF מציע מספר יתרונות: (1) הוא יכול לזהות אנטיגנים בעלי ביטוי חלש שמאתגרים לזיהוי עם IF 9,10 קונבנציונאלי; (2) הוא מספק צביעה באיכות גבוהה עם יחס אות לרעש משופר; (3) הוא מאפשר כימות של מבנים ספציפיים לרקמות ואזורי עניין11; (4) ריבוב מסלולים מרובים מנצל ביעילות רקמות ומשמר משאבים פתולוגיים מוגבלים12; (5) ניתוח רב-פרמטרים באמצעות mIF מציע תובנות עמוקות יותר על רקמות, וחושף מידע ביולוגי חבוי13.
בסך הכל, mIF מאפשר תצפית של ביטויי אנטיגן שונים והתפלגויות בתוך אותה דגימה, מה שמקל על המחקר של חלבוני המטרה. בעתיד, חוקרים המבקשים להבין את הביטוי וההפצה של חלבוני מטרה מרובים ימצאו בטכניקה זו בחירה בעלת ערך. מחקר זה מדגים את היישום של mIF להכתמת דגימות רירית האף מחולדות עם AR ומעריך את הקמתו של מודל חולדות של AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסוי ונהלי הניסוי קיבלו אישור מהוועדה המנהלית והמחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר שיא: 2022DL-010). חולדות Sprague Dawley (SD) זכרים בני שמונה שבועות, במשקל 180-200 גרם, הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו תחת מחזור אור טבעי / חושך עם טמפרטורה מבוקרת (23 ± 2 מעלות צלזיוס) ולחות יחסית (55% ± 10%). שתים עשרה חולדות חולקו באופן אקראי לשתי קבוצות: קבוצת הביקורת וקבוצת המציאות הרבודה. כל החולדות התאקלמו לתנאים אלה וקיבלו גישה חופשית למזון ומים במשך שבוע לפני הניסוי.
1. הקמת מודל חולדה של מציאות רבודה
- הכנת התמיסה הרגישה: להשהות 30 מ"ג של ovalbumin (OVA) ו 3 גרם של Al(OH)3 ב 100 מ"ל של מלוחים (ראה טבלה של חומרים)14,15.
- רגישות בסיסית: תפסו והחזיקו את החולדה ערה לחלוטין כשבטנה פונה כלפי מעלה. יש לחטא את הבטן באמצעות כדורי צמר גפן ספוגים באלכוהול בשיעור 75%. השתמש מזרק 1.5 מ"ל כדי להזריק 1 מ"ל של פתרון רגיש מוכן בשלב 1.1 לתוך חלל הבטן השמאלי של החולדות בקבוצת AR. חזרו על הזריקה הזו פעם ביומיים במשך 14 יום (איור 1A).
הערה: יש לוודא שראשה של החולדה ממוקם נמוך יותר מזנבה כדי למנוע נזק למעי הגס והדק בעת החדרת המזרק. אתר ההזרקה ממוקם 1.5 ס"מ מקו האמצע הגחוני. חולדות בקבוצת הביקורת צריכות לקבל זריקות intraperitoneal של 1 מ"ל של מלוחים רגילים פעם ביומיים במשך 14 ימים. - אתגר האף: מתן 50 μL של 5% OVA באמצעות טיפות אף באמצעות פיפטה של 100 μL (איור 1B) ביום שלאחר הרגישות הבסיסית, וחזור על הליך זה במשך 7 ימים (איור 1C).
הערה: הכן את תמיסת 5% OVA על-ידי ערבוב 5 גרם של OVA עם 100 מ"ל של מלוחים. עבור קבוצת הביקורת, לתת טיפות של אותו נפח של מלוחים.
2. ניקוד התנהגותי של חולדות
- בתוך 30 דקות לאחר השלמת אתגר האף האחרון, צפו ותיעדו את החולדות באמצעות מצלמה דיגיטלית כדי לזהות תסמינים כמו גירוד באף, התעטשות ונזלת, בהתבסס על קריטריוני הניקוד המתוארים בטבלה 1 (איור 1D).
הערה: האישור של מידול AR מוצלח מבוסס על השגת ציון כולל של ≥5 נקודות14.
3. רכישת דגימות רירית האף
- הקרבת חולדות: הקריבו את החולדות על ידי חשיפתן למנת יתר שלCO2. לאחר מכן, יש לחטא את החולדות באתנול 75% (ראו טבלת חומרים). השתמשו באזמל כדי לבצע חתך לאורך שתי זוויות הפה כדי לחשוף את רקמת השריר (איור 2A). לאחר מכן, חתכו את המפרקים של העצם הזיגומטית והלסת התחתונה משני צידי הגולגולת באמצעות מספריים לרקמות (איור 2B), והסירו את הלסת התחתונה (איור 2C).
- חשיפה לחלל האף: הפרידו את עור המקסילה באמצעות המוסאט (איור 2D) כדי לחשוף את חלל האף (איור 2E). חתכו את החיבור הגרמי בין חלל האף למקסילה בעזרת מספריים לרקמה (איור 2F). לאחר מכן, נתקו את החיבור בין חלל האף לעצמות האורביטליות משני הצדדים בפתח האינפרא-אורביטלי (איור 2G) והוציאו את חלל האף (איור 2H).
- קיבוע: מניחים את חלל האף המופק בפרפורמלדהיד 4% לצורך קיבוע ומאחסנים אותו בטמפרטורת החדר למשך 24-72 שעות (ראו טבלת חומרים).
הערה: ודא כי כמות קיבוע paraformaldehyde בשימוש מספיקה כדי לכסות לחלוטין את החלקים עבור קיבוע תקין.
4. עיבוד מראש של דגימות רירית האף
- הסתיידות: התחל על ידי תיקון הרקמות שהוסרו משלב 3.1. שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS במשך 20 דקות כל אחד. לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים במים מזוקקים, בכל פעם למשך 20 דקות. לאחר מכן, decalcize את הרקמות בתמיסת decalcification עם נפח של 20-30 פעמים זה של הרקמות בטמפרטורת החדר.
- פתרון ההסתיידות (ראה טבלת חומרים) אמור לשמור על pH של 7.2-7.4. לבסוף, הניחו את הרקמה המסוידת בקופסת התייבשות.
הערה: יש לשנות את פתרון ביטול ההסתיידות מדי שבוע. תהליך ההסתיידות יכול להסתיים כאשר הרקמה מתרככת (כחודשיים).
- פתרון ההסתיידות (ראה טבלת חומרים) אמור לשמור על pH של 7.2-7.4. לבסוף, הניחו את הרקמה המסוידת בקופסת התייבשות.
- התייבשות ושעווה: מעבירים את קופסת ההתייבשות למייבש (ראו טבלת חומרים). יש להתחיל עם 75% אלכוהול במשך 4 שעות, ולאחר מכן 85% אלכוהול למשך שעתיים, 90% אלכוהול למשך שעתיים ו-95% אלכוהול למשך שעה אחת.
- לאחר מכן, לטבול את הרקמה אתנול נטול מים במשך 30 דקות, לחזור על התהליך עוד 30 דקות, להשתמש xylene במשך 5-10 דקות, לחזור על שלב זה עוד 5-10 דקות, לטבול את הרקמה בשעווה במשך 1 שעות, לחזור על שלב זה במשך שעה נוספת, ולבסוף, לטבול את הרקמה בשעווה במשך 1 שעה נוספת.
- הטבעה: הכניסו את גוש השעווה המומס לקופסת ההטבעה (ראו טבלת חומרים) ואחסנו אותו במקפיא בטמפרטורה של -20°C. לאחר שהשעווה מתמצקת, הסירו אותה וקצצו את גוש השעווה.
- חיתוך: מכניסים את גוש השעווה החתוך למיקרוטום פרפין (ראו טבלת חומרים) וחותכים אותו לפרוסות בעובי של 3 מיקרומטר. הניחו את הפרוסות באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס על מפזר שקופיות. משטחים את הרקמה, ואז מרימים אותה עם מגלשת זכוכית ואופים אותה בתנור של 60 מעלות.
- לאחר שהמים התאדו, והשעווה מוגדרת כראוי, הסר את המגלשות ואחסן אותן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
5. צביעת H&E של רקמת רירית האף
- ניקוי והידרציה: מניחים את הפרוסות בקסילן למשך 20 דקות, חוזרים על התהליך עוד 20 דקות, אתנול מוחלט למשך 5 דקות, חוזרים על שלב זה עוד 5 דקות, 75% אלכוהול למשך 5 דקות, ולבסוף שוטפים במשך 5 דקות.
- צביעת המטוקסילין: יש להוציא 100 μL של תמיסת צביעת המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 3-5 דקות באמצעות פיפטה של 100 μL, לשטוף במשך 5-10 שניות, להוסיף 100 μL של אתנול 0.5% חומצה הידרוכלורית למשך 10-30 שניות, לשטוף במשך 5-10 שניות, להוסיף 100 μL של 0.2% מי אמוניה למשך 10-30 שניות, ולשטוף במשך 30 שניות.
הערה: לאחר צביעת המטוקסילין, יש צורך בהתמיינות עם אתנול חומצה הידרוכלורית 0.5% כדי להסיר צבע המטוקסילין מוגזם הקשור לגרעין ונספג על ידי הציטופלסמה. כאשר מבוצעת צביעת אאוזין, הגרעינים והציטופלסמה יוכתמו בבירור. הפרוסות ייראו אדומות או ורודות לאחר התמיינות עם אתנול חומצה הידרוכלורית 0.5%, לכן יש לשטוף מיד לאחר ההתמיינות כדי להסיר את החומצה מפרוסות הרקמה כדי לעצור את ההתמיינות. לאחר מכן, השתמש במי אמוניה 0.2% כדי לשפר את הצביעה הגרעינית. - צביעת אאוסין: יש להשתמש בפיפטה של 100 μL כדי להוציא 100 μL של תמיסת צביעת אאוזין (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות ולשטוף במשך 30 שניות.
- התייבשות ואיטום: טובלים את הפרוסות באתנול מוחלט למשך 5 דקות, חוזרים על התהליך עוד 5 דקות, חוזרים על הפעולה פעם נוספת במשך 5 דקות, דימתיל למשך 5 דקות וקסילן למשך 5 דקות. לבסוף, יש לאטום עם שרף ניטרלי (ראו טבלת חומרים).
- מיקום החלק המוכתם על המיקרוסקופ: מקמו את החלק המוכתם על המיקרוסקופ, התאימו את מיקוד המיקרוסקופ עד שהתמונה נראית בבירור, כוונו את ההגדלה ל-40x ולוכדים את התמונה.
6. multicolor immunostaining של רקמת רירית האף
- Dewaxing ו הידרציה: בצע את אותו הדבר שהוזכר בשלב 5.1.
- טיפול חיץ ציטראט-פוספט: יש להניח את חיץ הציטראט-פוספט (pH 6.0) (ראה טבלת חומרים) במיכל בטוח לשימוש במיקרוגל. מחממים אותו עד לרתיחה, מסירים אותו ולאחר מכן מוסיפים את השקופיות למיכל. מחממים במיקרוגל על אש בינונית במשך 8 דקות עד לרתיחה, מכבים את האש למשך 8 דקות ולאחר מכן עוברים לאש בינונית-נמוכה למשך 7 דקות.
- לאחר קירור טבעי, מעבירים את הפרוסות ל-PBS (pH 7.4), מנערים ומכבסים אותן שלוש פעמים באמצעות שייקר להסרת צבע, בכל פעם למשך 5 דקות.
הערה: ודאו שהמאגר אינו מתאדה בתהליך זה, ומנעו מהפרוסות להתייבש.
- לאחר קירור טבעי, מעבירים את הפרוסות ל-PBS (pH 7.4), מנערים ומכבסים אותן שלוש פעמים באמצעות שייקר להסרת צבע, בכל פעם למשך 5 דקות.
- חסימת פרוקסידז אנדוגני: יבשו את הפרוסות, ציירו עיגול סביב הרקמה בעזרת עט אימונוהיסטוכימי (כדי למנוע מהנוגדן לזרום משם), ומרחו תמיסת מי חמצן 3% (מי חמצן: מים טהורים = 1:9).
- דוגרים בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות. לאחר קירור טבעי, מניחים את הפרוסות ב-PBS (pH 7.4) ומנערים אותן בשייקר להסרת צבע במשך שלושה מחזורים של 5 דקות כל אחד.
- חסימה: יש למרוח סרום עיזים 5% בתוך העיגול ולדגור במשך 30 דקות.
- הוספת נוגדנים ראשונית: הסירו בעדינות את התמיסה החוסמת, הוסיפו FOXP3 (דילול: 1:200, ראו טבלת חומרים) לפרוסה והניחו אותה בתא לח. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: יש להוסיף כמות קטנה של מים לתא הלח כדי למנוע אידוי נוגדנים. - הוספת נוגדנים משנית: מניחים את הפרוסות ב-PBS (pH 7.4) ומנערים אותן על שייקר מסיר צבע במשך שלושה מחזורים של 5 דקות כל אחד. מייבשים בעדינות את הפרוסות ומורחים את הנוגדן המשני (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, ראו טבלת חומרים) בתוך העיגול. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 50 דקות בחושך.
- הכנת תמיסת דילול טירמיד: לשלב 100 μL של 3% H 2 O2עם 100 מ"ל של 1x TBST (ראה טבלת חומרים).
- תוספת של פתרון עבודה TSA: מערבבים 1 מ"ל של מדלל טירמיד עם 2 μL של CY3-Tyramide להכנת פתרון עבודה TSA. יש למרוח 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה TSA על כל פרוסה ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הפרוסות עם PBS שלוש פעמים, 5 דקות בכל פעם.
הערה: הכן את פתרון העבודה TSA והשתמש בו באופן מיידי, ואחסן אותו ב- 4 ° C בחושך; הוא תקף עד 24 שעות. - חזור על שלבים 6.2-6.8: עבור לדילול 1:200 של RORγt (צבע פלואורסצנטי FITC) ולאחר מכן לדילול 1:200 של TICAM1 (צבע TYP620) (ראה טבלת חומרים).
- גרעינים מוכתמים נגד DAPI: נערו את הפרוסות בעדינות כדי לייבש אותן, מרחו תמיסת צביעה של DAPI ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
- מרווה אוטופלואורסצנטית: מניחים את הפרוסות ב-PBS (pH 7.4) ומנערים אותן על שייקר מסיר צבע במשך שלושה מחזורים של 5 דקות כל אחד. מרחו את מרווה הפלואורסצנטיות האוטומטית (ראו טבלת חומרים) על הפרוסות, המתינו 5 דקות ולאחר מכן שטפו במשך 10 דקות.
- חסימה: מניחים את הפרוסות ב-PBS (pH 7.4) ומנערים אותן על שייקר מסיר צבע במשך שלושה מחזורים של 5 דקות כל אחד. נערו בעדינות את הפרוסות כדי לייבש אותן ואטמו אותן במרווה נגד פלואורסצנטיות (ראו טבלת חומרים).
- מיקרוסקופיה: הניחו את החלק המוכתם על המיקרוסקופ, התאימו את מוקד המיקרוסקופ לראות ברורה, כוונו את ההגדלה ל-20x ו-40x וללכוד את התמונה.
הערה: DAPI יש אורך גל עירור UV של 330-380 ננומטר ואורך גל פליטה של 420 ננומטר (אור כחול). ל-FITC יש אורך גל עירור של 465-495 ננומטר ואורך גל פליטה של 515-555 ננומטר (אור ירוק). ל-CY3 יש אורך גל עירור של 510-560 ננומטר ואורך גל פליטה של 590 ננומטר (אור אדום). ל-TYP-690 יש אורך גל עירור של 630 ננומטר ואורך גל פליטה של 690 ננומטר (אור ורוד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שש חולדות SD הושרו בהצלחה למודל AR באמצעות הזרקה תוך-צפקית של OVA ואתגר האף. AR הושרה בכל החולדות בקבוצת AR, והיוותה 100% מהקבוצה. כל החולדות בקבוצת AR הציגו תסמינים אופייניים כגון התעטשות, נזלת ואף מגרד. כל התצפיות ההתנהגותיות קיבלו ציון ≥5 נקודות (טבלה 2).
תוצאות צביעת H&E ביוםה-21 למידול גילו כי בחולדות הביקורת, תאי האפיתל והריסונים של רירית האף היו מסודרים היטב, ללא סימנים לחדירת תאי דלקת. לעומת זאת, בקבוצת המציאות הרבודה, רירית מחיצת האף נפגעה והתנתקה, עם חדירת נויטרופילים בולטת (איור 3).
כאשר השווינו את רקמת רירית האף של חולדות AR עם קבוצת הביקורת, נצפה כי הביטוי של RORγt (גורם שעתוק ספציפי לתא Th17) ו-TICAM-1 (מולקולת קישור קולטן דמוי טול-1) גדל, בעוד ש-Foxp3 (גורם שעתוק ספציפי לתא Treg) ירד (איור 4).
איור 1: זרימת העבודה הניסויית . (A) תרשים סכמטי של הזרקה תוך צפקית. (B) תרשים סכמטי של טפטוף האף. (C) תרשים זרימה של מידול חולדות נזלת אלרגיות. (D) תרשים סכמטי של תצפית התנהגותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך הסרת האף . (A) חיתוך רקמת השריר בזוויות הפה. (B) חיתוך החיבור בין עצם הלחי ללסת התחתונה. (ג) הפרדת הלסת התחתונה. (D) הסרת העור של המקסילה. (ה) חשיפת חלל האף. (F) חיתוך החיבור בין חלל האף למקסילה. (G) חיתוך החיבור בין חלל האף לעצם המסלולית. (H) חלל האף שהוסר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות היסטופתולוגיות מייצגות של צביעת H&E ביום ה-14 לאחר מידול AR (n = 6). (A) תאי האפיתל והריסונים ברירית האף של חולדות הביקורת היו מסודרים היטב, ולא נצפתה חדירת תאי דלקת. (B) רירית מחיצת האף של קבוצת AR נפגעה והתנתקה מחדירת נויטרופילים. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח צביעת MIF של RORγt, Foxp3 ו-TICAM-1 (n = 6). בהשוואה לקבוצת הביקורת, הביטוי של RORγt ו-TICAM-1 ברקמות רירית האף של חולדות בקבוצת AR היה גבוה, בעוד שהביטוי של Foxp3 ירד. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (לוחות שמאליים); 50 מיקרומטר (פאנלים ימניים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: עקרון טכניקת mIF. טכניקת mIF מבוססת על טכניקת TSA, הכוללת קשירה קוולנטית של האות הפלואורסצנטי לאנטיגן. בתהליך זה, חזרת peroxidase מסומן על הנוגדן המשני מזרז את המעבר של מצע fluorescein ממצב לא פעיל למצב פעיל. מצב מופעל זה יכול להיקשר באופן קוולנטי לטירוזין על האנטיגן, וכתוצאה מכך חיבור קוולנטי יציב של פלואורסצאין לדגימה. לאחר מכן, נוגדנים שאינם קשורים קוולנטית מוסרים באמצעות תיקון תרמי. לאחר מכן חוזרים על התהליך עם נוגדנים ראשוניים נוספים, נוגדנים משניים ופלואורסצאין כדי לאפשר זיהוי של אנטיגן שונה לחלוטין. תמונה זו צוירה מחדש והותאמה בצבע תוך התייחסות לתרשים הסכמטי mIF17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ציונים | תדירות התעטשות | קרנף | שפשוף האף |
| 1 | <3 | הפרשה מימית בתוך חלל האף | שפשופים קלים ומזדמנים באף |
| 2 | 4~10 | הפרשות מימיות הנשפכות מהנריס הקדמי | שפשופים חוזרים ונשנים באף |
| 3 | ≥11 | הפנים מכוסות בהפרשות מימיות בשפע | שפשוף מהאף לפנים |
טבלה 1: טבלת סולם כמותי של מבחן התנהגות חולדות.
| אינדיווידואלים | יום 1 | יום 21 |
| שליטה 1 | 0 | 0 |
| שליטה 2 | 0 | 0 |
| שליטה 3 | 0 | 0 |
| שליטה 4 | 0 | 0 |
| שליטה 5 | 0 | 0 |
| שליטה 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
טבלה 2: תוצאות הניקוד ההתנהגותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית לא זיהומית של רירית האף הנובעת משילוב של גורמים סביבתיים וגנטיים. היא הפכה לדאגה בריאותית עולמית, משפיעה על יעילות העבודה, פוגעת באיכות החיים, פוגעת בשינה, בתפקוד הקוגניטיבי וגורמת לעצבנות ועייפות. מציאות רבודה משפיעה על 10%-20% מאוכלוסיית העולם¹ ונושאת עלויות כלכליות משמעותיות, וגורמת להפסדים שנתיים של עד 30-50 מיליארד יורו במדינות האיחוד האירופי18. יתר על כן, מספר מחקרים ביססו קשר חזק בין AR לאסתמה18,19,20, כאשר אנשים שיש להם AR נמצאים בסיכון גבוה פי שבעה לפתח אסתמה מאשר אלה ללא AR 21. מחקרים עכשוויים מצביעים על כך שחוסר איזון בין תאי T מסייעים מסוג 1 (Th1) לבין תאי T מסייעים מסוג 2 (Th2) עם הטיה כלפי תאי Th2 הוא תורם משמעותי למציאות רבודה. תאי Th2, המעוררים על-ידי אינטרלוקין-4, מייצרים ציטוקינים דמויי Th2 כגון IL-5 ו-IL-13, ומעוררים דלקת בלימפוציטים מסוג B, תאי פיטום, אאוזינופילים ותאים דנדריטיים22. יתר על כן, מחקרי AR עדכניים מצביעים על קשר חזק בין חוסר איזון באוכלוסיית תאי T מסייעים Th17/רגולטוריים (Treg)23. תאי Th17 ו-Treg, שניהם מופקים מתאי T מסוג CD4+, ממלאים תפקידים קריטיים במערכת החיסון. RORγt חיוני להתמיינות תאי Th1724, בעוד שתאי Treg, עם פונקציות מדכאות חיסון, הם המפתח לשמירה על סבילות חיסונית. שינויים בביטוי Foxp3 משפיעים על תפקוד תא Treg25,26. לפיכך, שינויים ברמות RORγt ו-Foxp3 משקפים חוסר איזון של Th17/Treg, מה שעלול לגרום לתגובה דלקתית המונעת בעיקר על ידי תאי Th1727. קולטנים דמויי אגרה (TLR) הם חלבונים חיוניים במערכת החיסון המולדת של הגוף, המתווכים מסלולי איתות תוך-תאיים להפעלת ביטוי גנים ספציפי28. מחקר שנערך על ידי He Shan et al.29 מצא כי וריאציות בגן TLR4, במיוחד CT הטרוזיגוטי ומוטציות טהורות TT בלוקוס rs10759930, היו קשורות להתפתחות AR. בהתחשב בתפקידו של TICAM-1 כמולקולת הגישור בין TLR3 ו-TLR4, הועלתה השערה כי AR עשוי להיות קשור ל-TICAM-1. ואכן, התוצאות הראו ביטוי מוגבר של TICAM-1 בקבוצת AR, בהתאם למחקר30 של Xu et al.
טכניקת mIF (Multiplex immunofluorescence) המשמשת במחקר זה היא שיטת זיהוי חדשה יחסית שפותחה במהלך 20 השנים האחרונות. הוא מציע מספר יתרונות על פני טכניקות אימונופלואורסצנטיות קונבנציונליות (IF), כולל ספציפיות מוגברת, רגישות ותפוקה, יחד עם היכולת לניתוח חזותי. טכניקה זו מבוססת על שיטת TSA (Tyramide Signal Amplification), הקושרת באופן קוולנטי אותות פלואורסצנטיים לאנטיגנים ואינה מושפעת מחימום מיקרוגל. זה מאפשר תיוג צבעוני של רקמות באמצעות מחזורים חוזרים ונשנים של צביעה פלואורסצנטית TSA, ולאחר מכן חימום במיקרוגל כדי להסיר נוגדנים תוך שמירה על האות הפלואורסצנטי 17,31,32 (איור 5). לאחר מכן מיושמים אלגוריתמים מתקדמים לזיהוי ופילוח אוטומטיים של אזורי רקמת מטרה המציגים מבנים ספציפיים בתמונות מרובות תוויות. הדבר מאפשר ניתוח סטטיסטי כמותי של אזורי עניין, ומאפשר הערכה כמותית של פנוטיפים חיסוניים תאיים ולוקליזציה תפקודית של תאי מערכת החיסון. הוא גם מספק מידע על הקשר רקמות ופיזור מרחבי33,34.
עם זאת, מבחינה טכנית, mIF עדיין מסתמך על טכניקות IF מסורתיות ומתמודד עם אתגרים כגון תגובתיות צולבת נוגדנים ודיבור צולב אופטי. השימוש בנוגדנים מרובים יכול להוביל לתגובתיות צולבת ולתוצאות חיוביות כוזבות, בעוד שספקטרום פלואורסצנטי חופף עלול לגרום למיזוג אותות פלואורסצנטיים ממטרות מרובות, מה שהופך את הבידול בעין בלתי למאתגר ומגביר את ההסתמכות על אלגוריתמים מיוחדים לניתוח תמונה35. יתר על כן, מכיוון שצבעים פלואורסצנטיים משמשים לסימון נוגדנים, mIF יכול להיות מושפע מרוויה והלבנה פלואורסצנטית, מה שמוביל לירידה בעוצמת האות. יש לציין כי בעוד טכניקות IF קונבנציונליות מעריכות את הרקמה כולה, טכניקות mIF מתמקדות באזורים ספציפיים של עניין בתוך החלק הרקמתי לניתוח. זה עלול לגרום לסטיות מהמציאות עקב הטרוגניות רקמות, מה שעלול לגרום לכימות היסטולוגי לא מדויק או להשמטת אירועים נדירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
